莫易,冉小琴,王贊丞,陳雨點(diǎn),彭念,李江洪,李勇昊*

1(重慶科技學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,重慶,401331)2(工業(yè)發(fā)酵微生物重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(重慶科技學(xué)院),重慶,401331)

由秸稈為代表的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化為生物燃料和生物基化學(xué)品是引領(lǐng)“烴經(jīng)濟(jì)”向“糖經(jīng)濟(jì)”轉(zhuǎn)型的重要突破口[1]。然而,秸稈類生物質(zhì)堅(jiān)韌的超分子結(jié)構(gòu),需要高效的纖維素酶才能將纖維素水解為可發(fā)酵性糖。纖維素酶高產(chǎn)菌株主要來自里氏木霉(Trichodermareesei)[2],T.reesei纖維素酶主要包括內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和多種纖維素降解輔助蛋白[3],它們協(xié)同將纖維素水解為葡萄糖,但這些蛋白的合成均需誘導(dǎo)。

前期通過β-葡萄糖苷酶催化高濃度葡萄糖制備葡萄糖-槐糖混合物(mixture of glucose and sophorose, MGD)可以高效誘導(dǎo)T.reesei合成纖維素酶[4],然而蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)相比于木質(zhì)纖維素固體誘導(dǎo)物,雖然可以合成更高水平的外切纖維素酶和內(nèi)切纖維素酶,但是纖維素降解輔助蛋白表達(dá)量明顯降低,尤其是膨脹素(swollenin,SWO1)[5]。已有研究表明SWO1雖然無糖苷水解酶活性,但可以破壞木質(zhì)纖維素致密的高分子結(jié)構(gòu),從而協(xié)同纖維素酶提高催化速率[6-7]。目前已發(fā)現(xiàn)十多種SWO1作為纖維素降解輔助蛋白可提高纖維素酶水解效率[8-9]。其中T.reesei內(nèi)源SWO1是最先被發(fā)現(xiàn)的,但尚無在T.reesei中過表達(dá)該基因并利用MGD作為誘導(dǎo)物刺激纖維素酶合成的研究。

因此本研究在T.reeseiRut C30中利用組成型強(qiáng)啟動子丙酮酸脫羧酶1(pyruvate decarboxylase1, PDC1)高效表達(dá)內(nèi)源Trswo1基因,重組菌株利用MGD為誘導(dǎo)物發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶,并被用于水解堿預(yù)處理玉米秸稈(alkali pretreated corn straw, APCS);最后通過X射線衍射(X-ray diffraction, XRD)和掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)分析SWO1蛋白協(xié)同纖維素酶降解纖維素的分子機(jī)制。研究結(jié)果為T.reesei利用MGD為誘導(dǎo)物合成高水解效率的纖維素酶系具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

T.reeseiRut C30(NRRL 11460)惠贈于美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心;大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)購自北京擎科生物科技有限公司。根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGL-1惠贈于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)咸洪泉教授。pPTPDC1由本實(shí)驗(yàn)室之前研究構(gòu)建的表達(dá)載體,包括PDC1啟動子和終止子以及潮霉素B抗性基因,在T.reesei中使用潮霉素B作為篩選標(biāo)記[5]。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,NaCl 10,酵母浸粉5,如配制固體培養(yǎng)基則添加20 g/L瓊脂粉。

PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯浸出液200,葡萄糖20,瓊脂20。

固體生孢培養(yǎng)基(g/L):麥芽提取物30,瓊脂20。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖4,玉米漿粉10。

纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):MGD 10,蛋白胨1,尿素0.3,(NH4)2SO41.4,KH2PO42,MgSO4·7H2O 0.3,CaCl20.4,FeSO4·7H2O 5 mg/L,MnSO4·H2O 1.7 mg/L,ZnSO4·7H2O 1.4 mg/L,0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 5.0)500 mL/L。

1.1.3 試劑

植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)、TSINGKE TSV-S1 Trelief?SoSoo Cloning Kit、2×TSINGKE?Master qPCR Mix(SYBR Green 1 with UDG),北京擎科生物科技有限公司;SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time),TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶BsiWⅠ,美國New England Biolabs公司;β-葡萄糖苷酶,夏盛(北京)生物科技開發(fā)有限公司。

MGD是由β-葡萄糖苷酶催化葡萄糖轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)合成[4]。具體以0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 4.8)配制600 g/L葡萄糖,加入20 CBU/g葡萄糖的β-葡萄糖苷酶。65 ℃孵育72 h后在105 ℃下處理5 min失活β-葡萄糖苷酶。離子色譜測定MGD含有410.20 g/L葡萄糖、60.56 g/L龍膽二糖、9.34 g/L纖維二糖和13.66 g/L槐糖,其中槐糖為已知T.reesei誘導(dǎo)合成纖維素酶最強(qiáng)誘導(dǎo)物。

APCS由2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaOH于121 ℃條件下處理90 min,堿處理后的APCS用自來水洗至中性,置于烘箱烘干備用,得到的APCS室溫保存[10]。

3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)試劑的配制方法如下。甲液:稱取NaOH 104 g溶解于1 300 mL蒸餾水中,再加入30 g 3,5-二硝基水楊酸,加熱溶解;乙液:稱取910 g酒石酸鉀鈉溶于2 500 mL蒸餾水中,溶解后加入25 g結(jié)晶酚和25 g NaHSO3,混勻。將上述甲、乙兩液混合,加入1 200 mL蒸餾水(總體積5 000 mL),貯于棕色瓶中備用,在室溫下放置1周后可以使用。

1.1.4 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司;MJ-150F-I霉菌培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;A300基因擴(kuò)增儀,杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;CFX Connect熒光定量PCR儀,美國Bio-rad公司;希爾曼S-10生物傳感器分析儀,深圳市西爾曼科技有限公司;X射線衍射儀XRD-7000,日本島津公司;JSM-7800F掃描電子顯微鏡,日本電子株式會社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 過表達(dá)Trswo1基因質(zhì)粒與T.reesei基因工程菌的構(gòu)建

T.reeseiRut C30孢子接種于種子培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)24 h,再將菌絲體以10%(體積分?jǐn)?shù))接種到含有50 mL纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中于28 ℃培養(yǎng)48 h。取樣提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;以cDNA為模板,swo1-F/R(含有20 bp pPTPDC1同源片段)為引物擴(kuò)增Trswo1基因;利用BsiWⅠ線性化表達(dá)載體pPTPDC1,使用無縫克隆方法將線性化載體與Trswo1基因連接,通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,成功構(gòu)建的過表達(dá)Trswo1基因表達(dá)載體命名pPTPDC1-swo1;pPTPDC1-swo1利用PCR驗(yàn)證成功后DNA測序驗(yàn)證保證基因無突變。表1為本研究使用到的引物。

表1 載體構(gòu)建和實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需引物Table 1 Primers used for vector construction and quantitative real-time PCR

通過A.tumefaciens介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的方法將質(zhì)粒pPTPDC1-swo1中包含Trswo1表達(dá)盒的T-DNA整合到T.reeseiRut C30基因組,利用含有300 μg/mL潮霉素B抗性的PDA平板篩選轉(zhuǎn)化子,提取轉(zhuǎn)化子基因組PCR驗(yàn)證后進(jìn)行DNA測序保證基因無突變。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶

T.reesei于固體生孢培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)7 d收集孢子[11],將孢子接種到50 mL種子培養(yǎng)基,在28 ℃、150 r/min條件培養(yǎng)24 h后將菌絲體以10%(體積分?jǐn)?shù))接種到50 mL纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基,在28 ℃、150 r/min條件下誘導(dǎo)纖維素酶合成。

1.2.3 堿預(yù)處理玉米秸稈的水解

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的APCS在pH 4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.2 mol/L)中進(jìn)行酶解,加酶量為10 FPU/g APCS,由于T.reesei所產(chǎn)纖維素酶缺乏β-葡萄糖苷酶,進(jìn)而導(dǎo)致水解過程中纖維二糖積累從而抑制外切和內(nèi)切纖維素酶活性導(dǎo)致纖維素酶水解效率降低[12],因此本研究額外添加326 U/g APCS的β-葡萄糖苷酶;反應(yīng)在30 mL樣品瓶中進(jìn)行,裝液量為7.5 mL,反應(yīng)溫度50 ℃,轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.3 分析方法

纖維素酶活性測定:按國際理論和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會推薦的國際標(biāo)準(zhǔn)法測定[13]。向比色管中加入 0.5 mL 經(jīng)稀釋后的酶液、1.0 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.2 mol/L,pH 4.8)和1 cm×6 cm的約50 mg的Whatman NO.1濾紙,于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)60 min,反應(yīng)結(jié)束后立即加入DNS試劑反應(yīng)液終止酶反應(yīng),測定生成還原糖的量。酶活性單位的定義:在最適反應(yīng)條件下,每分鐘水解Whatman No.1濾紙產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

外切纖維素酶活性測定:以1 g/L對硝基苯纖維二糖苷(4-nitrophenyl β-D-cellobioside,pNPC)為底物測定[14]。向1.5 mL離心管中加入100 μL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液以及50 μLpNPC溶液,于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min后,立即加入150 μL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Na2CO3終止反應(yīng),測定415 nm處的吸光值。酶活性單位的定義:在酶最適反應(yīng)條件下,每分鐘水解pNPC產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

內(nèi)切纖維素酶活性測定:以2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose,CMC)為底物測定[13]。向試管中加入0.5 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液及0.5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.2 mol/L,pH 4.8),于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min,反應(yīng)結(jié)束后立即加入DNS試劑,測定反應(yīng)液中生成的還原糖含量。酶活性單位的定義:在酶最適反應(yīng)條件下,每分鐘水解CMC產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

葡萄糖濃度測定:使用希爾曼S-10生物傳感器分析儀測定葡萄糖的濃度。

菌株平板生長分析:將T.reesei孢子接種于去除蛋白胨的纖維素酶發(fā)酵固體培養(yǎng)基平板(直徑35 mm),在28 ℃條件下培養(yǎng)觀察T.reesei菌絲生長直徑。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)分析:T.reesei孢子接種于50 mL種子培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)24 h,菌絲體以10%(體積分?jǐn)?shù))的比例接種到50 mL纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)36 h后收集菌絲,提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照2×TSINGKE?Master qPCR Mix的說明書進(jìn)行qPCR測定基因相對表達(dá)量,所有基因的qPCR引物如表1所示。采用2-ΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量,sar1基因作為管家基因。

XRD分析:酶解后的固體殘留物過濾后用蒸餾水洗滌3次并干燥后研磨,使用X射線衍射儀在40 kV 和30 mA的Cu輻照條件下分析樣品,掃描范圍為2θ=8°～80°。用峰高法計(jì)算了樣品的結(jié)晶度指數(shù)(crystallinity index,CrI)[15],CrI的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:I002為002衍射面的結(jié)晶度;IAM為非結(jié)晶區(qū)的衍射強(qiáng)度,2θ=18°。

SEM分析:通過掃描電鏡觀察酶解72 h后APCS表面的微觀變化。樣品用雙面膠黏附于金屬圓盤上,表面噴鍍鉑金后在5 kV下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體構(gòu)建及里氏木霉轉(zhuǎn)化子鑒定

本研究想提高M(jìn)GD誘導(dǎo)T.reesei合成纖維素酶系的水解效率,而MGD中除誘導(dǎo)物槐糖外,還有大量葡萄糖存在,因此本研究選用葡萄糖為碳源條件下PDC1啟動內(nèi)源Trswo1基因表達(dá),有效避免使用cbh1或者xyn3啟動子導(dǎo)致本底纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄水平降低問題[16]。

實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建了包含PDC1啟動子和終止子的T.reesei基因表達(dá)載體pPTPDC1,啟動子和終止子之間含有BsiWⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),該載體已經(jīng)成功在T.reeseiRut C30中表達(dá)了外源aabgl1基因,使得T.reesei的β-葡萄糖苷酶活性提高了70多倍[5]。所以本研究利用BsiWⅠ線性化pPTPDC1后,通過無縫克隆技術(shù)將Trswo1基因連接到PDC1啟動子和終止子之間,成功構(gòu)建過表達(dá)Trswo1基因的載體并命名為pPTPDC1-swo1(圖1-a)。利用A.tumefaciens介導(dǎo)的T.reesei遺傳轉(zhuǎn)化將Trswo1基因表達(dá)盒整合到T.reeseiRut C30基因組,挑取2個(gè)潛在的轉(zhuǎn)化子,并提取轉(zhuǎn)化子基因組后以Bsiw1yz-F/R為引物通過PCR證明轉(zhuǎn)化成功(圖1-b),進(jìn)而通過DNA測序驗(yàn)證了Trswo1基因表達(dá)盒沒有發(fā)生堿基突變(圖1-c),將2株陽性轉(zhuǎn)化子分別命名為T.reeseiOEswo1-1和OEswo1-2。

a-表達(dá)載體pPTPDC1-swo1;b-PCR驗(yàn)證Trswo1基因表達(dá)盒(M-marker);c-DNA測序驗(yàn)證Trswo1基因表達(dá)盒圖1 表達(dá)載體的構(gòu)建及Trswo1基因的驗(yàn)證Fig.1 Construction of the expression vector and verification of the Trswo1 gene

2.2 過表達(dá)Trswo1基因?qū).reesei Rut C30生長和纖維素酶合成的影響

T.reeseiRut C30和2株陽性轉(zhuǎn)化子(T.reeseiOEswo1-1和OEswo1-2)以10 g/L MGD為誘導(dǎo)物在纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后取樣提取RNA并反轉(zhuǎn)為cDNA,通過qPCR檢測T.reeseiOEswo1-1和OEswo1-2的Trswo1基因相對表達(dá)量分別是野生型菌株的4.65倍和3.91倍(P<0.001)。表明Trswo1基因在2株陽性轉(zhuǎn)化子中均實(shí)現(xiàn)了過表達(dá)。

進(jìn)一步對野生型和兩株陽性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶,對纖維素酶活性、外切纖維素酶活性和內(nèi)切纖維素酶活性進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)過量生產(chǎn)SWO1后并不會提高以上3種糖苷水解酶活性(P>0.05)(圖2-b～圖2-d)。這與SWO1蛋白無糖苷水解酶活性的研究結(jié)果相一致[17]。

a-Trswo1相對表達(dá)量;b-纖維素酶活性;c-外切纖維素酶活性;d-內(nèi)切纖維素酶活性;e-T.reesei Rut C30和轉(zhuǎn)化子的形態(tài)圖2 T.reesei Rut C30與轉(zhuǎn)化子Trswo1基因轉(zhuǎn)錄分析和酶活性分析Fig.2 Transcription analysis of Trswo1 and activities of cellulase, exoglucanase, and endoglucanase from T.reesei Rut C30 and transformants with MGD as inducer注:*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,ns表示P>0.05(下同)

將等量的T.reeseiRut C30和2株陽性轉(zhuǎn)化子的孢子接種到固體纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基平板,在28 ℃下培養(yǎng)4 d。如圖2-e所示,T.reeseiOEswo1-1在24 h孢子產(chǎn)生量小于另外2株菌的孢子產(chǎn)生量,而在其他時(shí)間點(diǎn)孢子產(chǎn)生量均無顯著性差異,同時(shí)3個(gè)菌株菌絲的直徑在任何時(shí)間點(diǎn)都沒有顯著性差異;上述結(jié)果表明,在T.reeseiRut C30中過表達(dá)Trswo1基因不影響菌株的生長。

2.3 堿預(yù)處理玉米秸稈的水解

雖然用MGD作為誘導(dǎo)物可以獲得較高的纖維素酶活性,但普遍認(rèn)為T.reesei的β-葡萄糖苷酶不足導(dǎo)致水解過程中纖維二糖積累抑制外切和內(nèi)切纖維素酶活性,從而降低木質(zhì)纖維素的水解效率,所以普遍額外添加β-葡萄糖苷酶保證纖維素酶的水解效率[4]?；诖吮狙芯吭谒怏w系中額外添加326 U/g APCS商業(yè)β-葡萄糖苷酶。

利用T.reeseiRut C30、OEswo1-1和OEswo1-2生產(chǎn)的纖維素酶(Cellulase-C30、Cellulase-OEswo1和Cellulase-OEswo2)分別被用于水解APCS,結(jié)果如圖3所示,1 h后釋放葡萄糖分別為4.58、4.86、5.72 g/L;水解12 h后Cellulase-OEswo1和Cellulase-OEswo2水解APCS后釋放的葡萄糖相比于Cellulase-C30釋放的葡萄糖分別提高了6.98%和13.93%(P<0.001)。這表明在MGD作為誘導(dǎo)物情況下,過量生產(chǎn)SWO1會顯著性提高纖維素酶水解效率,而72 h的水解結(jié)果顯示各種纖維素酶催化效率無顯著性差異(P>0.05)。這是由于酶具有飽和動力學(xué)現(xiàn)象,因此含有更多SWO1的纖維素酶更適合同步糖化發(fā)酵水解木質(zhì)纖維素。

圖3 T.reesei Rut C30和OEswo1轉(zhuǎn)化子酶解APCS的葡萄糖產(chǎn)量Fig.3 Glucose yield in the hydrolysis of APCS by enzyme from T.reesei Rut C30 and transformants

此外Trswo1基因表達(dá)水平與纖維素水解效率不成正比,雖然纖維素酶Cellulase-OEswo1相比于Cellulase-OEswo2含有更多的SWO1(P<0.05),但是Cellulase-OEswo1水解APCS的葡萄糖產(chǎn)量卻低于Cellulase-OEswo2水解APCS的葡萄糖產(chǎn)量。表明SWO1必不可少,但是足量后繼續(xù)提高其含量無法持續(xù)提高纖維素酶水解效率。這與已有研究保持一致,即SWO1和纖維素酶競爭纖維素中有限的結(jié)合位點(diǎn),過量的SWO1反而會抑制纖維素酶的活性[8]。

2.4 酶解后固體殘?jiān)Y(jié)構(gòu)特征分析

為探究SWO1提高纖維素酶水解APCS效率的分子機(jī)制,利用SEM分析預(yù)處理前后玉米秸稈的結(jié)構(gòu)特征,結(jié)果如圖4所示,未經(jīng)水解的APCS整個(gè)纖維表面光滑均勻且纖維沒有分散,而經(jīng)過纖維素酶Cellulase-C30水解會導(dǎo)致纖維分散,形成粗糙且無定形的表面;而經(jīng)過纖維素酶Cellulase-OEswo1和Cellulase-OEswo2水解的APCS表面結(jié)構(gòu)破壞更嚴(yán)重,并且由圖4-c和圖4-d可以看出纖維素酶Cellulase-OEswo1相比于Cellulase-OEswo2對纖維結(jié)構(gòu)破壞的能力更強(qiáng),這是由于Cellulase-OEswo1含有更多的SWO1。

a-APCS;b-Cellulase-C30處理的APCS;c-Cellulase-OEswo1處理APCS;d-Cellulase-OEswo2處理的APCS圖4 酶解后固體殘?jiān)膾呙桦婄R圖(2 000×)Fig.4 Scanning electron microscopy photo of hydrolysed APCS (2 000×)

玉米秸稈中的纖維素由結(jié)晶和非結(jié)晶2種結(jié)構(gòu)組成,結(jié)晶結(jié)構(gòu)是由葡聚糖鏈之間的大量氫鍵形成的,這種結(jié)晶結(jié)構(gòu)會減緩纖維素酶的水解速率[18-19]。纖維素的結(jié)晶度通常由XRD測量的CrI來表示[20]。因此本文通過XRD測量分析了酶解前后APCS的CrI。結(jié)果如圖5所示,所有樣品均觀察到2θ=16°和2θ=22°附近存在衍射峰,衍射峰的位置無明顯變化,但衍射強(qiáng)度差異較大。樣品的CrI值如表2所示,經(jīng)過纖維素酶Cellulase-C30水解后的APCS與未經(jīng)過水解相比,CrI降低(從74.34%降至60.95%);同時(shí)β-葡萄糖苷酶也可以將APCS的CrI由74.34%降至70.88%。而含有更多SWO1的纖維素酶Cellulase-OEswo1和Cellulase-OEswo2水解APCS后的殘?jiān)?θ=22.5°處的CrI明顯降低,與用纖維素酶Cellulase-C30處理后APCS的CrI相比(60.95%),經(jīng)過纖維素酶Cellulase-OEswo1和Cellulase-OEswo2水解后APCS的CrI更低(53.27%和57.94%)。以上結(jié)果表明SWO1協(xié)同提高纖維素酶水解效率主要是由于破壞纖維素的結(jié)晶度。此外,纖維素酶Cellulase-OEswo1相比于Cellulase-OEswo2含有更多SWO1,可以更大程度上破壞纖維素的結(jié)晶度,這與SEM分析結(jié)果一致。

圖5 酶解的固體殘?jiān)黊RD譜圖Fig.5 XRD spectra of the solid residues from enzymatic hydrolysis

表2 酶解的固體殘?jiān)慕Y(jié)晶度指數(shù)Table 2 Crystallization index of the solid from residues enzymatic hydrolysis

3 結(jié)論

本研究在TrichodermareeseiRut C30中過表達(dá)同源SWO1基因得到2株陽性轉(zhuǎn)化子,Trswo1基因表達(dá)量分別提高了4.65倍和3.91倍。使用葡萄糖-槐糖混合物作為誘導(dǎo)物,發(fā)現(xiàn)過量生產(chǎn)SWO1對纖維素酶活性和菌株生長無顯著性影響,但是可以提高對堿預(yù)處理玉米秸稈的水解效率。進(jìn)一步分析過量生產(chǎn)的SWO1可破壞纖維素表面結(jié)構(gòu)同時(shí)降低結(jié)晶度來協(xié)同纖維素酶提高玉米秸稈水解效率。該研究對T.reesei利用可溶性誘導(dǎo)物合成纖維素酶系中纖維素降解輔助蛋白含量低的問題具有一定意義。