龍芳敏,呂 梁

(1. 昆明理工大學附屬醫(yī)院(云南省第一人民醫(yī)院),云南 昆明 650032;2. 右江民族醫(yī)學院基礎醫(yī)學院,廣西 百色 533000)

隨著醫(yī)學技術的發(fā)展,碘對比劑廣泛用于放射診斷和介入治療,如今碘對比劑成為急性腎損傷(AKI)的第三誘因［1］。據(jù)報道,無危險因素的患者,對比劑所致急性腎損傷(contrast-induced acute kidney injury,CI-AKI)發(fā)生率約為2%,輕度至中度腎功能不全和糖尿病患者的發(fā)生率為9%～50%,每年15萬CI-AKI患者中的1%需透析和長期住院,透析費約3 200萬美元［2］。目前CI-AKI發(fā)生機制尚未明確,也無此病防治的理想藥物,因此針對CI-AKI防治藥物的研究仍具有重要的臨床價值及必要性［3-5］。三七皂苷R1來源于三七的特征皂苷,其可通過PI3K/Akt、TGF-β/Smads等途徑抑制細胞凋亡來發(fā)揮心腦血管保護作用［6-8］,而它對CI-AKI的影響鮮有報道。另外含螯合劑或非螯合劑的碘對比劑均可導致CI-AKI的發(fā)生,但由于螯合劑具有腎毒性,因此大多只研究含螯合劑的碘對比劑如碘海醇等誘導的CI-AKI,而基于非螯合劑碘對比劑誘導腎小管上皮細胞損傷的相關參數(shù)及其誘導CI-AKI的防治報道少見［9-10］。因此,本研究采用目前臨床中唯一不含螯合劑的碘美普爾400來誘導NRK-52E細胞損傷,觀察三七皂苷R1對該損傷的影響,探討核因子紅細胞2相關因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)/血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)途徑與CI-AKI的調控關系,為進一步開發(fā)中草藥三七奠定基礎,也為中藥對分子靶向防治非螯合劑碘對比劑引起的CI-AKI提供新思路。

1 實驗材料與方法

1.1細胞株 NRK-52E細胞,賽百慷(上海)生物技術股份有限公司。

1.2實驗藥物、試劑 三七皂苷R1(純度≥98%,B21099),上海源葉生物有限責任公司;碘美普爾400注射液(MP8352R),上海博萊科信誼藥業(yè)有限公司;胎牛血清,BI公司;DMEM高糖培養(yǎng)基,Gibco公司;大鼠表皮生長因子(EGF,80446-RNAE),Sino Biological公司;CCK-8試劑盒(GX805),日本同仁化學研究所;乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒,南京建成生物研究所;丙二醛(MDA)試劑盒,北京索萊寶生物科技公司;活性氧(ROS)試劑盒(S0033S),Beyotime公司;白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及HO-1 ELISA試劑盒,江蘇菲亞/酶免實業(yè)有限公司;AnnexinV- FITC/PI試劑(KGA107),Keygen公司;Nrf2抗體(AF0639),affinity公司;鋅原卟啉,MCE公司(49938);Nrf2、HO-1及內參β-actin引物,擎科生物科技公司;總RNA提取試劑盒(R6834-01),Omega Bio-Tek公司;QPCR試劑盒(KK4602),KAPA公司;反轉錄試劑盒(K1622),Invitrogen公司。

1.3主要儀器 BDS200倒置顯微鏡(南北儀器),3111型恒溫培養(yǎng)箱(Thermo),Synergy H1全功能酶標儀(美國BioTeK),LightCycler 480實時熒光定量PCR儀(美國Roche),流式細胞儀(美國 BD FACSCelesta TM),NanoDrop2000 超微量分光光度計(Thermo)。

1.4實驗方法

1.4.1細胞培養(yǎng)與分組 在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、10 ng/mL EGF的DMEM培養(yǎng)基,37 ℃和5%CO2的條件下培養(yǎng)NRK-52E細胞,待細胞融合度達80%時進行消化、傳代培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。實驗分為5組:正常對照組不加任何藥,正常培養(yǎng)細胞;三七皂苷組加入三七皂苷R1培養(yǎng)細胞24 h;碘美普爾組加入碘美普爾400處理細胞5 h;三七皂苷+碘美普爾組先加入三七皂苷R1培養(yǎng)24 h,再用碘美普爾400處理細胞5 h;鋅原卟啉組采用鋅原卟啉與三七皂苷R1共培養(yǎng)24 h后,加入碘美普爾400處理細胞5 h。

1.4.2CCK-8法細胞活力檢測 取對數(shù)生長期的NRK-52E細胞,以4×103個/孔接種96孔板,鋪板過夜,6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L 的三七皂苷R1預處理NRK-52E細胞24 h,50 mgI/mL、100 mgI/mL、150 mgI/mL、200 mgI/mL、250 mgI/mL 碘美普爾400作用NRK-52E細胞5 h,去上清液,再加含10% CCK-8的培養(yǎng)液,以CCK-8工作液為陰性對照組,37 ℃孵育100 min,酶標儀450 nm波長讀取吸光度(OD)值,取各組OD均值,NRK-52E細胞存活率=(OD實驗-OD陰性對照)/(OD對照-OD陰性對照)×100%。根據(jù)細胞存活率,篩選三七皂苷R1和 碘美普爾400的最佳作用濃度。

1.4.3LDH法細胞損傷程度檢測 待各組(除鋅原卟啉組外)加藥處理后,取上清液,按說明書操作,450 nm酶標儀讀數(shù)。NRK-52E細胞LDH釋放量(IU/L)=(OD測定-OD陰性對照)/(OD標準-OD陰性對照)×標準品濃度(0.2 mol/mL)×1 000。

1.4.4劃痕實驗細胞愈合率檢測 待正常對照組、碘美普爾組、三七皂苷+碘美普爾組加藥處理后,用10 μL移液器槍頭垂直劃痕,PBS洗去懸浮的細胞,各組加入含2%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。使用倒置顯微鏡采集劃痕0 h、48 h的圖片,用Image J軟件處理分析,記錄各組的平均寬度H0、H1,細胞愈合率(%)= (H0-H1)/H0×100%。

1.4.5氧化應激指標含量檢測 ①各組(除鋅原卟啉組外)加藥處理后,取上清液,按照操作說明書,采用 WST-1法檢測SOD含量,采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。②各組(除鋅原卟啉組外)加藥處理后,棄上清,無血清培養(yǎng)基洗1次,計數(shù)取(1～2)×106/mL細胞,再用配制的DCFH-DA(10 μmol/L)重懸,孵育25 min,PBS洗3～4次,離心后PBS重懸待測,研究中設陽性對照組,熒光酶標儀檢測,激發(fā)波488 nm、發(fā)射波525 nm,以熒光強度表示ROS含量。

1.4.6炎癥因子含量檢測 按2×105個/孔的細胞量接種6孔板,各組(除鋅原卟啉組外)加藥處理完,收集上清液,參照試劑盒說明書以ELISA法檢測IL-6、TNF-α含量。

1.4.7流式細胞術細胞凋亡檢測 按2×105個/孔的細胞量接種6孔板,正常對照組、碘美普爾組、三七皂苷+碘美普爾組按前述加藥處理,非EDTA的胰酶消化,1 000 r/min離心4 min,重懸,計數(shù)取8×104細胞懸液,離心,PBS洗滌細胞1次(避免殘留的培養(yǎng)基影響結果);根據(jù)Annexin V-FITC/PI試劑說明書操作,最后用流式細胞儀檢測。

1.4.8Nrf2、HO-1 mRNA表達量檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測:各組藥物處理后棄上清,提取細胞總RNA,反轉錄成cDNA,qRT-PCR反應的具體操作按試劑說明書進行,用2-△△Ct法計算Nrf2、HO-1 mRNA相對表達量。Nrf2 上游引物序列為5’-GCCCTCAGCATGATGGACTTG-3’,下游引物序列為5’-TGGAGTTGCTCTTGTCTCCTCC-3’;HO-1上游引物序列為5’-AAGAGGCTAAGACCGCCTTC-3’,下游引物序列為5’-CCTCTGGCGAAGAAACTCTGT-3’;β-actin上游引物序列為5’-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3’,下游引物序列為5’-ATGCCACAGGATTCCATACC-3’。

1.4.9HO-1蛋白含量與Nrf2蛋白表達檢測 ①各組加藥處理后取上清液,采用ELISA法檢測HO-1蛋白含量。②各組(除鋅原卟啉組外,設不加Nrf2抗體陰性對照組)加藥處理后棄上清,PBS洗3遍,加入4%多聚甲醛固定20 min。然后加入0.125% Triton X-100的PBS透膜10 min,200 μL封閉液室溫封閉1 h后,加Nrf2抗體,4 ℃過夜孵育,PBS洗3次,加熒光二抗,室溫避光孵育2 h,滴加DAPI染色液,染色5 min后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察并記錄Nrf2蛋白表達情況,Image-Pro Plus 6.0處理分析圖片。

1.5統(tǒng)計學方法 所有實驗獨立重復次數(shù)≥3次(3復孔/次),采用GraphPad Prism 5.0軟件統(tǒng)計分析符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù),組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Dunnett、Bonferroni或Student-Newman-Keuls檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1各組細胞活力比較 與陰性對照組比較,不同濃度碘美普爾400組細胞存活率隨碘美普爾400梯度濃度上調而下降,200 mgI/mL碘美普爾400處理細胞存活率約50%;不同濃度三七皂苷R1培養(yǎng)24 h后,25 μmol/L以下三七皂苷R1對細胞影響很小,而50 μmol/L時對細胞存活率影響較大。與單純200 mgI/mL碘美普爾400處理細胞比較,加入不同濃度三七皂苷R1后細胞存活率均明顯提高,25 μmol/L以下的三七皂苷R1對200 mgI/mL碘美普爾400所致NRK-52E細胞生長活力影響呈正相關,其中25 μmol/L 三七皂苷R1對碘美普爾400的預處理效果較優(yōu),而50 μmol/L 三七皂苷R1的效果則下降。綜上,200 mgI/mL碘美普爾400培養(yǎng)5 h作為造模條件,25 μmol/L 三七皂苷R1預處理24 h作為最優(yōu)三七皂苷R1用藥條件。見圖1。

圖1 不同干預條件下NRK-52E細胞活力

2.2各組細胞損傷程度比較 三七皂苷組LDH釋放量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),碘美普爾組LDH釋放量明顯高于正常對照組和三七皂苷+碘美普爾組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 各組NRK-52E細胞LDH釋放量

2.3各組細胞愈合情況比較 碘美普爾組細胞愈合率明顯低于正常對照組(P<0.05), 三七皂苷+碘美普爾組細胞愈合率明顯高于碘美普爾組(P<0.05)。 見圖3。

圖3 各組NRK-52E細胞劃痕實驗細胞愈合情況

2.4各組細胞中氧化應激指標含量比較 三七皂苷組ROS、MDA、SOD含量與正常對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05) ;碘美普爾組ROS、MDA含量明顯高于正常對照組(P均<0.05),SOD含量明顯低于正常對照組(P<0.05);三七皂苷+碘美普爾組ROS、MDA含量明顯低于碘美普爾組(P均<0.05),SOD含量明顯明顯高于碘美普爾組(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組NRK-52E細胞中ROS、MDA、SOD含量

2.5各組細胞中炎癥因子含量比較 三七皂苷組IL-6、TNF-α含量與正常對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05) ;碘美普爾組IL-6、TNF-α含量均明顯高于正常對照組(P均<0.05),三七皂苷+碘美普爾組IL-6、TNF-α含量均明顯低于碘美普爾組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 各組NRK-52E細胞中IL-6、TNF-α含量

2.6各組細胞凋亡率比較 碘美普爾組細胞凋亡率明顯高于正常對照組(P<0.05),三七皂苷+碘美普爾組細胞凋亡率明顯低于碘美普爾組(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組NRK-52E細胞凋亡率

2.7各組細胞中Nrf2、HO-1 mRNA表達量與蛋白表達情況比較 碘美普爾組Nrf2和HO-1 mRNA相對表達量、HO-1蛋白含量、Nrf2免疫熒光強度均明顯低于正常對照組(P均<0.05),三七皂苷+碘美普爾組Nrf2和HO-1 mRNA相對表達量、HO-1蛋白含量、Nrf2免疫熒光強度均明顯高于碘美普爾組(P均<0.05);鋅原卟啉組Nrf2和HO-1 mRNA相對表達量、HO-1蛋白含量均明顯低于三七皂苷+碘美普爾組(P均<0.05)。見圖7。

圖7 各組NRK-52E細胞中Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表達情況

3 討 論

CI-AKI的發(fā)生與氧化應激失衡調控有密切聯(lián)系。碘對比劑的滲透壓及其直接的細胞毒性可致細胞缺氧、胞內ROS蓄積,致使氧化應激失衡［2］。外源性毒物或病理狀態(tài)下,ROS過量可阻滯細胞周期,ROS響應細胞氧化應激,啟動相關信號傳導,推動細胞死亡機制的發(fā)展［11］。而SOD可清除自由基,保護細胞的重要成分,如脂質(磷脂)、DNA等［11］。本研究中,三七皂苷R1預處理使碘美普爾400所致NRK-52E細胞的SOD含量、細胞活力和細胞愈合率明顯增高,LDH釋放量及ROS、MDA表達明顯較少,提示三七皂苷R1預處理可增強細胞抗氧化能力,減輕由碘美普爾400誘發(fā)ROS累積引起的脂質過氧化損傷,改善細胞的結構和功能,減輕細胞膜被碘美普爾400破壞的程度,從而限制由氧化應激觸發(fā)級聯(lián)通路導致的細胞死亡,提高細胞整體生存率。ROS介導細胞信號轉導,誘發(fā)炎癥反應［12］。炎癥反應參與調控AKI期間腎臟細胞損傷和修復的病理生理過程,其中IL-6和TNF-α介導多類型AKI涉及的炎癥免疫應答［13-14］。相關研究表明,調控炎性小體,限制TNF-α和IL-6等因子分泌,可減緩膿毒癥AKI損傷［14］。本研究中,三七皂苷R1明顯降低了碘美普爾400誘導的IL-6和TNF-α表達,說明三七皂苷R1通過增強NRK-52E細胞的抗氧化能力,及時限制過量ROS觸發(fā)細胞炎癥信號的傳遞,從而減緩細胞炎癥的發(fā)展。

氧化自由基應激是凋亡的有效誘因,AKI的發(fā)生與腎小管上皮細胞凋亡的調控有密切關系［2,11］。本研究中,三七皂苷R1預處理使碘美普爾400所致NRK-52E細胞凋亡率明顯下降,提示三七皂苷R1可改善由碘美普爾400引發(fā)的細胞凋亡或壞死情況,其機制可能是通過限制過多ROS產(chǎn)生,及時阻斷ROS觸發(fā)NRK-52E細胞的凋亡途徑,最終抑制細胞的凋亡發(fā)展。

氧化應激或炎癥可刺激促氧化劑血紅素產(chǎn)生,而血紅素可誘發(fā)大量自由基生成,并引起細胞級聯(lián)氧化應激,導致細胞損傷;細胞為了維持穩(wěn)態(tài),常通過促進內源性HO-1迅速表達來分解血紅素,從而抵抗自由基損傷［15-17］。而據(jù)近年研究顯示,Nrf2是介導HO-1發(fā)揮作用的關鍵轉錄因子,它介導的抗氧化酶或相關抗氧化基因是抑制氧化應激,減緩凋亡的重要因素,被譽為腎臟保護很有前途的防御靶點［15］。本研究中,三七皂苷R1預處理使碘美普爾400誘導NRK-52E細胞中Nrf2、HO-1的mRNA 和蛋白表達增加,但加抑制劑鋅原卟啉后,二者表達顯著降低,暗示三七皂苷R1可特異性地促進NRK-52E細胞中Nrf2及HO-1的表達,明顯逆轉碘美普爾400誘導時的低表達狀態(tài)。綜上考慮,三七皂苷R1通過激活Nrf2/HO-1途徑,來調控NRK-52E細胞抵御碘美普爾400所致的氧化、炎癥及凋亡損傷。

Nrf2是CI-AKI的潛在治療靶標,三七皂苷R1具有顯著抗氧化、抑炎、減緩細胞凋亡的潛在臨床價值,是防御腎臟疾病比較有前景的候選天然藥物。本研究為防治非螯合劑碘對比劑導致的CI-AKI提供了基礎資料,為進一步開發(fā)、利用中草藥三七奠定了基礎,為研制出藥理作用機制確切、質量可控、療效顯著的三七皂苷R1藥品或相關產(chǎn)品提供了一定的參考依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。