何劍川,付饒,鄒小康,陳明

1.四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,四川 成都 610041; 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,四川 成都 610072

慢性腎衰竭(chronic renal failure,CRF)是慢性腎病持續(xù)發(fā)展的最終結(jié)局,主要表現(xiàn)為內(nèi)環(huán)境失衡、代謝產(chǎn)物潴留及各系統(tǒng)癥狀,是各種原因?qū)е履I功能進(jìn)行性減退、代謝紊亂和臨床癥狀組成的綜合征[1]。CRF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,西醫(yī)治療手段有限,對(duì)患者的生命與生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響。祖國(guó)醫(yī)學(xué)并無(wú)“慢性腎衰竭”這一病名記載,現(xiàn)代醫(yī)家根據(jù)證候特點(diǎn)及臨床表現(xiàn),將其歸屬于“關(guān)格”“水腫” “腎勞”等范疇,認(rèn)為“本虛標(biāo)實(shí),虛實(shí)夾雜”是其基本病機(jī)[2],“補(bǔ)脾益腎、通腑泄?jié)帷笔瞧渲委煷蠓?。葉傳蕙教授基于此理論研發(fā)的具有扶正化瘀降濁功效的“腎康”廣泛應(yīng)用于臨床,已成為治療CRF的重要藥物[3]。陳明教授在“腎康”的基礎(chǔ)上,結(jié)合防治肝臟纖維化中使用“大黃蟲(chóng)丸”的經(jīng)驗(yàn),化裁出“通補(bǔ)并用、標(biāo)本兼施”的“扶正化瘀降濁通絡(luò)方”,該方以大黃、黃芪、熟地黃為君藥,丹參、紅花、酒水蛭、土鱉蟲(chóng)為臣藥,黃芩為佐藥,甘草為使藥,諸藥合用,達(dá)到健脾益腎、理氣固本、通腑泄?jié)岬哪康?。扶正化瘀降濁通絡(luò)方治療CRF療效確切,但尚未闡明其藥理學(xué)機(jī)制,值得深入研究。

在多學(xué)科理論的基礎(chǔ)上,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從不同角度分析藥物治療疾病的機(jī)制。該方法與中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)相契合[4],在中藥領(lǐng)域的研究中得到廣泛應(yīng)用。本研究擬采取該方法探索扶正化瘀降濁通絡(luò)方治療CRF的藥效成分、藥物靶點(diǎn)、信號(hào)通路等信息,為今后基礎(chǔ)研究提供大致方向。

1 資料與方法

1.1 篩選主要活性成分經(jīng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)[5-6]收集大黃、黃芪、熟地黃、丹參、紅花、黃芩、甘草的化學(xué)成分,設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類(lèi)藥性(drug-likeness,DL)≥0.18對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行篩選;通過(guò)TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)收集水蛭化學(xué)成分,利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)[7]“藥物-靶點(diǎn)”相似性模型,設(shè)置分?jǐn)?shù)截止點(diǎn)≥20,調(diào)整后P值≤0.05,篩選水蛭活性成分;通過(guò)檢索中國(guó)知網(wǎng)、維普網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)、PubMed、Web of Science等國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù),查閱土鱉蟲(chóng)活性成分相關(guān)文獻(xiàn),收集土鱉蟲(chóng)活性成分。結(jié)合PubChem、SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)活性成分分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證,將結(jié)果保存為mol2格式文件。

1.2 預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)登錄PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)[8],上傳活性成分相關(guān)結(jié)果,下載藥物靶點(diǎn)名稱(chēng)、蛋白庫(kù)編碼、擬合分?jǐn)?shù)等信息。擬合分?jǐn)?shù)用于評(píng)價(jià)活性成分與靶點(diǎn)的匹配度,分值越高,二者越匹配。為提高預(yù)測(cè)精度,靶點(diǎn)納入標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為擬合分?jǐn)?shù)≥3。將納入靶點(diǎn)的蛋白庫(kù)編碼整合到UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中,將其矯正為人類(lèi)相關(guān)蛋白編碼。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man,OMIM)[9-10]輸入關(guān)鍵詞“Chronic Renal Failure”檢索CRF相關(guān)靶點(diǎn),去重后構(gòu)建CRF靶點(diǎn)庫(kù)。將扶正化瘀降濁通絡(luò)方作用靶點(diǎn)與CRF靶點(diǎn)數(shù)據(jù)上傳Venny2.1.0進(jìn)行映射,交集靶點(diǎn)即為扶正化瘀降濁通絡(luò)方治療CRF的潛在靶點(diǎn),并繪制靶點(diǎn)韋恩圖。

1.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)分析,篩選自由度高于均值的靶點(diǎn)建立子網(wǎng)絡(luò),選取子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)1、節(jié)點(diǎn)2和綜合評(píng)分信息導(dǎo)入Gephi軟件[11],進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析和可視化分析。

1.4 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)將關(guān)鍵靶點(diǎn)、藥物活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件,建立“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),選取各藥物核心靶點(diǎn)度值排名前3位的活性成分作為核心成分。

1.5 富集分析將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號(hào)通路富集分析。

1.6 “信號(hào)通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將CRF相關(guān)通路與相應(yīng)靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建并分析“信號(hào)通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.7 “藥物-核心成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)整合研究所得有效信息,將藥物、核心化學(xué)成分、核心靶點(diǎn)及信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建并分析扶正化瘀降濁通絡(luò)方治療CRF的“藥物-核心成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集到大黃92個(gè)、黃芪87個(gè)、熟地黃76個(gè)、丹參202個(gè)、紅花189個(gè)、黃芩143個(gè)、甘草280個(gè)化學(xué)成分,利用OB≥30%、DL≥0.18篩選得到大黃16個(gè)、黃芪20個(gè)、熟地黃2個(gè)、丹參65個(gè)、紅花22個(gè)、黃芩36個(gè)、甘草92個(gè)主要活性成分;通過(guò) TCMID 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到水蛭活性成分35個(gè),利用BATMAN-TCM分析工具篩選得到主要活性成分15個(gè),其中2個(gè)活性成分未找到相對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn),通過(guò)分子結(jié)構(gòu)驗(yàn)證,最終篩選得到主要活性成分13個(gè);通過(guò)對(duì)已報(bào)道的土鱉蟲(chóng)活性成分進(jìn)行系統(tǒng)整理,搜集得到活性成分76個(gè),通過(guò)分子結(jié)構(gòu)驗(yàn)證,篩選得到主要活性成分50個(gè)。君藥大黃、黃芪、熟地黃的結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大黃、黃芪、熟地黃主要活性成分

2.2 潛在靶點(diǎn)合并重復(fù)項(xiàng),剔除假陽(yáng)性項(xiàng)后得到大黃1 360個(gè)、黃芪918個(gè)、熟地黃222個(gè)、丹參 1 404 個(gè)、紅花783個(gè)、黃芩916個(gè)、甘草1 589個(gè)、水蛭343個(gè)、土鱉蟲(chóng)757個(gè)作用靶點(diǎn),整合得到扶正化瘀降濁通絡(luò)方作用靶點(diǎn)2 263個(gè)。通過(guò)Genecards、OMIM構(gòu)建CRF靶點(diǎn)庫(kù),共涉及7 806個(gè)靶點(diǎn)。將二者進(jìn)行映射,篩選出潛在靶點(diǎn)635個(gè),見(jiàn)圖1。

圖1 潛在靶點(diǎn)VEEN圖

2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)包含635個(gè)節(jié)點(diǎn),3 414條邊,節(jié)點(diǎn)自由度均值為10.9。子網(wǎng)絡(luò)包含242個(gè)節(jié)點(diǎn),2 300條邊,節(jié)點(diǎn)自由度均值為19。子網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)自由度大于均值的關(guān)鍵靶點(diǎn)共130個(gè)。關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)包括130個(gè)節(jié)點(diǎn),1 320 條邊,平均節(jié)點(diǎn)自由度為20.3,靶點(diǎn)自由度為均值3倍以上的核心靶點(diǎn)共20個(gè),見(jiàn)表2、圖2。

表2 核心靶點(diǎn)匯總表

圖2 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)將關(guān)鍵靶點(diǎn)、藥物活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,建立“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。各藥物與關(guān)鍵靶點(diǎn)存在相互作用的活性成分分別為大黃16個(gè),黃芪20個(gè),熟地黃2個(gè),丹參57個(gè),紅花20個(gè),黃芩34個(gè),甘草91個(gè),水蛭7個(gè),土鱉蟲(chóng)41個(gè),結(jié)果見(jiàn)圖3。各君藥度值排名前3位的活性成分見(jiàn)表3。

表3 君藥治療慢性腎衰竭的核心成分匯總表

圖3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO富集分析GO富集分析共涉及662項(xiàng)生物功能,其中506項(xiàng)與關(guān)鍵靶點(diǎn)顯著相關(guān)(P<0.05),顯著相關(guān)項(xiàng)中包含分子功能98項(xiàng),細(xì)胞成分50項(xiàng),生物過(guò)程358項(xiàng)。按P值從低到高排序,取各類(lèi)別中排名前10位的生物功能進(jìn)行分析,見(jiàn)圖4。

圖4 GO富集分析

2.6 KEGG通路分析共涉及105條信號(hào)通路,與關(guān)鍵靶點(diǎn)顯著相關(guān)(P<0.05)的通路共96條。篩選出與CRF相關(guān)的20條關(guān)鍵信號(hào)通路進(jìn)行分析,見(jiàn)圖5。

圖5 KEGG通路分析

2.7 “信號(hào)通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)將相關(guān)通路與相應(yīng)靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件,構(gòu)建“信號(hào)通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),選取度值排名前10位的靶點(diǎn)進(jìn)行分析,見(jiàn)表4、圖6。

表4 “信號(hào)通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)排名前10位的靶點(diǎn)

圖6 “信號(hào)通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.8 “藥物-核心成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)將研究結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件,建立“藥物-核心成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖7。

圖7 “藥物-核心成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

君藥是方中不可或缺且藥力居首,針對(duì)主病或主證起主要治療作用的藥物,扶正化瘀降濁通絡(luò)方以大黃、黃芪、熟地黃為君,大黃性寒、味苦,有涼血解毒、瀉下攻積、逐瘀通經(jīng)等功效。大黃素甲醚二葡糖苷等蒽醌類(lèi)成分可能是大黃的核心藥效成分。CRF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,正虛是發(fā)病的基礎(chǔ),血瘀是主要病理改變,濁毒是疾病進(jìn)展的首因[12]。針對(duì)血瘀這一病理改變,大黃可通過(guò)改變機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)特征、改善局部微循環(huán)、預(yù)防血栓形成等藥理作用發(fā)揮逐瘀通經(jīng)的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,大黃可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體血管內(nèi)滲透壓的變化,使細(xì)胞外液重新分布,從而改善腎臟微循環(huán)、改變機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)特征[13]。西醫(yī)代謝產(chǎn)物潴留的概念與中醫(yī)的濁毒極其相似,濁毒既是機(jī)體內(nèi)積聚的病理產(chǎn)物,也是疾病發(fā)生發(fā)展的致病因素。大黃具有通利水谷、滌蕩胃腸的功效,可給邪出路,使?jié)岫緩亩憬?避免閉門(mén)留寇。大黃蒽醌類(lèi)活性成分能有效抑制結(jié)腸水通道蛋白的表達(dá),降低Na+-K+-ATP酶活性,從而增加腸道內(nèi)水含量,避免大便過(guò)于干燥;還對(duì)腸壁黏膜和肌內(nèi)神經(jīng)叢有刺激作用,增加結(jié)腸的蠕動(dòng)次數(shù),發(fā)揮瀉下作用[14-15]。此外,大黃素亦能增加輸尿管平滑肌的活性,降低腎髓質(zhì)基底膜側(cè)Na+-K+-ATP酶活性,起到通利小便的作用。因而可知,大黃蒽醌類(lèi)活性成分可通過(guò)瀉下攻積、逐瘀通經(jīng)等功效,對(duì)血瘀、濁毒等致病因素發(fā)揮治療作用。黃芪味甘、性溫,有補(bǔ)氣固表、利尿托毒等功效。本研究篩選得到20個(gè)黃芪主要成分,以黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、皂苷類(lèi)成分為主。黃芪總黃酮在體內(nèi)和體外均有免疫調(diào)節(jié)功能,能調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)在巨噬細(xì)胞中的表達(dá),抑制IL-6、腫瘤壞死因子等炎癥因子的分泌,起到抗炎作用[16],還能抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)表達(dá)、減輕炎癥反應(yīng)、抑制大量NO生成,從而減少腎臟系膜細(xì)胞增殖、防止ECM過(guò)度生成、減輕腎臟結(jié)構(gòu)損傷,延緩腎功能進(jìn)展[17-18]。本研究篩選得到豆甾醇、谷甾醇2個(gè)熟地黃主要成分,二者均與多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。此外,丹參、紅花、酒水蛭、土鱉蟲(chóng)等藥物中也有多個(gè)活性成分與多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系,表明扶正化瘀降濁通絡(luò)方治療CRF具有“多成分”“多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)。

扶正化瘀降濁通絡(luò)方治療CRF可能與凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程有關(guān),涉及胞外體、細(xì)胞外間隙、溶酶體等細(xì)胞成分,蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、受體結(jié)合等分子功能也參與其中。岳艷利等[19]使用不同濃度的黃芪總苷治療糖尿病小鼠發(fā)現(xiàn),黃芪總苷能通過(guò)下調(diào)糖尿病小鼠腎臟TGF-β1的表達(dá),進(jìn)而抑制 COL-Ⅳ等ECM主要組成部分的積聚,有效阻止腎功能損害的進(jìn)程。王杰[20]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),扶正化瘀降濁通絡(luò)方可抑制5/6腎切除大鼠腎組織TIMP-1的表達(dá)、促進(jìn)MMP9的表達(dá),使GBM堆積減少、COL-IV降解增加,發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。提示扶正化瘀降濁通絡(luò)方可能通過(guò)減少細(xì)胞凋亡、抑制ECM合成等機(jī)制延緩CRF的進(jìn)展。

整合PPI網(wǎng)絡(luò)與“相關(guān)通路-相應(yīng)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中重要靶點(diǎn)的信息發(fā)現(xiàn),靶點(diǎn)PIK3CA、AKT1、MAPK3、EGFR、VEGFA存在重疊,可能是該方治療CRF的首要靶點(diǎn)。KEGG通路分析結(jié)果表明:首要靶點(diǎn)主要涉及PI3K/Akt、HIF-1、VEGF、TGF-β、NF-κB、Toll-like、白細(xì)胞跨內(nèi)膜遷移、B細(xì)胞受體、T細(xì)胞受體等通路。其中,PI3K/Akt、HIF-1、VEGF、TGF-β等信號(hào)通路與調(diào)節(jié)腎臟纖維化進(jìn)程緊密相關(guān)。在梗阻型腎病大鼠的腎小管間質(zhì)中Akt、磷酸化Akt表達(dá)水平顯著上升[21],大黃可下調(diào)PI3K/Akt的表達(dá),減少大鼠腎間質(zhì)中成纖維細(xì)胞的增生、炎癥細(xì)胞的侵蝕,減慢纖維化速度[22-23]。在CRF發(fā)展過(guò)程中,HIF-1、VEGF等通路扮演著重要角色,組織缺氧可激活HIF-1、VEGF等信號(hào)通路,從而平衡纖維化調(diào)節(jié)因子的表達(dá),起到調(diào)控組織纖維化進(jìn)程的作用[24]。陳艷瓊[25]通過(guò)扶正化瘀降濁通絡(luò)方治療5/6腎切除大鼠研究發(fā)現(xiàn):與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腎臟組織VEGF的表達(dá)顯著降低,且與時(shí)間成反比,治療組大鼠VEGF顯著增高。提示該方能上調(diào)CRF大鼠VEGF的表達(dá),減少腎臟纖維化,延緩病程進(jìn)展。TGF-β可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、炎癥細(xì)胞募集與激活、ECM合成與沉積,導(dǎo)致腎臟纖維化[26]。何凱杰[27]通過(guò)5/6腎切除大鼠研究發(fā)現(xiàn),扶正化瘀降濁通絡(luò)方可調(diào)節(jié) TGF-β信號(hào)通路關(guān)鍵因子——降低Smurf 2表達(dá)水平、促進(jìn)Smad7表達(dá)水平改善5/6腎切除大鼠腎纖維化程度。

近年來(lái),大量研究揭示了CRF中腸道與腎臟之間的雙向作用關(guān)系,即“腸-腎軸”理論[28],為CRF的治療提供了新方向。腸道屏障受損是CRF“腸-腎軸”的核心環(huán)節(jié)。腸道免疫屏障中的Toll樣受體/核因子-κB(TLRs/NF-κB)信號(hào)通路既是腸道免疫屏障的組成部分,也是連接機(jī)械屏障及生物屏障的橋梁,該通路的激活可使腸道炎癥級(jí)聯(lián)放大[29]。Ren ZG等[30]研究證實(shí)CRF患者腸道菌群多樣性降低,硫酸吲哚酚、脂多糖、硫酸對(duì)甲酚等毒素增加,高水平的硫酸吲哚酚可激活腸上皮細(xì)胞TLRs/NF-κB通路,促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的生成并進(jìn)入循環(huán)導(dǎo)致全身炎癥和CRF的進(jìn)展,提示腸道黏膜免疫活化是誘導(dǎo)全身性微炎癥反應(yīng)和CRF進(jìn)展的重要病理機(jī)制,調(diào)控TLRs/NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)是糾正腸道黏膜免疫偏移、促進(jìn)腸道屏障功能修復(fù)、延緩CRF進(jìn)展的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn),扶正化瘀降濁通絡(luò)方除了與PI3K/Akt、HIF-1、VEGF、TGF-β等腎臟纖維化經(jīng)典通路密切相關(guān)外,還涉及NF-κB、Toll-like、B細(xì)胞受體、T細(xì)胞受體等炎癥和免疫相關(guān)的通路。這既是對(duì)扶正化瘀降濁通絡(luò)方治療CRF相關(guān)研究結(jié)果的一個(gè)佐證,也為該方更明確的機(jī)制研究提供了參考依據(jù)。結(jié)合“腸-腎軸”理論及相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展,扶正化瘀降濁通絡(luò)方能否通過(guò)重塑腸道菌群穩(wěn)態(tài),平衡腸腎免疫微環(huán)境而調(diào)控“腸-腎軸”以延緩CRF進(jìn)展呢?結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè),扶正化瘀降濁通絡(luò)方可能通過(guò)平衡腸道菌群失調(diào),調(diào)節(jié)TLRs/NF-κB信號(hào)通路的表達(dá),從而減輕腸道及全身炎癥反應(yīng),調(diào)控機(jī)體免疫功能,發(fā)揮腎臟保護(hù)作用,但該假說(shuō)有待進(jìn)一步多學(xué)科研究的驗(yàn)證。