李 紅,王 芳

唐山市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部,唐山 063000

膝痹康方劑來(lái)源于孫思邈的《千金翼方》中的蒼梧道士陳元膏,也被收錄于《千金要方》卷七,該方劑主要由當(dāng)歸、細(xì)辛、川芎、桂心、天雄、生地黃和白芷等中藥材組成,主治風(fēng)濕骨疼,具有活血化瘀、舒筋通絡(luò)、祛風(fēng)濕、止痹痛等多重功效。方劑中以當(dāng)歸和生地黃為君藥,以天雄、干姜、細(xì)辛、白芷為臣藥,具有活血化瘀、祛風(fēng)除濕、散寒止痛之功效。膝痹康被廣泛應(yīng)用于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis of the knee, KOA)的臨床治療[1],有臨床研究表明[2-3],膝痹康不僅能緩解KOA患者靜息時(shí)的疼痛,還能減輕關(guān)節(jié)壓痛和行走疼痛,并恢復(fù)膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度,緩解關(guān)節(jié)僵硬。研究人員進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn),從組織學(xué)、組織形態(tài)學(xué)以及細(xì)胞學(xué)均證實(shí)膝痹康能減輕KOA關(guān)節(jié)中的炎癥反應(yīng),減輕關(guān)節(jié)水腫、延緩關(guān)節(jié)炎的病情進(jìn)展[4-5]。傳統(tǒng)的制備方法較為復(fù)雜,不利于藥物的推廣和患者的使用,在繼承傳統(tǒng)制藥方法的基礎(chǔ)上,依據(jù)現(xiàn)代工藝進(jìn)行進(jìn)一步提取優(yōu)化,將膝痹康方劑開(kāi)發(fā)制成成方顆粒制劑,有助于該藥物的臨床應(yīng)用。本研究以膝痹康方劑為參比,對(duì)膝痹康顆粒的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,為中醫(yī)經(jīng)典名方的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀;色譜柱為Kromasil C18(200 mm×4.6 mm,5 μm)、Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);十萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒公司);FRQ-1002T超聲波處理器(法蘭特);島津UV-265 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品:無(wú)水葡萄糖(成都艾博克生物科技有限公司);地黃苷D(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.3%)、益母草苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%)、Z-藁本內(nèi)酯(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.5%)和毛蕊花糖苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.5%)均購(gòu)自成都普菲德生物有限公司;阿魏酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.8%,Sigma公司)。甲醇、乙腈為色譜純,均購(gòu)自默克公司;磷酸(分析純,天津永大化工有限公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。

當(dāng)歸(批號(hào)211201)、細(xì)辛(批號(hào)200813)、川芎(批號(hào)201112)、桂心(批號(hào)211015)、天雄(批號(hào)200806)、生地黃(批號(hào)210905)、白芷(批號(hào)210506)等飲片均購(gòu)自嘉興東方國(guó)藥飲片有限公司,飲片經(jīng)唐山市中醫(yī)醫(yī)院趙衛(wèi)主任醫(yī)師鑒定,均符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)中的相關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)膝痹康方劑的制備

膝痹康方劑的中藥處方:當(dāng)歸50 g,細(xì)辛50 g,桂心50 g,天雄30枚,生地黃1 500 g,白芷75 g,川芎50 g,丹砂100 g,干姜125 g,烏頭150 g,松脂400 g。將諸藥粉碎成細(xì)末,在體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中浸泡24 h,將沉渣過(guò)濾,將提取液倒入鍋中加熱,加熱濃縮至稠浸膏(含水量約為40%～60%),并加入凡士林,待凡士林融化后停止加熱,待冷卻后,即得。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)膝痹康方劑成分檢測(cè)

2.2.1揮發(fā)油提取率檢測(cè) 提取方法參考2020年版《中國(guó)藥典》。取上述藥材,置于圓底燒瓶中,加入適量蒸餾水,室溫浸泡2 h,加熱至沸騰并保持微沸5 h,讀取揮發(fā)油測(cè)定器中揮發(fā)油的量。

2.2.2糖苷檢測(cè) 檢測(cè)地黃苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷3種苷類的含量。色譜條件:Kromasil100-5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相乙腈(A)-水(B)梯度洗脫(0～15 min,3%～8% A; 15.01～30 min,20%～28% A),檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為10 μL,理論塔板數(shù)不低于5 000,與相鄰組分峰的分離度均大于1.5。

對(duì)照品溶液的制備:用甲醇制成每1 mL 含地黃苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷100 μg的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備:揮發(fā)油提取結(jié)束后,減壓蒸餾定容至50 mL,再取2 mL揮發(fā)晾干,用甲醇溶解并定容至10 mL,用0.22 μm濾膜過(guò)濾。

精密吸取上述對(duì)照品溶液稀釋至不同質(zhì)量濃度,以色譜峰面積對(duì)對(duì)照品質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示,地黃苷D對(duì)照品在3.0～335.0 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y1=995.7x1+24.27,R2=0.999。益母草苷對(duì)照品在7.3～200.0 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y2=85.09x2- 6.962,R2=0.998。毛蕊花糖苷對(duì)照品在5.5～188.0 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y3=101.6x3-46.88,R2=0.998。

精密度實(shí)驗(yàn):精密吸取上述同一供試品溶液并連續(xù)進(jìn)樣6次,地黃苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷峰面積測(cè)定值的RSD值分別為1.15%、1.23%、1.16%,表明精密度良好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn):從同一方劑中取6份藥材,并制備供試品溶液,進(jìn)樣檢測(cè),地黃苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷的RSD值分別為2.21%、1.44%、1.56%,表明重復(fù)性良好。

回收率實(shí)驗(yàn):從同一方劑中取6份藥材,并制備供試品溶液,精密量取并加入對(duì)照品,計(jì)算回收率,地黃苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷的平均加樣回收率分別為99.17%、97.97%、104.87%,RSD值分別為3.46%、4.04%、1.83%。

根據(jù)回歸方程計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)膝痹康方劑中地黃苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷的含量,結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)膝痹康方劑各成分測(cè)定結(jié)果

注:A.對(duì)照品;B.供試品;1.地黃苷D;2.益母草苷;3.毛蕊花糖苷。

2.2.3總多糖檢測(cè) 配制質(zhì)量濃度為300 μg·mL-1的葡萄糖對(duì)照品溶液,分別稀釋至不同質(zhì)量濃度。每管加入1 mL 50 mL·L-1苯酚溶液(臨用現(xiàn)配),加入5 mL濃硫酸,搖勻,在490 nm處測(cè)定吸光度值,得回歸方程y4=1.1x4+0.126,R2=0.999。精密量取供試品溶液1 mL,在上述條件下測(cè)定吸光度值,并根據(jù)回歸方程計(jì)算總多糖的含量,結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.4阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯檢測(cè) 色譜條件:色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm ,5 μm)。流動(dòng)相B為乙腈,流動(dòng)相A為1 mL·L-1磷酸水溶液,0～15 min,5%～35% B;15～30 min,35%～70% B;30～40 min,70%～95% B。流速為1 mL·min-1;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm。理論塔板數(shù)均大于5 000,與相鄰組分峰的分離度均大于1.5,結(jié)果見(jiàn)圖2。

注:A.對(duì)照品;B.供試品;1.阿魏酸;2.Z-藁本內(nèi)酯。

對(duì)照品溶液的制備:用甲醇溶解制成每1 mL含100 μg阿魏酸、1 mgZ-藁本內(nèi)酯的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備:精密量取膝痹康標(biāo)準(zhǔn)方劑湯液10 mL,蒸干后將其轉(zhuǎn)移至量瓶中,加入50 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇,混勻后離心,吸取上清液2 mL,用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),并用甲醇稀釋至10 mL。

精密吸取上述對(duì)照品溶液,稀釋至不同質(zhì)量濃度,以色譜峰面積為縱坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示,阿魏酸對(duì)照品在4.8～168.8 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y5=102.1x5+88.23,R2=0.999;Z-藁本內(nèi)酯對(duì)照品在2.2～155.2 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y6=101.4x6+1.265,R2=0.999。

精密度實(shí)驗(yàn):精密吸取上述同一供試品溶液并連續(xù)進(jìn)樣6次,阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯峰面積測(cè)定值的RSD值分別為1.88%、2.26%,表明精密度良好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn):從同一方劑中取6份藥材,并制備供試品溶液,進(jìn)樣檢測(cè),阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯的RSD值分別為3.44%、1.72%,表明重復(fù)性良好。

回收率實(shí)驗(yàn):從同一方劑中取6份藥材,并制備供試品溶液,精密量取并加入對(duì)照品,計(jì)算回收率,阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯的平均加樣回收率分別為101.36%、97.75%,RSD值分別為 1.94%、1.72%。

根據(jù)回歸方程計(jì)算供試品溶液中阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯的含量,結(jié)果見(jiàn)圖2、表1。

2.2.5浸膏得率計(jì)算 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)湯液10 mL,分別置于已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿,蒸干,于105 ℃烘3 h,取出,置于玻璃干燥器中冷卻后稱質(zhì)量,計(jì)算浸膏得率,結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 提取工藝優(yōu)化

2.3.1揮發(fā)油提取 取方劑中富含揮發(fā)油的藥材(包括當(dāng)歸、細(xì)辛、白芷、干姜)進(jìn)行揮發(fā)油提取,提取方法參考2020年版《中國(guó)藥典》:取上述藥材,置于圓底燒瓶中,加入適量蒸餾水,室溫浸泡2 h,加熱至沸騰并保持微沸5 h,讀取揮發(fā)油測(cè)定器中揮發(fā)油的得量。

按處方比例,取當(dāng)歸50 g、細(xì)辛50 g、白芷75 g、干姜25 g混勻,擬定A加水量(8、10、12倍)、B浸泡時(shí)間(30、60、90 min)、C提取時(shí)間(3、6、9 h)3個(gè)影響因素。根據(jù)L9(34)正交表進(jìn)行揮發(fā)油提取實(shí)驗(yàn)。揮發(fā)油提取率(%)=[揮發(fā)油量(mL)/原材料的量(g)]×100%。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析結(jié)果表明,C因素(提取時(shí)間)為影響揮發(fā)油提取的顯著因素(P<0.05),A和B因素均為非顯著因素(P>0.05),因此將A1B1C3作為最佳提取條件,即8倍水浸泡30 min、提取9 h。稱取3份藥材,按上述最佳條件進(jìn)行工藝驗(yàn)證,揮發(fā)油的得量分別為1.12、1.15、1.14 mL,RSD值為1.34%,表明該工藝較為穩(wěn)定。揮發(fā)油提取工藝正交實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表2。

表2 揮發(fā)油提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2活性成分提取 先按照最佳工藝條件將處方飲片中的揮發(fā)油提出,再將藥渣晾干與處方中剩余飲片合并,擬定A乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、70%、90%)、B溶劑倍數(shù)(5、7、9倍)、C提取時(shí)間(1、2、3 h)3個(gè)影響因素,根據(jù)L9(34)正交表進(jìn)行工藝優(yōu)化回流提取實(shí)驗(yàn),微沸提取,提取結(jié)束后減壓蒸餾、濃縮并定容至50 mL量瓶中,再精密吸取2 mL此濃縮提取液置于蒸發(fā)皿中,揮發(fā)晾干,再次加入2 mL甲醇溶解并定容至10 mL,搖勻后用0.22 μm濾膜過(guò)濾。然后分別用2.2項(xiàng)下方法檢測(cè)地黃苷D 、益母草苷、毛蕊花糖苷、總多糖、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯的含量并計(jì)算浸膏得率(%)。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3,方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表3、表4可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑倍數(shù)和提取時(shí)間均為影響結(jié)果的主要因素(P<0.05),隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑倍數(shù)和提取時(shí)間的增加,提取得到的各種活性物質(zhì)的含量均呈增加的趨勢(shì),但是K2-K1>K3-K2,表明水平2與水平3之間各指標(biāo)的結(jié)果相差較小,乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑倍數(shù)和提取時(shí)間均選擇水平2,確定的條件為A2B2C2,即加入7倍體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇提取2 h。稱取3份藥材,按上述最佳條件進(jìn)行工藝驗(yàn)證,提取得到的地黃苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、總多糖、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯的含量及浸膏得率均較為穩(wěn)定,表明該工藝較為穩(wěn)定,見(jiàn)表5。

表3 活性成分提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 提取工藝確定

取當(dāng)歸、細(xì)辛、白芷、干姜混勻,加入8倍水浸泡30 min、提取9 h,揮發(fā)油提取結(jié)束后,將藥渣晾干與處方中剩余飲片合并,加入7倍體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇,回流提取2 h,減壓蒸餾、濃縮,凍干。

3 討論

以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為參比開(kāi)展對(duì)經(jīng)典中藥方劑工藝的研發(fā)是當(dāng)今中醫(yī)藥研究的趨勢(shì),綜合比較各種有效成分指標(biāo)是評(píng)估現(xiàn)代工藝常用的重要手段之一。本研究根據(jù)古方典籍《千金翼方》中的記載,測(cè)定膝痹康方劑的主要有效成分,并與優(yōu)化提取工藝進(jìn)行對(duì)比研究。揮發(fā)油是中藥配方特別是外用膏劑配方中的重要有效成分,揮發(fā)油中含有多種芳香物質(zhì),是外用膏劑通過(guò)皮膚給藥的主要有效成分,揮發(fā)油的含量是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[6-8]。現(xiàn)代藥理研究表明[9-10],當(dāng)歸、白芷、細(xì)辛和干姜均富含揮發(fā)油,因此本研究在進(jìn)行活性成分提取前,先用水提法對(duì)方劑中的揮發(fā)油進(jìn)行提取。參照《中國(guó)藥典》,水提法是提取揮發(fā)油的主要方法,提取時(shí)間是影響揮發(fā)油得率的最主要因素[11],本研究確定揮發(fā)油最佳的提取條件是加入8倍量水浸泡30 min、提取9 h。

張海鳴等[12]報(bào)道橘紅揮發(fā)油最佳提取工藝條件為10倍量水、浸泡30 min、提取8 h。肖宇等[13]報(bào)道生姜艾葉洗劑揮發(fā)油最佳提取工藝條件為4倍量水、浸泡30 min、提取2次、每次3.5 h。本研究的工藝用水量、浸泡時(shí)間和提取時(shí)間可行。除了揮發(fā)油以外,當(dāng)歸、生地黃、細(xì)辛、川芎、桂心、天雄、白芷等藥材中的藥效成分主要為苷類、多糖類、有機(jī)酸類,地黃苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷是地黃中的主要有效成分[14-16],阿魏酸是主要的有機(jī)酸成分[17],Z-藁本內(nèi)酯[18-19]是當(dāng)歸中的有效化學(xué)成分,浸膏得率可反映處方提取物的量[20],因此本研究選用上述指標(biāo)對(duì)提取工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)。

目前關(guān)于膝痹康顆粒現(xiàn)代提取工藝的研究非常少,本研究采用正交實(shí)驗(yàn)法分別對(duì)揮發(fā)油及活性成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。水提法是揮發(fā)油的標(biāo)準(zhǔn)提取方法,經(jīng)過(guò)正交實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)只有提取時(shí)間為影響揮發(fā)油提取量的關(guān)鍵因素,確定最佳的揮發(fā)油提取條件為8倍水、浸泡30 min、提取9 h。在提取完揮發(fā)油后,再用乙醇回流提取法對(duì)有效成分的提取進(jìn)行優(yōu)化,乙醇是苷類、有機(jī)酸、多糖類的有效溶劑,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取條件為加入7倍體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇提取2 h,并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)方劑比較,優(yōu)化工藝的揮發(fā)油、地黃苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、總多糖、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯和浸膏得率均更高,且工藝穩(wěn)定,可獲得穩(wěn)定的揮發(fā)油和凍干粉末顆粒。