黃金梅,唐 婷,韋柳葉,左遠(yuǎn)娟,賀佐分,龔元勛,姜 艷,郭文聞,譚 奔,唐乾利,

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,廣西 南寧 530200;2. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西 百色 533000;3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533000;4. 右江民族醫(yī)學(xué)院/桂西高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 百色 533000)

糖尿病引發(fā)創(chuàng)面難愈合的現(xiàn)象非常普遍,常導(dǎo)致殘疾甚至死亡［1-2］。糖尿病難愈合創(chuàng)面的病因復(fù)雜,即使愈合后亦會復(fù)發(fā)［3］。其治療問題在患者健康和經(jīng)濟(jì)方面都變得繁重,因此創(chuàng)面修復(fù)、皮膚再生仍是一個重要的公共衛(wèi)生問題和挑戰(zhàn)［4］。皮膚再生醫(yī)療技術(shù)立足于中西醫(yī)結(jié)合理論,強(qiáng)調(diào)原位再生,秉承整體觀念,具有顯著的止痛、抗感染、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、減少瘢痕等作用。唐乾利教授課題組從宏觀到微觀系統(tǒng)闡述了該技術(shù)治療慢性難愈合創(chuàng)面的作用靶點(diǎn)［5-6］,但對創(chuàng)面表皮再上皮化機(jī)制仍知之甚少。據(jù)研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的層黏連蛋白3(LAMA3)與角質(zhì)形成細(xì)胞的整合素α3(ITGA3)結(jié)合可調(diào)節(jié)細(xì)胞黏著、遷移等［7］。E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)家族成員ZEB1可直接調(diào)節(jié)LAMA3的表達(dá),影響細(xì)胞的活動［8］。而ZEB1/LAMA3/ITGA3信號通路是否在糖尿病難愈合創(chuàng)面修復(fù)中起到作用,皮膚再生醫(yī)療技術(shù)對此信號通路是否有調(diào)節(jié)作用,其背后的機(jī)制尚未明確。故本實(shí)驗(yàn)采用濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏(MEBT/MEBO)干預(yù)糖尿病大鼠難愈合創(chuàng)面,基于ZEB1/LAMA3/ITGA3信號通路探討了該療法對創(chuàng)面表皮區(qū)再上皮化的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar雄性大鼠80只,12周齡,體重200～250 g,購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(湘)2019-0013。嚴(yán)格遵照右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn),于SPF級動物房飼養(yǎng)。室溫20～26 ℃,相對濕度 45%～55%,晝夜循環(huán),保持12 h光照,分籠飼養(yǎng),自由飲食飲水。

1.2主要儀器與試劑 自動脫水機(jī)(型號:Excelsior AS,江蘇維林科生物技術(shù)有限公司),包埋機(jī)(型號:HistoStarTM,江蘇維林科生物技術(shù)有限公司),切片機(jī)(型號:HM325,北京恒三江儀器銷售有限公司),共聚焦顯微鏡(型號:STELLARIS 5,徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司),熒光定量PCR(型號:LightCycler 96,上海微速生物科技有限公司);MEBO(汕頭市美寶制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字Z20000004);貝復(fù)新(珠海億勝生物制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字S20040001);鏈脲佐菌素(STZ)、HE、Masson試劑(北京索萊寶科技有限公司);LAMA3 antibody(武漢博歐特生物科技有限公司);二抗(賽默飛世爾科技有限公司);LAMA3 、ITGA3、ZEB1引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,隨機(jī)抽取18只作為急性創(chuàng)面組,其余62只腹腔注射STZ制備糖尿病創(chuàng)面模型。糖尿病造模方法參考文獻(xiàn)［9］:大鼠禁食12 h,采用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.2)將STZ稀釋成1%的溶液,按照50 mg/kg左下腹腔快速注射,急性創(chuàng)面組腹腔注射同等劑量緩沖液。連續(xù)注射3 d后,以空腹血糖≥16.7 mmol/L為標(biāo)準(zhǔn);若模型不成功,再次禁食12 h后,補(bǔ)充1% STZ溶液10 mg/kg同法注射。創(chuàng)面造模方法參考文獻(xiàn)［10］:糖尿病造模成功后,根據(jù)全層皮膚缺損法和沈氏改良塑料環(huán)肉芽腫定量法制備創(chuàng)面模型。固定大鼠四肢,將其背部朝上,先剃去背部毛發(fā),再以脫毛膏脫毛,為消除脫毛劑對皮膚的影響,用清水洗滌并擦干背部皮膚。脫毛24 h后,通過小動物麻醉機(jī)讓大鼠吸入2.5%異氟烷麻醉,在無菌條件下,沿脊椎方向用外科方法做2條深達(dá)筋膜、直徑為30 mm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面。將糖尿病創(chuàng)面造模成功54只大鼠(剩余大鼠作為本實(shí)驗(yàn)同批次糖尿病大鼠備選)隨機(jī)分為MEBT/MEBO組、貝復(fù)新組、糖尿病創(chuàng)面組,每組18只。各組大鼠開始換藥干預(yù),每日2次。換藥前均以1/5 000呋喃西林液清潔創(chuàng)面,MEBT/MEBO組外敷2層MEBO紗條(0.2 g/cm2),貝復(fù)新組外敷2層貝復(fù)新浸透紗布(60 IU/cm2),糖尿病創(chuàng)面組和急性創(chuàng)面組外敷2層生理鹽水紗布,然后均外用膠布“豐”形固定2層消毒干紗布。

1.4創(chuàng)面組織取材方法 各組于造模后第3,7,14天分別隨機(jī)取6只大鼠麻醉,從深筋膜下層切取距離創(chuàng)緣0.5 cm的整個創(chuàng)面。將標(biāo)本無張力地平展在濾紙上,小心把標(biāo)本對半切開,一半用稱量紙包裹固定形狀后放入10%的中性緩沖液福爾馬林中,24 h后再放入70%的酒精中,置于4 ℃冰箱。另外一半置于凍存管中,放入液氮中-80 ℃保存。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1創(chuàng)面愈合情況 拍攝每組大鼠造模后當(dāng)天及第3,7,14天創(chuàng)面圖片,通過Image J軟件計(jì)算創(chuàng)面面積,按照公式計(jì)算創(chuàng)面愈合率［創(chuàng)面愈合率=(初始創(chuàng)面面積-所拍照時間點(diǎn)創(chuàng)面面積)/初始創(chuàng)面面積×100%］。

1.5.2創(chuàng)面組織病理形態(tài) 將福爾馬林處理后的組織放于自動化脫水儀器脫水后進(jìn)行包埋,切片厚度為4 μm,進(jìn)行2個二甲苯循環(huán)脫蠟透明,每步10 min;接著以無水乙醇5 min-無水乙醇5 min-90%乙醇5 min-80%乙醇5 min-70%乙醇5 min-純水5 min進(jìn)行組織水化;分別進(jìn)行HE染色、Masson染色;最后進(jìn)行乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹脂封片,顯微鏡下分析。

1.5.3創(chuàng)面組織中LAMA3蛋白陽性表達(dá)情況 取制備好的組織切片,按常規(guī)方法脫蠟至水,經(jīng)檸檬酸鹽抗原修復(fù)液修復(fù)后,滴加驢血清,室溫封閉1 h。滴加LAMA3一抗(比例1∶50)于切片樣本上,并將切片放于濕盒中,4 ℃冰箱過夜。孵育二抗前進(jìn)行洗片3次,每次10 min;滴加二抗(比例1∶500),常溫下1 h,敷二抗后均避光操作。再次洗片3次,每次10 min,DAPI常溫下染色8 min,洗片3次,每次5 min,最后用50%甘油封片。共聚焦顯微鏡下觀察,并使用Image J分析結(jié)果。

1.5.4創(chuàng)面組織中LAMA3、ITGA3、ZEB1mRNA表達(dá)情況 取適量凍存創(chuàng)面組織,按說明書1∶10比例添加Trizol裂解液,提取組織總RNA。在冰上使用高壓消毒后的剪刀將浸沒在裂解液中的組織剪碎,接著將組織放入全自動樣品快速研磨儀中研磨2 min;先后加入200 μL氯仿、0.5 mL異丙醇,期間12 000 r/min離心收取上清液。添加75%乙醇進(jìn)行純化,接著用DEPC水溶解RNA,紫外可見分光光度計(jì)測定其濃度,放于-80 ℃ 冰箱待用。采用BeyoRTTMII cDNA第一鏈合成試劑盒(RNase H-)反轉(zhuǎn)錄操作,20 μL反轉(zhuǎn)錄體系中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。依照HieffTMqPCR SYBR Green Master Mix進(jìn)行操作,采用熒光定量PCR儀,根據(jù)2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)的相對定量。引物序列:ITGA3上游為5’-GGGTGCCGTCTATGTCT-3’,下游為5’-TCTCCGTGGATTATCTGCT-3’;LAMA3上游為5’-GCGAACCAACACCCTCCT-3’,下游為5’-CACCGACACTGATGTCCTTTAT-3’;ZEB1上游為5’-AAAGTGGCTGTAGATGGTA-3’,下游為5’-ACTCACGGCTTCTTGCTC-3’;GAPDH上游為5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’,下游為5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布且方差齊,多組間比較采用單因素分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn);若方差不齊,采用蓋姆斯-豪厄爾(A)法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組創(chuàng)面愈合情況 造模后第3天,急性創(chuàng)面組大鼠創(chuàng)面潤澤,糖尿病創(chuàng)面組大鼠創(chuàng)面色澤略顯晦暗,各組創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。造模后第7天,糖尿病創(chuàng)面組創(chuàng)面稍大且存在分泌液,邊界模糊,表面覆蓋較厚的暗紅色組織物;MEBT/MEBO組、貝復(fù)新組和急性創(chuàng)面組大鼠創(chuàng)面邊界清晰,面積縮小,創(chuàng)面愈合率均明顯高于糖尿病創(chuàng)面組(P均<0.05),MEBT/MEBO組創(chuàng)面愈合率與貝復(fù)新組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后第14天,糖尿病創(chuàng)面組創(chuàng)面明顯縮小,較之前干燥,邊緣清晰,但仍有少許分泌物;MEBT/MEBO組、貝復(fù)新組和急性創(chuàng)面組大鼠創(chuàng)面均明顯縮小,創(chuàng)面愈合率均明顯高于糖尿病創(chuàng)面組(P均<0.05),MEBT/MEBO組創(chuàng)面愈合率與貝復(fù)新組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1及圖2。

圖1 急性創(chuàng)面組和糖尿病創(chuàng)面各組大鼠造模后不同時間點(diǎn)創(chuàng)面愈合情況

圖2 急性創(chuàng)面組和糖尿病創(chuàng)面各組大鼠造模后不同時間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率

2.2各組創(chuàng)面組織HE染色病理形態(tài) 造模后第3天,各組大鼠創(chuàng)面組織中均存在明顯炎癥細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤,創(chuàng)面邊緣的表皮層增厚。造模后第7天,糖尿病創(chuàng)面組大鼠創(chuàng)面組織中炎性細(xì)胞較多,雖然邊緣表皮增厚,但形成的表皮向創(chuàng)面遷移長度較短;MEBT/MEBO組、貝復(fù)新組和急性創(chuàng)面組大鼠創(chuàng)面均出現(xiàn)散在的肉芽組織,炎癥浸潤減輕,邊緣表皮增厚并明顯向創(chuàng)面中心遷移。造模后第14天,糖尿病創(chuàng)面組大鼠創(chuàng)面炎癥細(xì)胞浸潤減輕,但表皮再上皮化尚未完全;MEBT/MEBO組、貝復(fù)新組和急性創(chuàng)面組大鼠部分創(chuàng)面的表皮覆蓋完全,并生成毛囊胚、皮脂腺、血管等。見圖3。

圖3 急性創(chuàng)面組和糖尿病創(chuàng)面各組大鼠造模后不同時間點(diǎn)創(chuàng)面組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.3各組創(chuàng)面組織Masson染色情況 造模后第3天,各組大鼠創(chuàng)面組織中膠原纖維細(xì)小,紅細(xì)胞較多。造模后第7天,糖尿病創(chuàng)面組大鼠創(chuàng)面組織中膠原纖維染色較少且分布不均勻;MEBT/MEBO組、貝復(fù)新組、急性創(chuàng)面組大鼠創(chuàng)面組織中均可見分布和排列均勻的膠原纖維,同時有血管新生。造模后第14天,糖尿病創(chuàng)面組大鼠創(chuàng)面組織中有少量膠原纖維,且呈稀疏結(jié)構(gòu);MEBT/MEBO組、貝復(fù)新組、急性創(chuàng)面組大鼠創(chuàng)面組織中存在明顯增多且粗大、密集分布的膠原纖維。見圖4。

圖4 急性創(chuàng)面組和糖尿病創(chuàng)面各組大鼠造模后不同時間點(diǎn)創(chuàng)面組織Masson染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組創(chuàng)面組織中LAMA3蛋白陽性表達(dá)情況LAMA3蛋白分布在表皮層與真皮層之間,表達(dá)于向創(chuàng)面中心遷移的新生基底膜中,在創(chuàng)面邊緣遠(yuǎn)端的正常皮膚結(jié)構(gòu)中的基底膜幾乎不表達(dá)。糖尿病創(chuàng)面組第3,7,14天創(chuàng)面組織中LAMA3蛋白陽性表達(dá)光密度值均明顯低于其他組(P均<0.05),MEBT/MEBO組與貝復(fù)新組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖5及圖6。

圖5 急性創(chuàng)面組和糖尿病創(chuàng)面各組大鼠造模后不同時間點(diǎn)創(chuàng)面組織中LAMA3蛋白陽性表達(dá)情況(免疫熒光染色,×200,×800)

圖6 急性創(chuàng)面組和糖尿病創(chuàng)面各組大鼠造模后不同時間點(diǎn)創(chuàng)面組織中LAMA3蛋白陽性表達(dá)光密度值

2.5各組創(chuàng)面組織中LAMA3、ITGA3、ZEB1 mRNA 表達(dá)情況 造模后第3,7,14天,糖尿病創(chuàng)面組創(chuàng)面組織中LAMA3、ITGA3 mRNA表達(dá)量均明顯低于其他組(P均<0.05),ZEB1 mRNA表達(dá)量均明顯高于其他組(P均<0.05),MEBT/MEBO組創(chuàng)面組織中LAMA3、ITGA3、ZEB1 mRNA表達(dá)量與貝復(fù)新組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);MEBT/MEBO組中LAMA3、ITGA3、ZEB1 mRNA表達(dá)量與貝復(fù)新組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖7。

圖7 急性創(chuàng)面組和糖尿病創(chuàng)面各組大鼠創(chuàng)面組織中LAMA3 、ITGA3、ZEB1mRNA相對表達(dá)量

3 討 論

糖尿病患者易合并糖尿病足部潰瘍等難愈合創(chuàng)面病變,且常出現(xiàn)再上皮化功能障礙,并加快創(chuàng)面病理學(xué)進(jìn)程［3］。研究表明,創(chuàng)面中的細(xì)胞常以角質(zhì)形成細(xì)胞為主導(dǎo),在傷口基質(zhì)上持續(xù)遷移,以密封表皮斷層、恢復(fù)表皮結(jié)構(gòu)和屏障功能,創(chuàng)面再上皮化被用作評估傷口愈合的參數(shù)［11-12］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),MEBT/MEBO能夠通過作用于角質(zhì)形成細(xì)胞,進(jìn)而加快創(chuàng)面的愈合,但是其具體作用機(jī)制仍不明確。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),LAMA3和ITGA3是皮膚創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,可使參與再上皮化的角質(zhì)形成細(xì)胞沿著富含纖維蛋白/層黏連蛋白的ECM向創(chuàng)面中心遷移［7,13-14］。ECM是組成細(xì)胞外微環(huán)境的基礎(chǔ),對細(xì)胞遷移、增殖、凋亡等有重要調(diào)控作用,其重塑在創(chuàng)面愈合中具有促進(jìn)再上皮化和血管新生等作用［15］。故本研究從角質(zhì)形成細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制開展研究,旨在為治療糖尿病難愈合創(chuàng)面提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,造模后第7,14天,糖尿病創(chuàng)面組創(chuàng)面愈合率均明顯低于其他組;造模后第14天,病理觀察顯示糖尿病創(chuàng)面組創(chuàng)面仍有炎癥浸潤,表皮再上皮化不全,創(chuàng)面組織中LAMA3蛋白表達(dá)光密度值和LAMA3、ITGA3mRNA表達(dá)量均明顯低于其他組。提示LAMA3、ITGA3的表達(dá)與再上皮化有關(guān),二者在糖尿病難愈合創(chuàng)面中表達(dá)減少,與文獻(xiàn)［16-17］實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。MEBT/MEBO組LAMA3蛋白表達(dá)光密度值和LAMA3、ITGA3mRNA表達(dá)量與急性創(chuàng)面組、貝復(fù)新組比較差異均不明顯,提示MEBT/MEBO能上調(diào)創(chuàng)面組織中LAMA3和ITGA3表達(dá)。

ZEB1被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄激活劑,其可直接調(diào)節(jié)LAMA3的表達(dá),從而影響再上皮化進(jìn)程［11］;可減弱角質(zhì)形成細(xì)胞黏附作用,并阻止其向創(chuàng)面中心定向遷移,影響再上皮化,導(dǎo)致表皮屏障的完整性受損［16-18］。ZEB1還可以血糖狀態(tài)依賴的方式調(diào)控創(chuàng)面血管的生成和閉合,適度的表達(dá)可促進(jìn)創(chuàng)面血管生成,極端過表達(dá)則可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能喪失和持續(xù)性炎癥反應(yīng)［19-20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,糖尿病創(chuàng)面組創(chuàng)面組織中ZEB1 mRNA表達(dá)量高于急性創(chuàng)面組、MEBT/MEBO組和貝復(fù)新組;病理觀察顯示糖尿病創(chuàng)面組的創(chuàng)面邊緣表皮增厚但遷移較慢,且創(chuàng)面持續(xù)炎癥浸潤,新生血管少,這可能與該組ZEB1表達(dá)失衡有關(guān)。急性創(chuàng)面組、MEBT/MEBO組和貝復(fù)新組創(chuàng)面組織出現(xiàn)新生血管,膠原纖維排列有序,表皮遷移較快,提示MEBT/MEBO可下調(diào)ZEB1表達(dá),促進(jìn)創(chuàng)面血管新生和再上皮化。

綜上,糖尿病大鼠難愈合創(chuàng)面再上皮化遲緩,可能與ZEB1表達(dá)過高,從而影響與創(chuàng)面細(xì)胞黏附、定向遷移相關(guān)的LAMA3、ITGA3表達(dá)不足有關(guān);MEBT/MEBO干預(yù)可上調(diào)LAMA3、ITGA3表達(dá),相對下調(diào)ZEB1表達(dá),以創(chuàng)造良好的愈合組織微環(huán)境,促進(jìn)再上皮化。但因再上皮化修復(fù)機(jī)制的復(fù)雜性、重疊性,同時ZEB1僅在腫瘤、癌癥領(lǐng)域研究較多,ZEB1/LAMA3/ITGA3信號通路在創(chuàng)面修復(fù)的相關(guān)研究仍需更深入的探討。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。