王 琳,閆海峰,高 寧,韓宜曉,王 帥,張澤宇,賈壯壯,李明偉,毛靜遠

(1. 天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院/國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心,天津 300381;2. 天津中醫(yī)藥大學,天津 301617;3. 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000)

肺動脈高壓是一種以血管阻力持續(xù)性升高和血管收縮重塑為特征的進展性疾病,最終導致右心衰竭甚至死亡［1-2］。研究顯示,氧化應激與肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展密切相關,超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶和活性氧簇(ROS)參與其中,SOD抑制作用減弱及ROS產生和消除失衡可對組織和細胞直接造成氧化損傷,啟動氧化還原信號途徑,促進肺動脈平滑肌增殖,導致肺血管重塑［3-6］。因此,干預抗氧化酶活性及氧化產物水平可能成為治療肺動脈高壓的有效路徑。丹參是唇形科植物Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根及根莖,具有活血通經、祛瘀止痛等功效,廣泛用于心血管疾病的治療。相關研究表明,丹參能夠有效抑制肺小血管的增生與重塑［7-9］,抵抗去甲腎上腺素引起的肺血管收縮［10-12］,但其作用機制尚不明確。本研究擬從氧化應激角度探討丹參治療肺動脈高壓可能的作用機制,以期為肺動脈高壓的中醫(yī)藥治療提供借鑒。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 24只健康清潔級雄性SD大鼠,體重230～250 g,購于北京斯貝福生物技術有限公司,許可證編號:SCXK(京)2019-0010,飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所動物中心,環(huán)境溫度20～24 ℃,相對濕度40%～70%,12 h/12 h晝夜光照。適應性飼養(yǎng)7 d后開始實驗。

1.2主要藥物與試劑 丹參飲片由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房煎煮濃縮,低劑量含生藥0.585 g/mL,高劑量含生藥1.17 g/mL;野百合堿(Med Chem Express公司),規(guī)格:5 g,批號:45254;叔戊醇(上海麥克林生化科技有限公司),規(guī)格:100 mL,批號:C10187107;三溴乙醇(Sigma公司),批號:MKCM1060;肝素生理鹽水(1∶500);無水乙醇(天津渤化化學試劑有限公司),規(guī)格:500 mL,批號:190909。

1.3主要器械及儀器 Power Lab 8/35多導生理儀及其配套壓力換能器(埃德儀器國際貿易有限公司),TAT FAX2100全自動酶標儀(德國Thermo Scientific),數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(上海躍進醫(yī)療器械有限公司),精密電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司),超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司),PE50導管(外徑0.9 mm,內徑0.5 mm)。

1.4實驗方法 隨機選取6只大鼠作為對照組,單次腹腔注射空白溶劑0.3 mL/100 g(無水乙醇∶生理鹽水=2∶8);其余大鼠均單次腹腔注射野百合堿60 mg/kg(0.3 mL/100 g,濃度為2%)誘導14 d制備肺動脈高壓模型,將造模成功的大鼠隨機分為模型組、丹參低劑量組、丹參高劑量組,每組6只。對照組及模型組給予空白溶劑蒸餾水1 mL/100 g灌胃,丹參低、高劑量組分別給予0.585 g/mL、1.17 g/mL丹參溶液1 mL/100 g灌胃,均每日1次,灌胃14 d,各組大鼠隔日稱1次體重,根據(jù)體重變化調整給藥量。

1.5檢測指標及方法

1.5.1血流動力學和右心室肥厚指數(shù)(RVHI) 灌胃14 d后,按照大鼠體重比例用1.5%的三溴乙醇(0.8 mL/100 g)腹腔麻醉,仰臥位固定大鼠,分離右頸外靜脈,遠心端用細棉線結扎,近心端打松結備用。用眼科剪朝心室方向剪一長度2～3 mm的V形切口,將自制90°彎曲的1 mL注射器針頭插入靜脈,在其引導下插入導管,同時扎緊近心端棉線,以防出血。打開電腦記錄軟件,輕輕旋轉推進導管,根據(jù)波形變化判斷導管所達具體位置,記錄右心室收縮壓(RVSP)、平均肺動脈壓(mPAP)及肺動脈波形。檢測完畢后,剖開大鼠腹腔,腹主動脈取血。并用50 mL注射器吸取預冷的生理鹽水,開胸后從下腔靜脈緩推以沖洗干凈心肺中的血液,快速剪取心肺,并沿室間隔分離左右心室,稱重以計算RVHI,RVHI=右室重量/左室及室間隔重量。

1.5.2肺組織HE染色病理形態(tài) 取左肺中上葉,用生理鹽水漂洗,固定于4%的多聚甲醛中72 h,將標本沿肺門橫切(4 μm),經脫水、透明、浸蠟、包埋、蘇木精-伊紅染色,封片,光鏡下觀察肺血管病理形態(tài)。每張切片選擇100～200 μm肺小動脈,使用Image J軟件測其內徑、外徑、管腔面積、血管總面積,計算血管壁厚度系數(shù)［(血管外徑-管腔內徑)×0.5/血管外徑］和血管壁面積系數(shù)［(血管總面積-管腔面積)/血管總面積］,以評估肺小動脈中膜增厚程度和肺小動脈肌化程度。

1.5.3血清SOD及ROS含量 將大鼠血液室溫下靜置30 min,3 500 r/min離心15 min,取上層血清,依次放入標記好的EP管中,于-80 ℃保存?zhèn)溆?。之后嚴格按照ELISA試劑盒說明書,測定SOD及ROS含量。

2 結 果

2.1各組大鼠RVSP、mPAP及RVHI比較 模型組大鼠RVSP、mPAP及RVHI均明顯高于對照組(P均<0.05);丹參低、高劑量組大鼠RVSP、mPAP及RVHI均明顯低于模型組(P均<0.05),丹參低、高劑量組間RVSP、mPAP及RVHI比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 對照組和肺動脈高壓各組大鼠RVSP、mPAP、RVHI比較

2.2各組大鼠肺組織病理形態(tài) 光鏡下觀察,對照組大鼠肺血管管壁結構清晰,排列整齊,厚度正常;模型組大鼠肺小動脈內膜破壞,血管壁呈不規(guī)則增厚,管腔有效面積明顯減小,肺小動脈血管壁厚度系數(shù)和面積系數(shù)均明顯高于對照組(P均<0.05);與模型組比較,丹參低、高劑量組大鼠肺形態(tài)學變化明顯減輕,肺小動脈血管壁厚度系數(shù)和面積系數(shù)均明顯低于模型組(P均<0.05),丹參低、高劑量組間肺小動脈血管壁厚度系數(shù)和面積系數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖1及表2。

圖1 對照組和肺動脈高壓各組大鼠肺組織病理形態(tài)學表現(xiàn)(HE染色)

表2 對照組和肺動脈高壓各組大鼠肺小動脈血管壁厚度系數(shù)和面積系數(shù)比較

2.3各組大鼠血清SOD及ROS含量比較 與對照組比較,模型組血清 SOD含量明顯降低(P<0.05),血清ROS含量明顯升高(P<0.05);與模型組比較,丹參低、高劑量組血清SOD含量均明顯升高(P均<0.05),血清ROS含量均明顯降低(P均<0.05),丹參低、高劑量組間血清SOD及ROS含量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 對照組和肺動脈高壓各組大鼠血清SOD、ROS含量比較

3 討 論

肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展涉及多種因素,如缺氧、炎癥、氧化應激、內皮功能障礙［13-15］等。肺血管重構是肺動脈高壓的基本病理特征,表現(xiàn)為血管平滑肌細胞增殖肥大、內皮細胞功能紊亂和細胞外基質沉積,而氧化應激參與了這種病理形態(tài)的改變。ROS是體內一類氧的電子還原產物,包括過氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)等,主要由線粒體產生,生理狀態(tài)下參與細胞內的應激反應,激活轉錄因子,調節(jié)細胞增殖和凋亡［16］。當多種因素導致肺動脈壓力升高,血流動力學改變時,細胞內氧化還原穩(wěn)態(tài)遭到破壞,ROS產生過多,過量累積的ROS會對細胞造成毒性傷害,引起脂質和蛋白質過氧化,導致細胞膜通透性增加,細胞內離子平衡紊亂,進而損傷細胞功能［17］。同時,ROS能引起NO生成減少,ET-1分泌增加,導致肺血管持續(xù)收縮,并激活核因子κB(NF-κB)及促細胞分裂原活化蛋白激酶(MAP kinase)家族,促進細胞增殖,導致肺血管平滑肌細胞肥大,發(fā)生肺血管重構［18-21］。而SOD作為氧自由基清道夫,能夠催化O2-發(fā)生歧化反應,對抗和阻斷O2-對細胞造成的損害,并及時修復受損細胞,恢復氧化/抗氧化系統(tǒng)平衡。

目前臨床用于治療肺動脈高壓藥物的作用途徑包括前列環(huán)素途徑、一氧化氮途徑、內皮素-1(ET-1)途徑,但費用昂貴,遠期臨床效果仍不樂觀。相關研究證實,丹參可有效抑制多種肺動脈高壓大鼠模型肺小血管的增生與重塑［22］;丹參及其化合物可以通過抑制蛋白激酶B(Akt)磷酸化、減少NF-κB和轉錄因子AP-1與DNA的結合、降低細胞內鈣離子濃度以及增加電壓門控性鉀通道亞型Kv2.1、Kv1.5的表達等多種機制發(fā)揮作用［23-25］,但其具體機制仍需要進一步探究。

本實驗結果顯示,丹參干預后,肺動脈高壓大鼠RVSP、mPAP、RVHI及血清ROS含量降低,血清SOD含量升高,肺小血管增生與重塑明顯改善。提示丹參改善肺動脈高壓的作用機制可能與減輕肺組織氧化應激損傷、調節(jié)氧化/抗氧化系統(tǒng)平衡有關,為深入探究丹參治療肺動脈高壓提供了新思路。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。