張巧真,丁雅楠,顧豐穎,郭芹,屈陽,李甜,王鋒,王強(qiáng)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100193)

面條是我國(guó)的傳統(tǒng)主食,每年大約有40%的小麥粉用于制作面條[1],面條種類繁多,根據(jù)不同的生產(chǎn)工藝可以分為生面條和熟面條兩大類,熟面條中的即食濕面,也稱為L(zhǎng)L面(long life noodles)、方便濕面、保鮮濕面、濕法方便面等,是一種經(jīng)真空和面、熟化、壓延、切條、蒸煮、水洗、酸浸、包裝、巴氏殺菌等工藝制備而成開袋即食的熟濕面。即食濕面因水分含量高于60%,會(huì)造成微生物快速繁殖,導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗,因此工業(yè)化生產(chǎn)中主要采用乳酸或其他有機(jī)酸浸泡提高面條的酸度,從而達(dá)到抑制微生物的生長(zhǎng)和延長(zhǎng)貨架期的目的[2]。即食濕面因其含水量高、非油炸、口感爽滑筋道、攜帶和食用方便、保質(zhì)期長(zhǎng)等特點(diǎn)逐漸受到消費(fèi)者的青睞,但生產(chǎn)加工中高濃度有機(jī)酸保鮮處理后的面條往往有明顯的酸味,部分消費(fèi)者難以接受,影響乳酸保鮮即食濕面的市場(chǎng)推廣。降低面條酸度、提升口感,是酸性乳酸保鮮即食濕面的產(chǎn)業(yè)化需求。

目前,乳酸等有機(jī)酸保鮮即食濕面的相關(guān)研究主要集中在其對(duì)即食濕面品質(zhì)和保質(zhì)期的影響上,對(duì)于乳酸保鮮即食濕面致腐微生物的研究較少,乳酸處理后即食濕面的保質(zhì)期明顯延長(zhǎng),但對(duì)其感官屬性存在一定的負(fù)面影響[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致熟面腐敗的細(xì)菌菌群主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)和類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)[5],通過對(duì)分離菌株的形態(tài)學(xué)和生化鑒定獲得了多株自制即食濕面中的主要致腐微生物(枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌)[6],但目前研究未對(duì)傳統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)乳酸保鮮即食濕面中腐敗菌鑒定到種水平,其生長(zhǎng)特性尚不清楚。

本研究對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)乳酸保鮮即食濕面中的致腐微生物進(jìn)行多樣性分析,結(jié)合傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法,通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定獲得乳酸保鮮即食濕面中的降酸致腐優(yōu)勢(shì)菌種,同時(shí)研究其生長(zhǎng)特性。旨在明確降低酸性乳酸保鮮即食濕面中的優(yōu)勢(shì)致腐微生物及其生長(zhǎng)特性,為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)中針對(duì)目標(biāo)菌株對(duì)酸性乳酸保鮮即食濕面采取降酸處理,避免酸度較大影響面條口感,同時(shí)也為開發(fā)新的防腐保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 乳酸保鮮即食濕面樣品

從企業(yè)生產(chǎn)線采取在常溫條件下貯藏7 d后的低酸性(pH 5.0～5.5)和酸性(pH 3.6～4.0)乳酸保鮮即食濕面各5袋。降酸后腐敗的低酸性乳酸保鮮即食濕面分為未液化區(qū)域(jgs-1,菌落總數(shù)2.1×104CFU/g)和液化區(qū)域(jgs-2,菌落總數(shù)1.1×107CFU/g),酸性乳酸保鮮即食濕面未腐敗,不作區(qū)分(jgs-3,菌落總數(shù)<10 CFU/g)。

a-低酸性;b-酸性圖1 乳酸保鮮即食濕面Fig.1 Lactic acid preservative instant wet noodles

1.1.2 試劑

瓊脂粉,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;NaCl、鹽酸,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;革蘭氏染色液,常德比克曼生物科技有限公司;脫纖維綿羊血,上海源葉生物科技有限公司;PCR擴(kuò)增試劑與合成擴(kuò)增引物,上海生工生物工程股份有限公司。

葡萄糖胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(dextrose tryptophan agar, DTA)(g/L):胰酪蛋白胨10.0,葡萄糖5.0,瓊脂15.0,溴甲酚紫0.04,pH 6.7±0.1;平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(plate count agar, PCA)(g/L):胰蛋白胨5.0,酵母浸粉2.5,葡萄糖1.0,瓊脂15.0,pH 7.0±0.2;胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(trypticase soy broth, TSB)(g/L):胰蛋白胨17.0,大豆蛋白胨3.0,NaCl 5.0,磷酸氫二鉀2.5,葡萄糖2.5,pH 7.3±0.2;胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(tryptic soy agar, TSA)(g/L):TSB培養(yǎng)基中加入瓊脂15.0,pH 7.3±0.2。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-CJ-1N醫(yī)用型潔凈工作臺(tái),北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;SHP-300生化培養(yǎng)箱,常州普天儀器制造有限公司;LS-50HD立式壓力蒸汽滅菌器,江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;Leica DM500顯微鏡,徠卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司;SHZ-28A水浴恒溫振蕩器,太倉市豪誠實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;ME104E/02電子天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司;PB-10型pH計(jì),賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司;3-30 K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),德國(guó)SIGMA離心機(jī)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸保鮮即食濕面工業(yè)化生產(chǎn)工藝流程

乳酸保鮮即食濕面工業(yè)化生產(chǎn)工藝流程如下:

原輔料(小麥粉、醋酸酯淀粉、谷朊粉、食用鹽等)→真空和面→熟化→復(fù)合逐級(jí)壓延→切條→蒸面→切面→煮面→水洗→乳酸浸泡→瀝水→包裝→巴氏殺菌→冷卻→成品

1.3.2 微生物多樣性分析

DNA的提取:采用OMEGA土壤DNA試劑盒(M5635-02)提取樣品中生物的總基因組DNA,采用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定提取DNA的濃度和純度。

PCR擴(kuò)增及測(cè)序:細(xì)菌采用16S rDNA基因V3～V4區(qū)引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-TCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),真菌采用ITS序列V1區(qū)引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物使用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。采用QIIME2(2019.4)軟件的DADA2方法對(duì)序列進(jìn)行去引物、降噪等,并采用NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果對(duì)序列進(jìn)行物種分類學(xué)注釋。通過對(duì)物種的序列數(shù)量(絕對(duì)豐度值)進(jìn)行百分比統(tǒng)計(jì)獲得各分類學(xué)水平上不同物種基因的相對(duì)豐度。

1.3.3 優(yōu)勢(shì)菌的分離純化

取樣品25 g充分碾磨,加入225 mL無菌水,取0.1 mL逐級(jí)稀釋不同濃度梯度的稀釋液,涂布于DTA培養(yǎng)基上,37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。挑取不同菌落形態(tài)的單一菌落,以平板劃線法分離純化獲得分離菌株[7]。

1.3.4 分離菌的形態(tài)學(xué)觀察

將分離菌株劃線接種到PCA培養(yǎng)基上于37 ℃培養(yǎng)觀察單菌落的形態(tài)特征,并進(jìn)行革蘭氏染色,通過光學(xué)顯微鏡觀察菌體及芽孢形態(tài)[8]。

1.3.5 分離菌的分子生物學(xué)鑒定

采用改良CTAB法提取DNA,采用細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)16S rRNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件和體系見參考文獻(xiàn)[7]。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收純化,使用測(cè)序儀ABI3730-XL進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交NCBI GenBank用BLAST進(jìn)行相似性檢索和同源性比對(duì)。利用MEGA-X軟件,采用基于Kimura 2-parameter模型的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)化樹分支穩(wěn)定性用Bootstrap分析,重復(fù)1 000次。

1.3.6 分離菌的生長(zhǎng)特性研究

1.3.6.1 溶血特性

將分離菌株劃線接種于TSA血瓊脂平板上,在37 ℃培養(yǎng)48～60 h,觀察細(xì)菌的溶血能力[9]。

1.3.6.2 需氧特性

將分離菌株劃線接種于TSA培養(yǎng)基上,分別采用厭氧袋厭氧培養(yǎng)和普通需氧培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)48 h觀察平板上微生物的生長(zhǎng)狀況。

1.3.6.3 耐酸特性

用鹽酸調(diào)節(jié)TSB培養(yǎng)基使pH值分別為2.40、3.03、3.50、4.03、4.54、5.04、5.71、6.82、7.33,加入1%不同分離菌的菌懸液(約為107CFU/mL)于10 mL TSB的玻璃試管中,在37 ℃培養(yǎng)48～60 h,記錄微生物的生長(zhǎng)狀況[10]。

1.3.6.4 耐鹽特性

將分離菌株劃線接種于含有0.5%、2%、5%、10%、12%、14%、20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的TSA培養(yǎng)基上,在37 ℃培養(yǎng)48～60 h,記錄微生物的生長(zhǎng)狀況[11]。

1.3.6.5 耐熱特性

將分離菌株接種于TSB培養(yǎng)基中,37 ℃下培養(yǎng)48～60 h,經(jīng)8 000×g、4 ℃離心10 min,收獲菌體。產(chǎn)芽孢菌在80 ℃水浴25 min,殺滅營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞,其他菌不經(jīng)水浴。將菌體(芽孢)重新懸浮在無菌水中,濃度約為107CFU/mL,將收集的菌在100 ℃下加熱5 min,測(cè)定熱處理后的菌落總數(shù),以水浴后菌落存活率作為衡量各菌株耐熱力的指標(biāo)[12]。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用IBM SPSS Statistics 23、MEGA-X軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,利用Origin 2018軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物多樣性組成譜分析

基于高通量測(cè)序技術(shù)分別分析樣品中真菌和細(xì)菌群落的組成,結(jié)果顯示,乳酸保鮮即食濕面3種樣品的真菌群落均以子囊菌門(Ascomycota)為主(>70%),屬間物種多樣性豐富,但占比較小,樣品間真菌群落組成差異不大,不是主要腐敗微生物(圖2)。圖3顯示,3種樣品中細(xì)菌群落組成存在較大差異,jgs-1與jgs-3中的細(xì)菌群落均以變形菌門(Proteobacteria)為主(>90%),而在腐敗液化即食濕面jgs-2中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的為厚壁菌門(Firmicutes)的芽孢桿菌(Bacillus),相對(duì)豐度達(dá)90.93%。說明芽孢桿菌為低酸性乳酸保鮮即食濕面腐敗的主要致腐微生物。真菌和細(xì)菌微生物主要來源于小麥粉等生產(chǎn)原料和加工過程[13],即食濕面生產(chǎn)采用的蒸煮、巴氏殺菌等熱處理工藝容易使不耐熱的真菌及變形菌門細(xì)菌失活,耐熱性較強(qiáng)的厚壁菌門細(xì)菌可能逃脫系列熱處理存活下來,需要進(jìn)一步乳酸處理抑制其生長(zhǎng)。這與張婉[5]的研究結(jié)果類似,芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)和類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)等厚壁菌門細(xì)菌被認(rèn)為是經(jīng)熱處理熟面條的主要腐敗菌。

a-門水平;b-屬水平圖2 乳酸保鮮即食濕面中真菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig.2 Distribution of fungal community structure of lactic acid preservative instant wet noodles

a-門水平;b-屬水平圖3 乳酸保鮮即食濕面中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig.3 Distribution of bacterial community structure of lactic acid preservative instant wet noodles

2.2 分離菌的形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 分離菌的形態(tài)學(xué)觀察

采用傳統(tǒng)分離純化法從3個(gè)樣品中共分離獲得6株菌。其菌落形態(tài)特征如圖4和表1所示。從低酸性腐敗即食濕面jgs-1和jgs-2中分離出的5株菌中有4株均為菌落形態(tài)相近的產(chǎn)芽孢菌,1株為無芽孢革蘭氏陽性菌。從酸性即食濕面jgs-3中分離出1株不產(chǎn)芽孢的革蘭氏陰性菌。

表1 六株細(xì)菌菌落形態(tài)特征描述Table 1 The morphological characterizations of 6 strains of bacteria

圖4 六株細(xì)菌在PCA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征Fig.4 Colony morphology of 6 strains of bacteria on PCA culture medium注:A1～A3分離自jgs-2,B1、B2分離自jgs-1,C1分離自jgs-3(下同)

2.2.2 分離菌的分子生物學(xué)鑒定

序列比對(duì)結(jié)果(表2)顯示,A1、A2、A3和B1與Bacillusamyloliquefaciensstrain BCRC 11601的同源性為99.79%～100.00%,結(jié)合菌落特征鑒定為解淀粉芽孢桿菌;B2與Peribacillusfrigoritoleransstrain DSM 8801的同源性達(dá)99.93%,被鑒定為耐寒短桿菌?；诨蚪M學(xué),因與芽孢桿菌屬菌株具有較高的同源性,2020年耐寒短桿菌被劃分為芽孢桿菌屬,之前曾隸屬于短桿菌屬(Brevibacterium)[14-15],為不生孢的革蘭氏陽性菌;C1與Pantoeasp.strain Glg 21具有99.93%的同源性,結(jié)合菌落特征初步鑒定為泛菌屬細(xì)菌。

表2 NCBI Blast結(jié)果Table 2 Result of NCBI Blast

本研究采用高通量測(cè)序分析微生物多樣性結(jié)合傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法[16]鑒定出導(dǎo)致降酸處理的低酸性乳酸保鮮即食濕面腐敗液化的優(yōu)勢(shì)致腐微生物為芽孢桿菌屬中的解淀粉芽孢桿菌(圖5),作為枯草芽孢桿菌近緣種群,可產(chǎn)生多種淀粉酶和蛋白酶[17-18],分解面條中的淀粉和蛋白質(zhì),從而導(dǎo)致面條的液化現(xiàn)象。酸性乳酸保鮮即食濕面中的活菌數(shù)量極少,經(jīng)多次分離培養(yǎng)只分離出1株與變形菌門中泛菌屬同源性相近的菌株C1,這表明高酸度能夠很好地抑制腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖并具有一定的殺滅作用,嚴(yán)格控制生產(chǎn)原料和環(huán)境條件中芽孢桿菌、變形菌群等微生物的混入和污染有利于保障產(chǎn)品質(zhì)量安全。

圖5 基于16S rDNA序列基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequence genes

2.3 分離菌的生長(zhǎng)特性

2.3.1 溶血特性

具有溶血特性的細(xì)菌具有致病性的可能性較高。溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示,6株分離菌菌落周圍均未見溶血環(huán)(圖6),說明它們均不具有溶血能力。該產(chǎn)品在加工過程中受溶血性致病菌污染的可能性較小,具有溶血能力的細(xì)菌在生產(chǎn)過程中可能易被酸和(或)熱處理殺滅。

圖6 六株細(xì)菌的溶血性測(cè)定Fig.6 Hemolytic assay of 6 strains of bacteria

2.3.2 需氧特性

表3結(jié)果顯示,耐寒短桿菌B2在厭氧條件下生長(zhǎng)受到明顯抑制,為需氧菌;其他菌株在厭氧條件下可生長(zhǎng)但生長(zhǎng)速度較慢,均為兼性好氧菌。4株解淀粉芽孢桿菌A1、A2、A3、B1在厭氧環(huán)境中仍可產(chǎn)生芽孢和黏液。乳酸保鮮即食濕面工業(yè)化生產(chǎn)中主要采用有氧包裝,為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了有利條件,若采取無氧或充氮包裝將有利于減緩多數(shù)微生物的生長(zhǎng)繁殖,但無法阻止解淀粉芽孢桿菌腐敗產(chǎn)生的面條液化現(xiàn)象。

表3 六株細(xì)菌的需氧特性Table 3 Aerobic characteristics of 6 strains of bacteria

2.3.3 耐酸特性

表4結(jié)果顯示,A1、A2、A3和B1解淀粉芽孢桿菌在pH<4.70時(shí)生長(zhǎng)均受到明顯抑制,與YING等[19]分離出的解淀粉芽孢桿菌最小耐受pH 4.0接近;耐寒短桿菌B2在pH<6.75時(shí)生長(zhǎng)受到抑制,耐酸性較弱;泛菌屬菌株C1是從未腐敗酸性乳酸保鮮即食濕面中分離出的菌株,耐酸性較強(qiáng)。未腐敗酸性乳酸保鮮即食濕面pH值為3.6～4.0,此時(shí)乳酸對(duì)芽孢桿菌、耐寒短桿菌等腐敗菌具有較好的抑制作用;當(dāng)降酸乳酸保鮮即食濕面獲得較適宜的口感酸度時(shí),pH值為5.0～5.5,酸抑制對(duì)部分腐敗菌有效,但由于解淀粉芽孢桿菌的適宜生長(zhǎng)pH值為5.0～9.0[18],無法完全抑制這些優(yōu)勢(shì)致腐菌的生長(zhǎng)繁殖,需增加其他針對(duì)性保鮮手段加以控制。

表4 六株細(xì)菌的耐酸特性Table 4 Acid tolerance of 6 strains of bacteria

2.3.4 耐鹽特性

表5結(jié)果顯示,從乳酸保鮮即食濕面中分離出的4株解淀粉芽孢桿菌抗鹽能力較強(qiáng),可耐受鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%,比其他樣品中分離出的解淀粉芽孢桿菌[19-20]具有更高的耐鹽能力。耐寒短桿菌和泛菌屬細(xì)菌的耐鹽能力較弱,僅耐受5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。乳酸保鮮即食濕面生產(chǎn)加工中添加食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)不超過5%,對(duì)分離菌的生長(zhǎng)并無抑制作用。

表5 六株細(xì)菌的耐鹽特性Table 5 Salt tolerance of 6 strains of bacteria

2.3.5 耐熱特性

表6結(jié)果顯示,本研究中分離菌解淀粉芽孢桿菌芽孢的抗逆性較強(qiáng),在100 ℃下加熱處理5 min時(shí)存活率為84.99%～92.71%,乳酸保鮮即食濕面加工生產(chǎn)中的蒸煮工藝不能使其徹底失活。LARSEN等[12]在對(duì)解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等10個(gè)分離物種的芽孢耐熱性研究中發(fā)現(xiàn),100 ℃處理5～10 min解淀粉芽孢桿菌芽孢的耐熱性最強(qiáng),與本研究的結(jié)果一致。耐寒短桿菌呈桿狀不易產(chǎn)芽孢[21],因此在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48～60 h,100 ℃加熱處理5 min已完全失活。泛菌屬菌株為非芽孢桿菌,耐熱性較差。優(yōu)勢(shì)分離菌解淀粉芽孢桿菌芽孢的耐熱性較強(qiáng),工業(yè)化生產(chǎn)中蒸煮工藝和巴氏殺菌不能使其徹底失活。若要降低生產(chǎn)加工中酸味劑的使用以及在不升高殺菌溫度的前提下,減少對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響,針對(duì)抗逆性較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)致腐菌解淀粉芽孢桿菌開發(fā)新的防腐保鮮技術(shù)十分必要。

表6 六株細(xì)菌的耐熱特性Table 6 Heat tolerance of 6 strains of bacteria

3 結(jié)論

本研究對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)乳酸保鮮即食濕面中的致腐微生物進(jìn)行了多樣性分析,結(jié)合傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法,通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定獲得了乳酸保鮮即食濕面中的降酸致腐優(yōu)勢(shì)菌種,同時(shí)研究了其生長(zhǎng)特性。結(jié)果表明降酸處理導(dǎo)致乳酸保鮮即食濕面腐敗液化的優(yōu)勢(shì)微生物是芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌。4株分離菌株解淀粉芽孢桿菌均為非溶血性的兼性好氧菌,抗逆性較強(qiáng),最大耐受pH值為4.70,最大耐鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%,100 ℃熱處理5 min芽孢存活率為84.99%～92.71%。本研究為乳酸保鮮即食濕面關(guān)鍵致腐微生物的控制及低酸性乳酸保鮮即食濕面新產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。