連夢瑤，張小慧，馬安妮，李歡，張雪梅，魏俊桃

內(nèi)蒙古草原紅太陽食品股份有限公司（呼和浩特 011700）

火鍋蘸料以花生醬、芝麻醬、韭菜花醬等多種原料按照一定比例，經(jīng)過一定加工工藝制成，以其風(fēng)味濃郁醇香、食用方便快捷、香氣獨(dú)特等特點(diǎn)受到廣大消費(fèi)者青睞。火鍋是流行于全國各地的一種美食，融匯我國各族人民的飲食精華[1]?；疱佌毫现械幕ㄉu含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等，營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，是很好的佐餐和調(diào)味品[2]。芝麻醬做工精細(xì)、香味濃郁、口感醇香且營養(yǎng)價(jià)值豐富，含有大量優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、木酚素和維生素E，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、防病抗癌等功效[3]。韭菜花富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)含有礦物質(zhì)元素和維生素類物質(zhì)等有益健康的成分，作為一種北方傳統(tǒng)的調(diào)味品，韭菜花醬味道更為濃郁，常作為火鍋配料食用[4-5]。

隨著人們對微生物的認(rèn)識(shí)，更多學(xué)者認(rèn)識(shí)到微生物與食品不同風(fēng)味的形成有重要聯(lián)系，高通量測序技術(shù)使得食品微生物多樣性研究得以發(fā)展[6-12]。馬巖石等[13]基于高通量測序技術(shù)分析東北豆醬的微生物多樣性，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，對東北市售5種常見豆醬進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)及真菌ITS 1~2區(qū)基因序列分析，探究其微生物的群落結(jié)構(gòu)組成及其多樣性。董蘊(yùn)等[14]利用高通量測序技術(shù)對6個(gè)細(xì)菌型豆豉細(xì)菌多樣性進(jìn)行評(píng)估，并且建立核心細(xì)菌類群與滋味品質(zhì)相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)圖，得出葡萄球菌屬（Staphylococcus）和乳酸桿菌屬與豆豉酸味的形成呈正相關(guān)。然而，針對火鍋蘸料微生物多樣性的研究少有報(bào)道。試驗(yàn)利用高通量測序方法對火鍋蘸料的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行分析比較，以期探索火鍋蘸料中的腐敗菌，實(shí)現(xiàn)對蘸料中有害菌的防治，探討加工過程中的工藝合理性和科學(xué)性，從而實(shí)現(xiàn)提高火鍋蘸料的品質(zhì)，為提升加工水平以及工藝及設(shè)備改進(jìn)提供科學(xué)依據(jù)[15-19]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A1保溫1個(gè)月火鍋蘸料，A2更換包材節(jié)點(diǎn)多不可計(jì)，A3孜然蘸料多不可計(jì)，A4當(dāng)天實(shí)驗(yàn)室自制火鍋蘸料。取150 g左右上述火鍋蘸料樣品，裝入無菌采樣管中，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備?；疱佌毫蟻碓礊閮?nèi)蒙古草原紅太陽食品有限公司。

E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒（OMEGA Bio-Tek公司）；Q10212-Qubit3.0 DNA檢測試劑盒（美國Life Tech公司）；P111-03高保真酶（Vazyme Bio公司）；MagicPure? Size Selection DNA Beads（Transgen公司）；FC-410-1003基因測序試劑盒（美國Illumina公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21-臺(tái)式離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）；0.5~10 μL微量可調(diào)移液器（德國Eppendorf公司）；T100TM Thermal Cyeler-PCR儀（BIO-RAD公司）；Qubit? 3.0熒光計(jì)（Invitrogen公司）；Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）；illumina MiSeq高通量測序儀（美國Illumina公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

將不同編號(hào)的火鍋蘸料樣品攪拌均勻，根據(jù)DNA提取試劑盒說明書，結(jié)合SDS裂解液凍融法進(jìn)行DNA提取，在-20 ℃儲(chǔ)存，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，滿足條帶清晰則進(jìn)行下一步操作。

1.3.2 測序方法

以火鍋蘸料總DNA為模板進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)域擴(kuò)增。PCR所用的引物已融合Miseq測序平臺(tái)的V3-V4通用引物（341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG 805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC）進(jìn)行擴(kuò)增。DNA模板10 μL，高保真PCR試劑15 μL，前后F/R引物各1 μL（10 μmol/L），dd H2O 30 μL。配制好的PCR體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃、30 min；5個(gè)循環(huán)為變性94 ℃、30 s，退火45 ℃、20 s，延伸65℃、30 s；20個(gè)循環(huán)為變性94 ℃、20 s，退火55 ℃、20 s，延伸72 ℃、30 s，終延伸72 ℃、5 min。第2輪擴(kuò)增，引入Illumina橋式PCR兼容引物，PCR產(chǎn)物（上一輪）20 ng，高保真PCR試劑15 μL，前后F/R引物各1 μL（10 μmol/L），dd H2O 30 μL。配制好的PCR體系按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：預(yù)變性95 ℃、30 min；5個(gè)循環(huán)為變性94 ℃、20 s，退火55 ℃、20 s，延伸72 ℃、30 s，終延伸72 ℃、5 min，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，使用Qubit 3.0檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，按照1︰1的等量混合后測序。等量混合時(shí)，每個(gè)樣品DNA量取10 ng，最終上機(jī)測序濃度20 pmol，在Illlumina NovaSeq 6000 pair-end 2×150 bp平臺(tái)進(jìn)行雙端測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用QIIME（v.1.8.0）軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，拆分和截去條碼序列和引物序列后使用Usearch（v5.2.236）對每個(gè)樣品的序列進(jìn)行拼接，得到原始數(shù)據(jù)，去除嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)，默認(rèn)以97%相似度以上序列聚類成操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），使用默認(rèn)參數(shù)挑選OTU的代表序列，基于SILVA128數(shù)據(jù)庫對代表序列進(jìn)行物種注釋，進(jìn)一步生成OTU列表，在各個(gè)分類水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成，所有樣本中含量低于總序列0.001%的分類單元將被去除。序列數(shù)據(jù)分析主要使用QIIME和R包（v3.2.0）計(jì)算樣品的各項(xiàng)數(shù)據(jù)指標(biāo)。使用QIIME軟件計(jì)算alpha多樣性指數(shù)，通過Chao 1、Shannon、Coverage指數(shù)比較每個(gè)樣本的OTUs豐度、菌群多樣性；微生物群落組成分析是基于R包中Kruskal方法比較樣本間各分類水平屬的菌群組成結(jié)構(gòu)，通過繪制Venn圖和屬水平分類圖進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序序列統(tǒng)計(jì)

16S rRNA高通量測序結(jié)果通過高通量測序獲得4種火鍋蘸料的有效序列，并對所有有效序列進(jìn)行Tags聚類分析，在97%的相似度下進(jìn)行OTUs（Operational Taxo-nomic Units）聚類分析。其中A2和A3獲得最多有效序列，分別為49 619和63 335，A1獲得最少的有效序列。所有樣品經(jīng)OTU分析共計(jì)產(chǎn)生18 770個(gè)OTUs。

2.2 序列豐富度及多樣性分析

通過對OTU的聚類和注釋的結(jié)果統(tǒng)計(jì)，得到不同分類水平上各個(gè)樣本的微生物類群組成數(shù)量，如表1所示。測序4個(gè)樣本共得到142 398條有效數(shù)據(jù)。Shannon指數(shù)和Chao 1指數(shù)是衡量物種多樣性和豐富度的指數(shù)。Shannon指數(shù)越高，表示物種多樣性越大，Chao 1指數(shù)越高，表示物種豐富度越高。在4個(gè)火鍋蘸料樣品中，A1的Shannon指數(shù)為2.43，A2的Shannon指數(shù)為2.04，A3的Shannon指數(shù)1.89，A4的Shannon指數(shù)為3.28。A1的Chao 1指數(shù)為14 513.71，A2的Chao 1指數(shù)為98 344.66，A3的Chao 1指數(shù)為146 864.84，A4的Chao 1指數(shù)為22 961.53。經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隸屬于不同火鍋蘸料樣品中的細(xì)菌類群在Shannon指數(shù)（P＞0.05）、Chao 1指數(shù)（P＞0.05）均不具有顯著性差異。由此可見，4個(gè)火鍋蘸料中的細(xì)菌多樣性和豐富度較為均一。結(jié)果表明，4個(gè)火鍋蘸料雖然存放條件或時(shí)間有所不同，后續(xù)儲(chǔ)存過程中可能并未摻雜入大量其他細(xì)菌，因此4個(gè)火鍋蘸料的細(xì)菌類群較為相似。

表1 高通量測序樣品16S rDNA測序情況及分類情況

由圖1可知，在測序深度達(dá)到5 000條左右時(shí)，所有的Shannon稀釋曲線均已進(jìn)入平臺(tái)期，說明細(xì)菌微生物多樣性不會(huì)隨之增加。表1中，A3樣本的有效序列數(shù)均達(dá)到60 000條，A2樣本的有效序列數(shù)均達(dá)到40 000條，A4樣本的有效序列數(shù)均達(dá)到20 000條，A1樣本的有效序列數(shù)均達(dá)到5 000條。Simpson指數(shù)代表群落中種數(shù)個(gè)體分配的均勻程度，Simpson指數(shù)越高，群落多樣性越好，可以反映A2和A3樣品中微生物種類豐富，A1和A4樣品中微生物種類少。

圖1 Alpha指數(shù)稀疏曲線圖

Rank-abundance曲線是分析多樣性的一種方式。構(gòu)建方法是統(tǒng)計(jì)單一樣品中，每一個(gè)OTU所含的序列數(shù)，將OTUs按豐度（所含有的序列條數(shù)）由大到小等級(jí)排序，以O(shè)TU等級(jí)為橫坐標(biāo)，以每個(gè)OTU中所含的序列數(shù)（也可用OTU中序列數(shù)的相對百分含量）為縱坐標(biāo)做圖。Rank-abundance曲線用于同時(shí)解釋樣品多樣性的兩個(gè)方面，即樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長度反映，曲線越寬表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻程度由曲線的形狀反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高。由圖2可知，4個(gè)火鍋蘸料樣品中物種的豐富程度與均勻程度相差不大。

圖2 Rank Abundance曲線圖

2.3 序列豐富度及多樣性分析

對測序獲得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，以97%相似度以上的序列聚類成OTUs，并根據(jù)不同類型火鍋蘸料繪制維恩圖（圖3）。A1中含有的OTUs是951，A2中含有的OTUs是6 589，A3中含有的OTUs是8 897，A4中含有的OTUs是3 066。說明4個(gè)樣本中的細(xì)菌種類A3＞A2＞A4＞A1。A1和A2樣品中相同的OTUs有32個(gè)，A1和A3樣品中相同的OTUs有17個(gè)，A1和A4樣品中相同的OTUs有105個(gè)。A2和A3樣品中相同的OTUs有569個(gè)，A2和A4樣品中相同的OTUs有52個(gè)，A3和A4樣品中相同的OTUs有22個(gè)。4個(gè)火鍋蘸料樣品中有13個(gè)共有的OTUs，這些微生物起著重要作用。

圖3 4種火鍋蘸料中的OTUs維恩圖

2.4 細(xì)菌屬水平上的分布特征

基于屬水平上的分類學(xué)對4種火鍋蘸料中最具優(yōu)勢的11個(gè)屬繪制分類圖，如圖4（不同色塊寬度表示不同物種相對豐度比例）所示。A1中主要的細(xì)菌類群為黃單胞菌屬（Xanthomonas）、凱斯特鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、未分類菌屬（Unclassified）以及嗜熱嗜堿產(chǎn)芽孢桿菌屬（Caldalkalibacillus），豐度逐個(gè)降低；A2中依次為芽孢桿菌屬（Bacillus）、未分類菌屬（Unclassified）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、異桿菌屬（Allobacillus）、凱斯特鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）；A3則主要由芽孢桿菌屬（Bacillus）、未分類菌屬（Unclassified）、異桿菌屬（Allobacillus）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）組成；A4中主要的細(xì)菌類群為黃單胞菌屬（Xanthomonas）、凱斯特鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、未分類菌屬（Unclassified）、腸桿菌屬（Enterobacter）及嗜熱嗜堿產(chǎn)芽孢桿菌屬（Caldalkalibacillus），豐度逐個(gè)降低。A1和A4中均以黃單胞菌屬（Xanthomonas）為優(yōu)勢菌屬，A2和A3中均以芽孢桿菌屬（Bacillus）為優(yōu)勢菌屬。秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，A2和A3火鍋蘸料中芽孢桿菌屬相對豐度無顯著性差異（P＞0.05），表明芽孢桿菌屬細(xì)菌類群在A2和A3火鍋蘸料中較為恒定。A1和A4火鍋蘸料中黃單胞菌屬相對豐度無顯著性差異（P＞0.05），表明黃單胞菌屬細(xì)菌類群在A1和A4火鍋蘸料中較為恒定。從圖4還可知，4個(gè)火鍋蘸料樣本間的菌屬組成存在一定差異性，可能原因?yàn)椴煌娣怒h(huán)境對此類產(chǎn)品細(xì)菌群落有一定影響。

圖4 genus水平所有樣本群落結(jié)構(gòu)分布圖

2.5 物種豐度熱圖

物種豐度聚類熱圖分析是通過顏色變化與相似程度反映表格中的數(shù)據(jù)信息，并呈現(xiàn)群落物種的組成信息，表明火鍋蘸料不同樣品間不同細(xì)菌屬的相對豐度及細(xì)菌組成的差異性和樣品間的相似性[20-21]。采用物種豐度聚類熱圖分析火鍋蘸料樣品中含量前11個(gè)菌屬和4個(gè)樣品之間的交互關(guān)系，見圖5。不同樣品間屬水平具有一定豐度，且各樣品的菌群組成具有一定差異性和相似性。同時(shí)，根據(jù)豐度聚類熱圖可以看出樣品間屬水平的聚類關(guān)系，即4組樣品均聚在一起，說明4組樣品間的豐度相似，其中A1和A4的相似度較高些，A2與A3的相似度較高些。

圖5 基于屬水平各樣品的物種豐度聚類熱圖

3 討論與結(jié)論

采用高通量測序?qū)?種不同處理方式火鍋蘸料的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)合豐度聚類熱圖和α多樣性進(jìn)行分析。測序4個(gè)樣本共得到142 398條有效數(shù)據(jù)，18 770個(gè)OTUs。通過高通量基因測序技術(shù)，對4種不同處理方式火鍋蘸料微生物的多樣性和豐度進(jìn)行鑒定，分析火鍋蘸料中可能影響火鍋蘸料品質(zhì)的菌株，為火鍋蘸料的安全生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。A1中主要的細(xì)菌類群為黃單胞菌屬（Xanthomonas）、凱斯特鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、未分類菌屬（Unclassified）及嗜熱嗜堿產(chǎn)芽孢桿菌屬（Caldalkalibacillus），豐度逐個(gè)降低；A2中依次為芽孢桿菌屬（Bacillus）、未分類菌屬（Unclassified）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、異桿菌屬（Allobacillus）、凱斯特鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）；A3則主要由芽孢桿菌屬（Bacillus）、未分類菌屬（Unclassified）、異桿菌屬（Allobacillus）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）組成；A4中主要的細(xì)菌類群為黃單胞菌屬（Xanthomonas）、凱斯特鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、未分類菌屬（Unclassified）、腸桿菌屬（Enterobacter）以及嗜熱嗜堿產(chǎn)芽孢桿菌屬（Caldalkalibacillus），豐度逐個(gè)降低。A1和A4中均以黃單胞菌屬（Xanthomonas）為優(yōu)勢菌屬，A2和A3中均以芽孢桿菌屬（Bacillus）為優(yōu)勢菌屬。這2種都是腐敗微生物，火鍋蘸料中含量超標(biāo)會(huì)對人體健康產(chǎn)生一定的影響。通過物種豐度聚類熱圖可以看出樣品間屬水平的聚類關(guān)系，即4組樣品均聚在一起，說明4組樣品間的豐度相似，其中A1和A4的相似度較高些，A2與A3的相似度較高些。在火鍋蘸料生產(chǎn)中，可根據(jù)這些微生物的生存特性對其進(jìn)行控制，通過鑒定火鍋蘸料中微生物組成，可以在生產(chǎn)中針對性地抑制有害微生物?；疱佌毫现写嬖谖⑸镂廴厩闆r，并存在致病風(fēng)險(xiǎn)。高通量測序比傳統(tǒng)平板培養(yǎng)微生物更加快速和全面獲得火鍋蘸料中的微生物群落特征信息。本研究實(shí)現(xiàn)對火鍋蘸料中有害菌的防治，提升加工水平，為工藝及設(shè)備改進(jìn)提供科學(xué)依據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)提高火鍋蘸料的品質(zhì)。