宋琨燕，李金夢(mèng)，鄢烽，巫小丹，劉玉環(huán)，鄭洪立

南昌大學(xué)食品學(xué)院（南昌 330047）

柑橘是世界第一大類水果，其種植面積和產(chǎn)量在全球眾多水果中均居于首位。據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)：2020年全世界柑橘的產(chǎn)量為9 800萬 t；其中，中國(guó)、巴西、美國(guó)的柑橘產(chǎn)量名列前三[1]。柑橘為蕓香科柑橘屬植物，主要包括橘、柑、橙、柚、葡萄柚、檸檬等。我國(guó)種植的柑橘主要是寬皮柑橘（橘、柑）類、甜橙類、柚類、檸檬類以及金柑類（表1）。中國(guó)作為柑橘的原產(chǎn)地之一，柑橘種植面積和產(chǎn)量均居世界前列。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：2021年我國(guó)柑橘產(chǎn)量達(dá)到5 595.61萬 t。柑橘的產(chǎn)地主要在我國(guó)的廣西、湖南、江西、廣東、四川等地區(qū)。江西省柑橘產(chǎn)業(yè)在全國(guó)占據(jù)重要地位，其種植面積和產(chǎn)量分別位居我國(guó)的第三和第六位。江西省種植的柑橘主要有南豐蜜橘、馬家柚、臍橙等。

表1 我國(guó)柑橘皮中d-檸檬烯含量

柑橘精油為柑橘的次生代謝物質(zhì)，是易揮發(fā)、具有特殊氣味的天然化合物。柑橘精油主要由萜烯烴類化合物及高級(jí)醛類、醇類、酯類、酮類等含氧化合物組成。柑橘精油中含有400多種化學(xué)成分，主要為萜烯烴類化合物，其中以d-檸檬烯的含量最高。柑橘的樹葉、樹枝、樹皮、花、果皮等均含有d-檸檬烯，其中柑橘皮中d-檸檬烯含量最為豐富[3]。柑橘皮占整個(gè)果重的25%~40%。柑橘皮中的精油占果皮鮮重的0.5%~2.0%。柑橘果皮中d-檸檬烯含量約為64.73%~92.15%（表1），而d-檸檬烯含量又以皮鳳凰柚果皮中最高（92.15%）[2]。不同種類柑橘果皮中d-檸檬烯含量不同，不同生長(zhǎng)時(shí)期的柑橘果皮中d-檸檬烯含量也不同。d-檸檬烯具有抑菌保鮮、抗氧化、抗疾病、增香等作用，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、香料、日化等行業(yè)。深度開發(fā)柑橘皮中d-檸檬烯，具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。因此，文章將重點(diǎn)綜述柑橘皮中d-檸檬烯的提取及在食品保鮮中的應(yīng)用研究，以期為我國(guó)柑橘皮中d-檸檬烯的研究以及在食品保鮮中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和理論參考。

1 d-檸檬烯簡(jiǎn)介

檸檬烯（Limonene），又稱苧烯、苧烯，是一種單環(huán)單萜烯，化學(xué)名為1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）環(huán)己烯，分子式為C10H16，分子量為136.24，沸點(diǎn)175.5~176.5 ℃，有橙皮香氣，是不溶于水的無色至淡黃色油狀液體，易溶于正己烷、丙酮等有機(jī)溶劑。檸檬烯有三種同分異構(gòu)體：右旋檸檬烯（d-檸檬烯）、左旋檸檬烯（l-檸檬烯）和消旋檸檬烯（dl-檸檬烯）[4]。d-檸檬烯廣泛存在天然的植物中，l-檸檬烯和dl-檸檬烯在天然植物中分布遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有d-檸檬烯廣泛。當(dāng)前，d-檸檬烯主要來源于柑橘類水果。柑橘皮精油中d-檸檬烯含量占90%~98%。d-檸檬烯的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。d-檸檬烯在光照和氧氣環(huán)境中易被氧化成氧化單環(huán)單萜化合物。故d-檸檬烯保存時(shí)應(yīng)避光和隔絕氧氣，防止氧化。d-檸檬烯毒性較小。d-檸檬烯對(duì)很多細(xì)菌和真菌都具有較強(qiáng)的抗菌活性，有抗菌抑菌和防腐作用，被廣泛應(yīng)用于食品保鮮。

圖1 d-檸檬烯結(jié)構(gòu)式

2 d-檸檬烯的提取方法

d-檸檬烯主要存在于柑橘皮中，它是柑橘皮精油的主要成分。d-檸檬烯提取方法主要有物理方法、化學(xué)方法和生物方法。物理方法包括冷榨法、水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2萃取法等；化學(xué)方法包括有機(jī)溶劑浸提法等；生物方法包括酶提取法等。組合方法（超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等）越來越多地被用于柑橘皮d-檸檬烯的提取。不同d-檸檬烯提取方法，其提取效率不同，優(yōu)缺點(diǎn)不同（表2）。由于d-檸檬烯在光照和氧氣環(huán)境中易被氧化，故快捷、高效的提取方法決定d-檸檬烯的得率和質(zhì)量。

表2 d-檸檬烯提取方法的比較

2.1 物理方法

冷榨法提取d-檸檬烯，是指在室溫至65 ℃之間，原料柑橘皮放入壓榨機(jī)中，在壓力的作用下，柑橘皮油囊細(xì)胞破碎，釋放出油分，然后通過靜置分層或者過濾、離心等方法實(shí)現(xiàn)油水分離，精煉得到含d-檸檬烯的精油。張群琳[5]通過不銹鋼銼板銼磨提取了三種甜橙果皮的d-檸檬烯，其含量分別85.95%，84.60%和81.48%。金如月[6]采用冷榨法提取了12種柑橘的d-檸檬烯，d-檸檬烯含量為39.45%~71.82%。冷榨法具有提取得到的d-檸檬烯活性高、化學(xué)結(jié)構(gòu)未被破壞等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)存在得率較低，純度不高，與蠟、色素等雜質(zhì)混合在一起等缺點(diǎn)。

水蒸氣蒸餾法是一種依靠水蒸氣從柑橘皮中提取d-檸檬烯，d-檸檬烯和水形成混合物，經(jīng)冷凝后即得到含d-檸檬烯的產(chǎn)物。張金磊等[7]利用水蒸氣蒸餾法提取了溫州特早熟蜜橘橘皮的d-檸檬烯，其含量為82.37%。張方艷等[8]采用水蒸氣蒸餾法提取了梁平柚、香柚、文旦柚和沙田柚四種柚子皮的d-檸檬烯，其提取率分別為1.86%，1.61%，1.97%和1.56%，其含量分別為59.11%，96.75%，55.34%和93.48%。水蒸氣蒸餾法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、容易操作、易規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)，但存在能耗高、耗時(shí)長(zhǎng)、所提取的d-檸檬烯純度不夠高、化學(xué)結(jié)構(gòu)易被破壞等缺點(diǎn)。水蒸氣蒸餾法適用于d-檸檬烯的初步提取。

超臨界CO2萃取法是利用超臨界二氧化碳對(duì)d-檸檬烯有較高的溶解作用，以高壓、高密度的超臨界狀態(tài)流體CO2為溶劑，從柑橘皮中萃取d-檸檬烯，然后通過升溫、降壓或二者兼用和吸收等手段實(shí)現(xiàn)CO2和d-檸檬烯的分離。超臨界CO2萃取法是一種集有機(jī)溶劑萃取和蒸餾法的優(yōu)點(diǎn)為一體的產(chǎn)物分離技術(shù)。不同的溫度與壓力，超臨界CO2的溶解性不同。鄧敏[4]采用超臨界CO2萃取法提取柑橘皮渣中的d-檸檬烯，在壓力25 MPa、溫度35 ℃、時(shí)間150 min條件下，萃取率最高，為2.21%，d-檸檬烯含量為57.89%±0.731%。李勇慧等[9]采用超臨界CO2萃取法提取沃柑、檸檬、臍橙和蘆柑四種果皮的d-檸檬烯，提取率分別為0.620%，0.556%，0.593%和0.742%，d-檸檬烯的含量分別為6.37%，3.69%，3.71%和46.66%。超臨界CO2萃取法具有工藝簡(jiǎn)單、低溶劑殘留、環(huán)境友好，得到的d-檸檬烯分子結(jié)構(gòu)未遭破壞等優(yōu)點(diǎn)，但存在該方法對(duì)技術(shù)要求高、設(shè)備昂貴，運(yùn)行成本高等缺點(diǎn)。該方法目前主要在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。

2.2 化學(xué)方法

有機(jī)溶劑浸提法是依靠相似相溶的原理，利用有機(jī)溶劑對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物d-檸檬烯的溶解度，通過連續(xù)回流提取后得到提取液，去除其中的有機(jī)溶劑得到d-檸檬烯粗產(chǎn)物。常用有機(jī)溶劑包括乙醇、石油醚、正戊烷、正己烷、二氯甲烷等。張金磊等[7]用正己烷提取溫州蜜桔果皮d-檸檬烯，得到的d-檸檬烯含量為85.25%。正己烷、石油醚等有機(jī)溶劑往往有毒，會(huì)引起嚴(yán)重的環(huán)境和健康問題。因此無毒和可生物降解的綠色溶劑替代傳統(tǒng)的有毒化學(xué)溶劑成為發(fā)展方向，例如環(huán)戊基甲醚、乳酸乙酯、異丙醇、聚乙二醇300等[10]。Ozturk等[10]采用有機(jī)溶劑浸提法提取廢棄柑橘皮的d-檸檬烯，使用綠色溶劑環(huán)戊基甲醚和2-甲基四氫呋喃，提取率分別為1.78%和1.37%，而使用正己烷的提取率僅為0.99%。有機(jī)溶劑浸提法具備操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、效率高等優(yōu)點(diǎn)，但存在有機(jī)溶劑易燃易爆、有毒、污染環(huán)境等缺點(diǎn)。

2.3 生物方法

酶提取法是利用酶破壞柑橘皮細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)d-檸檬烯釋放出來，實(shí)現(xiàn)d-檸檬烯的提取。Waheed等[11]研究了復(fù)合纖維素酶提取柑橘果皮d-檸檬烯，最佳工藝為液料值比4.0 mL/g、溫度55 ℃、酶解3.8 h，得率最高為46.31 mL/kg，d-檸檬烯含量為66%。Ramos-Ibarra等[12]研究了酶法提取柑橘和酸橙果皮中的d-檸檬烯，結(jié)果表明：酶法的d-檸檬烯產(chǎn)率比對(duì)照提高了17倍。酶提取法具有反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、d-檸檬烯分子結(jié)構(gòu)未遭破壞等優(yōu)點(diǎn)，但存在酶的成本高、酶易失活等缺點(diǎn)。目前d-檸檬烯酶提取法還未工業(yè)化應(yīng)用。

2.4 組合方法

超聲波輔助提取法是依靠聲波引起快速、劇烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，以及次級(jí)效應(yīng)（機(jī)械震動(dòng)、乳化、擴(kuò)散等），破壞柑橘皮細(xì)胞壁，加快目標(biāo)產(chǎn)物d-檸檬烯的擴(kuò)散、釋放并與溶劑混合，從而減少提取時(shí)間，提升效率。Khandare等[13]采用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取了柑橘皮中的d-檸檬烯，在超聲波功率80 W、料液比1∶10、超聲波時(shí)間15 min條件下，d-檸檬烯含量為32.9 mg/g。宋雪[14]采用超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取獅頭柑果皮d-檸檬烯，最優(yōu)工藝為料液比1∶8、超聲波功率80 W、超聲波時(shí)間32 min，精油得率2.50%，d-檸檬烯含量為82.95%。超聲波輔助提取法具有時(shí)間短、效率高、經(jīng)濟(jì)性好、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，但存在超聲波能量分布不均勻、d-檸檬烯分子結(jié)構(gòu)易遭破壞等缺點(diǎn)。

微波輔助提取法是在微波作用下，柑橘皮中吸波能力較強(qiáng)的組分吸收微波后能被迅速加熱，分子運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，促使d-檸檬烯從柑橘皮中釋放到溶劑中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)d-檸檬烯的分離和提取。Auta等[15]研究了微波輔助提取法提取橙皮和檸檬皮d-檸檬烯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：功率1 000 W、時(shí)間10 min時(shí)，橙皮和檸檬皮的提取率最高，分別為3.7%和2.0%，d-檸檬烯的含量分別為28.88%和44.74%。Bustamante等[16]采用微波輔助水蒸氣蒸餾法提取柑橘皮d-檸檬烯，在料液比1∶1.5，先后785 W處理5 min和250 W處理15 min，得率最高，為1.8%，d-檸檬烯含量為97.38%。微波輔助提取法具有適用范圍廣、效率高、污染小等優(yōu)點(diǎn)，但存在微波作用過程可控性差、d-檸檬烯分子結(jié)構(gòu)易遭破壞等缺點(diǎn)。

在柑橘皮d-檸檬烯提取過程中，采用單一的方法，效果通常較差。組合方法提取d-檸檬烯兼具不同單一方法的優(yōu)點(diǎn)，效果較單一方法更好。組合方法受到越來越多的關(guān)注。通過以上物理、化學(xué)、生物和組合方法提取得到的d-檸檬烯，是一定純度d-檸檬烯的混合物。d-檸檬烯在光照和氧氣環(huán)境中易被氧化，而純度不高d-檸檬烯更有利于防止d-檸檬烯被氧化。若想得到高純度d-檸檬烯，則需對(duì)物理、化學(xué)、生物和組合方法提取得到的d-檸檬烯產(chǎn)物進(jìn)一步純化。目前d-檸檬烯純化的方法主要有色譜法、毛細(xì)管電泳、離心等方法。但此類方法能耗較高、設(shè)備昂貴、維護(hù)成本高。

3 d-檸檬烯的抑菌機(jī)理

食品腐敗變質(zhì)指食品在微生物的作用下，營(yíng)養(yǎng)成分與感官性狀發(fā)生改變的現(xiàn)象。導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的微生物主要是細(xì)菌[17]、霉菌及酵母菌。因此，抑制食品中微生物的活性是食品防腐保鮮的關(guān)鍵。d-檸檬烯是一種天然食品防腐劑，抑菌作用強(qiáng)。d-檸檬烯具有廣譜的抗菌性，對(duì)細(xì)菌、霉菌和酵母菌等微生物的生長(zhǎng)繁殖均具有抑制作用。張方艷等[8]以提取自四種柚皮（香柚、沙田柚、文旦柚、梁平柚）d-檸檬烯為研究對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)d-檸檬烯對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、霉菌和酵母菌均有抑菌作用。盧海燕等[18]發(fā)現(xiàn)d-檸檬烯對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，對(duì)單核增生李斯特菌沒有抑制作用。

目前d-檸檬烯的抑菌機(jī)理尚未完全清楚。但研究者普遍認(rèn)為，d-檸檬烯主要是通過破壞微生物的細(xì)胞膜，從而抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖（表3）。d-檸檬烯破壞菌體的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜系統(tǒng)，增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外滲，無法生長(zhǎng)繁殖，甚至死亡。Pasqua等[19,22]研究了d-檸檬烯等抑菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌等微生物細(xì)胞膜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)d-檸檬烯等主要是降低了細(xì)胞膜磷脂的含量，進(jìn)而改變了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，最終產(chǎn)生了抑菌作用。Tao等[23]研究表明：d-檸檬烯等抑制青霉和綠霉，d-檸檬烯使霉菌變形和體積變小，改變了細(xì)胞外電導(dǎo)率和pH。這主要是由于d-檸檬烯破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外滲，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。d-檸檬烯還可通過干擾菌體內(nèi)正常的酶促反應(yīng)和能量代謝、改變微生物DNA的結(jié)構(gòu)或功能、影響微生物體內(nèi)的酶或功能蛋白等來抑制微生物生長(zhǎng)繁殖。

表3 d-檸檬烯抑菌作用

4 d-檸檬烯在食品保鮮中的應(yīng)用

d-檸檬烯是天然防腐劑，具有安全性好、抗菌效果佳、無污染等優(yōu)勢(shì)。柑橘皮含有大量的d-檸檬烯，將其作為食品防腐保鮮劑，可減少傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑對(duì)人體的傷害，具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。研究表明，d-檸檬烯進(jìn)入人體后，大部分可被代謝排出，不會(huì)給人體帶來毒副作用。1994年美國(guó)食用香料與提取物制造商協(xié)會(huì)認(rèn)定d-檸檬烯毒性為一般公認(rèn)安全級(jí)，目前其已在美國(guó)食品保鮮方面推廣使用。d-檸檬烯單獨(dú)使用或與其他制劑聯(lián)合使用，均可抑制微生物的生長(zhǎng)。目前，d-檸檬烯已被廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜、果汁、面包等食品的保鮮。

水果在貯運(yùn)中腐爛的主要原因是采后病害，目前防止水果腐敗常用方法為物理和防腐劑組合的方法。d-檸檬烯作為天然防腐劑，成為研究和開發(fā)水果防腐保鮮技術(shù)的研究熱點(diǎn)。趙菊蓮等[24]研究了d-檸檬烯保鮮油桃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它可在油桃的表皮形成一層保護(hù)膜，阻止腐敗微生物入侵，使貯藏時(shí)間變長(zhǎng)，減緩油桃的腐敗變質(zhì)，同時(shí)還有效延緩油桃的失水，保留油桃的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。Lan等[25]研究了d-檸檬烯、聚乙烯醇和殼聚糖形成的復(fù)合薄膜保鮮芒果，結(jié)果表明復(fù)合薄膜可抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，抑菌作用與檸檬烯的含量呈正比，檸檬烯添加量為10%時(shí)，其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑分別為6.61和6.88 mm，經(jīng)復(fù)合薄膜處理后芒果的貯藏期延長(zhǎng)，貯藏期的腐敗率小于20%。

蔬菜從最初采摘到最后的食用，此過程中極易因微生物的入侵而使蔬菜腐敗變質(zhì)，降低蔬菜營(yíng)養(yǎng)。d-檸檬烯已被應(yīng)用于蔬菜保鮮。盧海燕等[26]研究了d-檸檬烯保鮮菠菜，與清水組相比，d-檸檬烯乳化液可以保護(hù)菠菜的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)；貯藏6 d，菠菜的品質(zhì)沒有發(fā)生改變。Maleki等[27]采用殼聚糖-d-檸檬烯涂膜和氣調(diào)貯藏相結(jié)合的方法，保鮮黃瓜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此方法可以延長(zhǎng)黃瓜的采后貯藏時(shí)間，抑制酵母菌和霉菌的生長(zhǎng)，減少黃瓜腐敗變質(zhì)。

d-檸檬烯在其他食品保鮮方面也有應(yīng)用。李巧巧等[28]研究發(fā)現(xiàn)d-檸檬烯添加到橙汁中可以抑制腐敗菌生長(zhǎng)，穩(wěn)定橙汁色澤和pH。高紅亮等[29]研究表明d-檸檬烯含量大于等于0.50 g/L時(shí)，對(duì)橙汁有保鮮效果，微生物生長(zhǎng)受到抑制，對(duì)穩(wěn)定pH和阻止感官品質(zhì)下降都有顯著的作用。李巧巧等[30]研究發(fā)現(xiàn)d-檸檬烯（氣態(tài)下）對(duì)腐敗面包上的酵母和青霉均有抑制效果，在面包保鮮中有明顯效果。

5 結(jié)語與展望

隨著我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，柑橘產(chǎn)量將不斷提高。柑橘皮d-檸檬烯是天然防腐劑，具有來源廣泛、防腐效果好、安全、無污染等優(yōu)點(diǎn)，柑橘皮d-檸檬烯保鮮食品展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。隨著食品加工技術(shù)和微生物應(yīng)用的不斷發(fā)展，柑橘皮d-檸檬烯保鮮食品未來發(fā)展方向主要有三個(gè)方面：一是破解大量?jī)?yōu)質(zhì)而低廉的原料柑橘皮的獲得難題，保障d-檸檬烯加工原料供應(yīng)；二是柑橘皮d-檸檬烯提取新技術(shù)不斷得到開發(fā)和應(yīng)用，降低d-檸檬烯提取成本，提高d-檸檬烯質(zhì)量和產(chǎn)量；三是闡明d-檸檬烯抑菌機(jī)制，大幅提高d-檸檬烯抑菌效果，開展d-檸檬烯與其他防腐方法共同防腐的研究，拓展d-檸檬烯食品保鮮應(yīng)用。因此，利用我國(guó)豐富柑橘皮資源，深入研究柑橘皮d-檸檬烯提取及食品保鮮應(yīng)用，有利于促進(jìn)我國(guó)柑橘和食品產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。