石志嬌,韋桂芳,何旭華,徐涵,彭小偉,闞歡,2*,劉云,2*

1(西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,云南 昆明,650224) 2(云南省高校大健康類森林資源開發(fā)利用工程研究中心,云南 昆明,650224)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)又稱黑果花楸、野櫻莓、不老莓,為薔薇科腺肋花楸屬落葉灌木,原產(chǎn)于北美東北部,波羅的海至太平洋沿岸均有分布[1]。黑果腺肋花楸的果實(shí)和葉片中均富含多種生物活性化合物,兩者皆有非常重要的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[2],對健康具有很好的促進(jìn)作用。近年來,很多學(xué)者對黑果腺肋花楸藥理作用進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其富含多酚和黃酮等活性成分[3-4],具有抗氧化[5]、降血壓[6]、抑癌[7]、調(diào)節(jié)腸道菌群[8]等功效,因此,黑果腺肋花楸具有較大的開發(fā)價(jià)值。

對于食品原料中活性成分的研究大多集中在其化學(xué)結(jié)構(gòu)的分析與鑒定以及對其生理功能的探索[9-10]。然而,活性成分的生理功能受到其在人體內(nèi)消化吸收過程的影響。與體內(nèi)消化技術(shù)相比,體外模擬消化是一種通過設(shè)定與動(dòng)物體內(nèi)相近的pH環(huán)境和消化酶體系進(jìn)行消化的實(shí)驗(yàn),可以很好地模擬食物進(jìn)入人體消化道后的變化情況,這種技術(shù)具有成本低、周期短、且重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[11]。

目前,對于黑果腺肋花楸的研究主要集中于果實(shí),對其葉片的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此,本研究采用體外模擬消化技術(shù),對黑果腺肋花楸葉片進(jìn)行消化,考察了消化前后多酚和黃酮釋放情況及抗氧化、抑制糖消化酶活性的變化規(guī)律,以期為后續(xù)黑果腺肋花楸葉片在體內(nèi)真實(shí)消化情況的研究提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考,也為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸葉片,采自遼寧省瓦房店市駝山鎮(zhèn)前大地村。

沒食子酸、蘆丁、福林酚、α-淀粉酶(10 000 U/g)、α-葡萄糖苷酶(700 000 U/g)、胃蛋白酶(3 000 U/g)、胰蛋白酶(250 U/g)、纖維素酶(50 U/mg)、豬膽鹽,上海源葉生物科技有限公司;DPPH、ABTS,合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;可溶性淀粉、磷酸二氫鉀(KH2PO4),分析純,廣東光華科技股份有限公司;磷酸氫二鈉(Na2HPO4),分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl),分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YB-250A高速多功能粉碎機(jī),永康市速鋒工貿(mào)有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司;DGH-9140A數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SG5200HDT超聲波清洗器,上海冠特超聲儀器有限公司;YXFT3MP pH計(jì),上海梅特勒-托利多精密儀器有限公司;UV-2600紫外可見分光光度計(jì),蘇州島津儀器有限公司;SpectraMax190酶標(biāo)儀,上海美谷分子儀器有限公司;THZ-82A數(shù)顯恒溫振蕩器,常州朗越儀器制造有限公司;TG16-WS離心機(jī),湖南邁克爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黑果腺肋花楸葉片粗提物制備

參照向卓亞等[12]的方法略作修改。準(zhǔn)確稱取1.0 g黑果腺肋花楸葉片粉末,加入10 mL甲醇,40 ℃超聲提取30 min,8 000 r/min離心10 min,取上清液,重復(fù)提取2次,合并提取液,定容到40 mL置于4 ℃冰箱作為未消化樣液進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)測定。

1.3.2 體外模擬口腔、胃、小腸、大腸消化

參照QIN等[13]的方法和陳壁等[11]的方法略作修改,對黑果腺肋花楸葉片粉末進(jìn)行體外模擬消化。

準(zhǔn)確稱取1.0 g黑果腺肋花楸葉片粉末置于離心管中,加入40 mL蒸餾水,調(diào)pH值至6.9,加入2 mL α-淀粉酶溶液,37 ℃恒溫振蕩20 min,8 000 r/min離心10 min,取上清液(口腔消化液)備用。向殘?jiān)屑尤?0 mL蒸餾水,調(diào)pH值至2.0,加入2 mL胃蛋白酶溶液,37 ℃恒溫振蕩2 h,8 000 r/min離心10 min,取上清液(胃消化液)備用。繼續(xù)向殘?jiān)屑尤?8 mL蒸餾水,調(diào)pH值至7.4,加入2 mL胰蛋白酶和2 mL豬膽鹽溶液,37 ℃恒溫振蕩2 h,8 000 r/min離心10 min,取上清液(小腸消化液)備用。向最后的殘?jiān)屑尤?0 mL蒸餾水,調(diào)pH值至4.0,加入0.2 mL纖維素酶,37 ℃恒溫振蕩2 h,8 000 r/min離心10 min,取上清液(大腸消化液)備用。

1.3.3 多酚、黃酮釋放量測定

多酚含量測定采用福林酚法[14],以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品在760 nm處測得的吸光度(y1)對濃度(x1)進(jìn)行回歸,得到回歸方程為y1=0.027 57+2.026 57x1,R12=0.999 1,以此進(jìn)行樣品中多酚含量測定。樣品中多酚的釋放量按公式(1)計(jì)算。

黃酮含量測定采用亞硝酸鈉法[15],以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品在510 nm處測得的吸光度(y2)對濃度(x2)進(jìn)行回歸,得到回歸方程為y2=0.041 48+5.546 37x2,R22=0.999 2,以此進(jìn)行樣品中黃酮含量測定。樣品中黃酮釋放量計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:P為樣品中多酚、黃酮的釋放量,mg/g;C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程集散得到的樣品中標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度,mg/mL;V為提取液體積,mL;n為稀釋倍數(shù);M為樣品質(zhì)量,g。

1.3.4 體外抗氧化能力測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力測定

參考LI等[16]的方法適當(dāng)調(diào)整。配制質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL DPPH-乙醇溶液,分別取不同消化樣液和DPPH-乙醇溶液等體積混合,暗反應(yīng)30 min,在517 nm處測定吸光值。比較不同消化樣液對DPPH自由基清除能力。清除能力計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:A1為實(shí)驗(yàn)樣品組的吸光值;A2為以乙醇代替DPPH-乙醇溶液測定的吸光值;A0為以蒸餾水代替樣品液測定的吸光值。

1.3.4.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考ZHANG等[17]的方法適當(dāng)調(diào)整。配制ABTS儲(chǔ)備液,用前以蒸餾水稀釋,調(diào)節(jié)吸光值至0.700(±0.02)作為ABTS工作液。分別取不同消化樣液和ABTS工作液于96孔酶標(biāo)板均勻混合,暗反應(yīng)6 min,在734 nm測定吸光值。比較不同消化樣液對ABTS陽離子自由基清除能力。清除能力計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

式中:A1為實(shí)驗(yàn)樣品組的吸光值;A2為以蒸餾水代替ABTS工作液測定的吸光值;A0為以蒸餾水代替樣品液測定的吸光值。

1.3.4.3 羥自由基清除能力測定

參照LI等[18]的方法適當(dāng)調(diào)整。分別取不同消化樣液、9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、8.8 mol/L H2O2等體積加入96孔酶標(biāo)板,37 ℃避光反應(yīng)1 h后在波長510 nm處測定吸光值。比較不同消化樣液對羥自由基清除能力。清除能力計(jì)算如公式(4)所示:

(4)

式中:A1為實(shí)驗(yàn)樣品組的吸光值;A2為以蒸餾水代替H2O2測定的吸光值;A0為以蒸餾水代替樣品液測定的吸光值。

1.3.4.4 鐵離子還原能力測定

參照師聰?shù)萚19]的方法適當(dāng)調(diào)整。分別取不同消化樣液、pH 6.6的PBS緩沖溶液、10 g/L鐵氰化鉀等體積混合均勻后于50 ℃水浴20 min,加入100 g/L三氯乙酸搖勻,取上清液于96孔酶標(biāo)板,同時(shí)加入適量的蒸餾水和1 g/L三氯化鐵混合靜置10 min,在700 nm處測定吸光值表示鐵離子還原能力。

1.3.5 抑制糖消化酶活性測定

1.3.5.1 α-葡萄糖苷酶抑制率測定

參照朱延勝等[20]的方法并稍作改動(dòng)。取不同消化樣液于96孔酶標(biāo)板中,加入α-葡萄糖苷酶于37 ℃水浴10 min,加入pH 6.8的4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside,PNPG)同溫度下反應(yīng)20 min,用1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)后于405 nm處測定其吸光值。α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算如公式(5)所示:

(5)

式中:A1為實(shí)驗(yàn)樣品組的吸光值;A2為以pH 6.8的PBS緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶測定的吸光值;A0為以蒸餾水代替樣品液測定的吸光值。

1.3.5.2 α-淀粉酶抑制率測定

參照AKHTAR等[21]的方法并稍作改動(dòng)。取不同消化樣液于1.5 mL離心管中,加入α-淀粉酶于37 ℃水浴10 min,加1 g/L的可溶性淀粉溶液同溫度下孵育10 min,取出加入二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS),沸水浴5 min,加適量蒸餾水冷卻至室溫后于540 nm測定其吸光值。α-淀粉酶抑制率計(jì)算如公式(6)所示:

(6)

式中:A1為實(shí)驗(yàn)樣品組的吸光值;A2為以pH 6.9的PBS緩沖溶液代替α-淀粉酶測定的吸光值,A0為以蒸餾水代替樣品液測定的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行圖形繪制。P>0.05表示差異不顯著,P<0.05表示差異較顯著,P<0.01表示差異顯著,P<0.001表示差異極顯著,P<0.000 1表示差異極極顯著。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外模擬消化中黑果腺肋花楸葉片多酚、黃酮的釋放量

如圖1所示,黑果腺肋花楸葉片經(jīng)體外模擬消化后,多酚、黃酮的釋放量均呈下降趨勢,與未消化液相比,各個(gè)消化部位中的釋放量下降差異極極顯著(P<0.000 1)。從總體上看,不同消化階段中多酚、黃酮的釋放量均為口腔消化液>胃消化液>小腸消化液>大腸消化液?？谇幌A段時(shí)間最短,但多酚、黃酮釋放量較其他消化部位均較高,這與向卓亞等[12]研究發(fā)現(xiàn)黑、紅、黃3種藜麥經(jīng)口腔消化后的多酚釋放量最高的研究結(jié)果趨勢相同,隨著消化的繼續(xù),多酚、黃酮的釋放量逐漸減少,各消化部位均有釋放出,但釋放量不同。各消化液中活性成分釋放量的差異可能是由于各消化階段中的pH值和消化酶種類不同而引起的。

圖1 黑果腺肋花楸葉片消化過程中活性物質(zhì)釋放情況Fig.1 Release of active substances from A.melanocarpa leaves during digestion注:各消化液與未消化液比較,*P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001,**** P<0.000 1;相鄰消化液間比較,nd P>0.05,#P<0.05,## P<0.01,###P<0.001,####P<0.000 1(下同)

2.2 體外模擬消化對黑果腺肋花楸葉片抗氧化活性的影響

2.2.1 DPPH自由基清除能力

如圖2所示,隨著消化的進(jìn)行,與未消化液相比,各階段對DPPH自由基清除能力大小依次為未消化液>胃消化液>口腔消化液>小腸消化液>大腸消化液,清除率分別為91.42%、88.33%、74.84%、71.76%、63.24%。胃消化液對DPPH自由基清除能力與未消化液相當(dāng),差異不顯著,其他消化液對DPPH自由基清除能力均比未消化液低,且差異極極顯著(P<0.000 1)。這可能是黑果腺肋花楸葉片經(jīng)體外模擬消化后,對DPPH自由基清除能力較強(qiáng)的活性物質(zhì)主要在胃中被釋放出來,其他部位釋放相對較少,因此在模擬消化過程中,胃消化液對DPPH自由基清除能力最高,這與謝樂怡等[22]研究發(fā)現(xiàn)大豆提取物經(jīng)體外模擬消化后,對DPPH自由基清除能力在口腔和胃消化階段升高,在腸消化階段略微下降的結(jié)果一致。

圖2 黑果腺肋花楸葉片消化過程中DPPH自由基清除能力變化Fig.2 Changes of DPPH radical scavenging ability of A.melanocarpa leaves during digestion注:各消化液與未消化液比較,ns P>0.05(下同)

2.2.2 ABTS陽離子自由基清除能力

體外模擬消化黑果腺肋花楸葉片對ABTS陽離子自由基清除能力如圖3所示,與未消化液相比,口腔、胃、小腸、大腸消化液對ABTS陽離子自由基清除能力下降,差異極極顯著(P<0.000 1),各階段對ABTS陽離子自由基清除能力大小依次為未消化液>口腔消化液>小腸消化液>胃消化液>大腸消化液,清除率分別為72.59%、46.42%、23.35%、22.05%、9.53%。隨著消化的進(jìn)行,對ABTS陽離子自由基清除能力逐漸降低,雖然在小腸消化過程中有一定回升,但回升量都較小,與胃消化相比,回升的清除率差異不顯著。由圖3可知,經(jīng)體外模擬消化,口腔消化液對ABTS陽離子自由基清除能力最強(qiáng),其他3個(gè)階段相對較弱,這與向卓亞等[12]的研究結(jié)果一致,可能是因?yàn)榍宄鼳BTS陽離子自由基的活性物質(zhì)大部分在口腔部位被釋放出來,在其他3個(gè)部位由于酶種類和pH值的影響,不利于清除ABTS陽離子自由基的活性物質(zhì)的釋放,因此清除率相對口腔略低。

圖3 黑果腺肋花楸葉片消化過程中ABTS陽離子自由基清除能力Fig.3 Changes of ABTS cationic radical scavenging ability of A.melanocarpa leaves during digestion

2.2.3 羥自由基清除能力

體外模擬消化黑果腺肋花楸葉片對羥自由基清除能力如圖4所示,與未消化液相比,各階段對羥自由基清除能力大小依次為小腸消化液>未消化液>口消化液>胃消化液>大腸消化液,清除率分別為31.76%、21.88%、21.45%、21.08%、16.51%。由圖4可以看出,與未消化液相比,口腔、胃消化液對羥自由基清除能力相當(dāng),差異不顯著,而小腸消化階段對羥自由基清除率超過了未消化液,達(dá)到最高,且差異極顯著(P<0.001),可能是小腸消化階段中釋放出的活性物質(zhì)表現(xiàn)出了較高的清除羥自由基能力。經(jīng)過大腸消化,清除率有所降低,與未消化液相比,差異較顯著(P<0.05)。

圖4 黑果腺肋花楸葉片消化過程中羥自由基清除能力Fig.4 Changes of hydroxyl radical scavenging ability of A.melanocarpa leaves during digestion

2.2.4 鐵離子還原能力

鐵離子還原能力與吸光值的大小相關(guān),吸光值越大,對鐵離子的還原力越強(qiáng)[23]。如圖5所示,黑果腺肋花楸葉片經(jīng)體外模擬消化后,吸光值逐漸降低,說明對鐵離子的還原能力逐漸減弱。與未消化液相比,經(jīng)口腔、胃、小腸、大腸消化后,各消化液對鐵離子的還原能力下降,差異極極顯著(P<0.000 1),在各消化階段中,口腔消化液對鐵離子的還原能力最好,與胃消化液相比,還原能力較強(qiáng),且差異極極顯著(P<0.000 1),可能是對鐵離子有還原作用的活性物質(zhì)主要在口腔部位被釋放出來,隨著消化的繼續(xù),具有還原作用的活性物質(zhì)釋放逐漸減少。

圖5 黑果腺肋花楸葉片消化過程中的鐵離子還原能力Fig.5 Changes of iron ion reducing power of A.melanocarpa leaves during digestion

2.3 體外模擬消化對黑果腺肋花楸葉片抑制糖消化酶活性的影響

2.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制率

黑果腺肋花楸葉片消化液對α-葡萄糖苷酶的抑制率如圖6所示,經(jīng)體外模擬消化后,各消化液對α-葡萄糖苷酶的抑制率均有所下降,抑制率的下降差異極極顯著(P<0.000 1)。與未消化液相比,各消化液對α-葡萄糖苷酶的抑制率大小依次為:未消化液>大腸消化液>口消化液>小腸消化液>胃消化液,抑制率分別為34.66%、9.87%、8.60%、7.01%、6.64%。由圖6可以看出,與未消化液相比,口腔消化液對α-葡萄糖苷酶的抑制率極極顯著降低(P<0.000 1),繼續(xù)胃消化過程,抑制率降低,但與口腔相比差異不顯著。經(jīng)小腸消化后,抑制率略有回升,最后經(jīng)大腸階段的消化,抑制率持續(xù)回升,但差異不顯著。

圖6 黑果腺肋花楸葉片消化過程中對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.6 Inhibition rate of α-glucosidase of A.melanocarpa leaves during digestion

2.3.2 α-淀粉酶抑制率

黑果腺肋花楸葉片各消化液對α-淀粉酶的抑制率如圖7所示,與未消化相比,各階段對α-淀粉酶的抑制率大小依次為未消化液>胃消化液>大腸消化液>小腸消化液>口腔消化液,抑制率分別為80.65%、37.21%、33.63%、29.77%、22.61%。與未消化液相比,口腔消化液對α-淀粉酶的抑制率極極顯著降低(P<0.000 1),隨著消化的進(jìn)行,在胃消化環(huán)境中的抑制率有回升,與口腔相比,抑制率回升極極顯著(P<0.000 1)。與胃消化液相比,經(jīng)小腸和大腸消化后對α-淀粉酶活性的抑制率有一定的下降,但從消化總體看,都比口腔消化過程的抑制率高,可能是模擬胃、小腸、大腸3個(gè)消化環(huán)境更有利于黑果腺肋花楸葉片抑制α-淀粉酶活性成分的釋放。

圖7 黑果腺肋花楸葉片消化過程中對α-淀粉酶的抑制率Fig.7 Inhibition rate of α-amylase of A.melanocarpa leaves during digestion

2.4 抗氧化、抑制糖消化酶活性的變化與多酚、黃酮釋放量相關(guān)性聚類熱圖分析

圖8 黑果腺肋花楸葉片消化過程中體外活性與活性成分釋放量之間的相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between in vitro activity and component release of A.melanocarpa leaves during digestion

3 結(jié)論

藥食同源植物中的多酚、黃酮等活性物質(zhì)以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的形式存在,利用體外模擬消化技術(shù),在不同的pH值和不同酶的作用下,這些結(jié)合態(tài)的活性物質(zhì)會(huì)與其結(jié)合的大分子類物質(zhì)如蛋白質(zhì)、纖維素等分離,發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)利用了體外模擬消化技術(shù)研究了黑果腺肋花楸葉片消化前后多酚、黃酮的釋放情況及過程中抗氧化、抑制糖消化酶活性的變化。未消化液中多酚、黃酮含量均較高,經(jīng)體外模擬消化后,釋放量逐漸降低,且不同消化部位中多酚、黃酮的釋放情況存在差異,對其抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶情況也各不相同,但從總體消化過程分析,體外模擬消化促使了多酚、黃酮的釋放,提高了生物利用度。在體外抗氧化活性測定中,與未消化液相比,各消化液的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力、鐵離子還原能力均呈下降趨勢,但對羥自由基清除能力在小腸部位上升,在相關(guān)性分析中,羥自由基清除能力與多酚、黃酮的釋放量呈負(fù)相關(guān)(R2<0),而ABTS陽離子自由基清除能力和鐵離子還原能力與多酚、黃酮的釋放量均呈正相關(guān),且相關(guān)性較高。在抑制糖消化酶活性測定中,各消化液對α-淀粉酶的抑制率較高,對α-葡萄糖苷酶的抑制率稍低,相關(guān)性分析中,對2種酶活性的抑制率與多酚、黃酮的釋放量呈正相關(guān)?？梢?體外模擬消化過程影響黑果腺肋花楸中多酚、黃酮的釋放量及抗氧化和抑制糖消化酶活性,后續(xù)還需進(jìn)一步研究體外抗氧化和抑制糖消化酶活性的主要活性物質(zhì)及其構(gòu)效關(guān)系,并進(jìn)行動(dòng)物模型研究其作用機(jī)理,為黑果腺肋花楸的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。