鄭建清 黃碧芬 蘇曉寧 曾冰微

1 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院放射治療科,福建省泉州市 362000; 2 泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬人民醫(yī)院婦產(chǎn)科; 3 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)保辦; 4 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科

宮頸癌是全球婦女第二位常見的惡性腫瘤[1],而中國(guó)長(zhǎng)期流行病學(xué)資料顯示,宮頸癌發(fā)病率始終高居?jì)D科腫瘤第一位,是女性防控任務(wù)艱巨的惡性腫瘤之一[2]。盡管手術(shù)和(或)放化療對(duì)宮頸癌治療有效率高達(dá)70%～75%,仍有30%～40%轉(zhuǎn)移性宮頸癌或復(fù)發(fā)性宮頸癌缺乏有效治療手段[3-4]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),超末端家族蛋白(Bromodomain and extraterminal domain,BET)是溴結(jié)構(gòu)域蛋白(Bromine Domain Protein,BRD)核轉(zhuǎn)錄因子家族中一類全新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白,他們可以募集多種轉(zhuǎn)錄激活子來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活,參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。JQ1是一種BRD4抑制劑,可以抑制BET蛋白家族的促轉(zhuǎn)錄功能,進(jìn)而抑制腫瘤進(jìn)展,被認(rèn)為是未來(lái)治療腫瘤的潛在新藥物[6]。體內(nèi)外研究表明,JQ1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用[7]。一些研究發(fā)現(xiàn),JQ1對(duì)腫瘤相關(guān)超級(jí)增強(qiáng)子具有顯著抑制作用,是JQ1發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一[8],但JQ1是否參與宮頸癌HeLa細(xì)胞超級(jí)增強(qiáng)子的調(diào)控尚未見報(bào)道。我們的先前研究表明,JQ1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖、侵襲能力具有抑制作用[9]。為了探討JQl是否通過調(diào)控超級(jí)增強(qiáng)子相關(guān)lncRNA(Super enhancer-associated lncRNAs,SE-lncRNAs)表達(dá)譜發(fā)揮對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的抗腫瘤作用,本研究進(jìn)一步通過全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲得了JQl處理和對(duì)照組的表達(dá)譜,并結(jié)合TCGA(The cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)后分析,現(xiàn)對(duì)其結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 Cell Counting Kit-8(CCK8)法檢測(cè)JQ1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的最佳抑制濃度和作用時(shí)間 人宮頸癌HeLa細(xì)胞系經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)合格后,采用CCK8法檢測(cè)JQ1對(duì)HeLa細(xì)胞株增殖的影響。HeLa細(xì)胞分別采用0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L濃度的JQ1處理,獲得不同JQ1濃度對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制率。具體試驗(yàn)過程參照本課題前期的報(bào)道[9],JQ1處理HeLa細(xì)胞72h后,細(xì)胞增殖抑制率為(50.82±1.43)%。

1.2 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于六孔板,細(xì)胞數(shù)目為2×105/孔,培養(yǎng)12h。其中3孔采用1μmol/L JQ1進(jìn)行處理,設(shè)置為處理組,另外3孔不加入JQ1,設(shè)置為對(duì)照組,培養(yǎng)72h,按照RNA提取試劑盒的說明書提取細(xì)胞總RNA,基于NEBNext Ultra RNA庫(kù)制備試劑盒構(gòu)建RNA測(cè)序文庫(kù),使用Illumina Hiseq 4000測(cè)序平臺(tái)完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。本研究測(cè)序工作由廈門生命互聯(lián)科技有限公司完成。試驗(yàn)重復(fù)3次。

Illumina Hiseq 4000測(cè)序平臺(tái)獲得的FASTQ格式的原始數(shù)據(jù),采用TopHat軟件和Cufflinks軟件處理后,獲得表達(dá)譜數(shù)據(jù),隨后采用“l(fā)imma”包進(jìn)行差異表達(dá)分析,差異表達(dá)條件設(shè)置為:Log2fold change(LogFC)絕對(duì)值>1,且校正P值<0.05。

SE-lncRNAs基因目錄提取自Soibam報(bào)道的結(jié)果[10]。提取完成后,從JQ1處理組和對(duì)照組表達(dá)矩陣中提取SE-lncRNAs數(shù)據(jù)集,進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 TCGA數(shù)據(jù)的下載與處理 在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)官方網(wǎng)站(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載宮頸癌表達(dá)譜和臨床信息等數(shù)據(jù)。TCGA宮頸癌序列包含組織樣本307例,正常宮頸組織樣本3例,其中隨訪時(shí)間≥1個(gè)月的宮頸資料265例。利用R4.2.0軟件及其相應(yīng)R包對(duì)下載的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化整理,并通過log2轉(zhuǎn)化后用于后續(xù)分析。相應(yīng)的宮頸癌臨床病理特征信息,僅保留生存時(shí)間、生存狀態(tài)完整的患者數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R 4.2.0軟件中的“survival”包、“survminer”包等進(jìn)行生存分析,COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型用于評(píng)價(jià)基于表達(dá)的預(yù)后價(jià)值,Kaplan-Meier 法繪制生存曲線。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SE-lncRNAs篩選與差異分析結(jié)果 從全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中獲得基因表達(dá)矩陣,采用“biomaRt”包進(jìn)行基因注釋,以表達(dá)總和超過1為基因篩選條件,通過6個(gè)樣品獲得總共3 111個(gè)lncRNAs,其中88個(gè)lncRNAs表達(dá)上調(diào),105個(gè)lncRNAs表達(dá)下調(diào)。隨后,根據(jù)Soibam的報(bào)告[10]篩選和匹配了162個(gè)SE-lncRNA。使用校正P值(False Discovery Rate,FDR)=0.05和LogFC>1作為差異條件,共篩選出15個(gè)差異表達(dá)的SE-lncRNAs,見表1。

表1 JQ1處理后超級(jí)增強(qiáng)子相關(guān)lncRNA表達(dá)差異分析結(jié)果

2.2 差異表達(dá)SE-lncRNAs的預(yù)后分析 采用COX回歸分析探索差異表達(dá)SE-lncRNAs的預(yù)后價(jià)值,結(jié)果見表2。共發(fā)現(xiàn)4個(gè)SE-lncRNAs對(duì)宮頸癌預(yù)后具有顯著影響,分別是LINC01106、SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021對(duì)宮頸癌的總生存具有顯著影響(P<0.05);其中LINC01106表達(dá)增高組,患者預(yù)后較差,而SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021高表達(dá)組患者預(yù)后較好,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

圖1 LINC01106、SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021在宮頸癌中的生存曲線圖

表2 宮頸癌患者差異表達(dá)SE-lncRNAs的COX回歸分析結(jié)果

3 討論

晚期宮頸癌占全部宮頸癌患者的30%～35%,通常以全身化療為主要治療手段,但療效差,5年生存率不足35%,被認(rèn)為是不可治愈[11]。盡管靶向治療或免疫治療在晚期宮頸癌患者中取得了一定效果,但與單純化療相比,其療效并未明顯提高[12]。因此,尋找針對(duì)宮頸癌的高效靶向藥物,對(duì)提高宮頸癌,特別是晚期宮頸癌患者的預(yù)后,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

JQ1是一種分子結(jié)構(gòu)與BRD4相似的小分子抑制劑,可與BRD4競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到BRD4結(jié)構(gòu)域上,使BRD4的生物學(xué)被競(jìng)爭(zhēng)性抑制,而BRD4-BRD4結(jié)構(gòu)域共同參與了惡性腫瘤的生物學(xué)過程。JQ1作為單一藥物應(yīng)用于某些實(shí)體惡性腫瘤具有明顯的抑制作用,提示JQ1在抗腫瘤應(yīng)用領(lǐng)域具有廣闊前景[5-6,13]。我們前期研究表明,JQ1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞具有明顯抑制作用,說明JQ1對(duì)宮頸癌亦能發(fā)揮抗腫瘤作用,但我們的前期研究尚未深入涉足JQ1對(duì)宮頸癌的抗癌機(jī)制探索[9]。在本次報(bào)告中,我們通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,進(jìn)一步從基因表達(dá)層面對(duì)JQ1干擾HeLa細(xì)胞增殖的機(jī)制進(jìn)行分析,為揭示JQ1的抗癌機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

本研究聚焦于超級(jí)增強(qiáng)子相關(guān)lncRNAs的差異性表達(dá)在宮頸癌中的預(yù)后價(jià)值。2013年,Richard等人首次提出了超級(jí)增強(qiáng)子(super-enhancers,SE)的概念[14],隨后Soibam提出并鑒定出了超級(jí)增強(qiáng)子相關(guān)lncRNAs[10]。SE-lncRNAs屬于長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNAs)的一個(gè)亞組,其異常表達(dá)已在多種腫瘤中被報(bào)道。然而,超級(jí)增強(qiáng)子介導(dǎo)SE-lncRNAs參與癌癥發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制仍然不清楚,目前認(rèn)為,超級(jí)增強(qiáng)子通過募集轉(zhuǎn)錄子,強(qiáng)化了SE-lncRNAs的表達(dá),并通過下游基因發(fā)揮腫瘤調(diào)控作用[5]。在本研究中,我們鑒定出15個(gè)與JQ1處理有關(guān)的差異表達(dá)的SE-lncRNAs,提示SE-lncRNAs表達(dá)譜的改變,是JQ1發(fā)揮抗癌作用的重要機(jī)制。我們進(jìn)一步結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),分析了差異表達(dá)SE-lncRNAs在宮頸癌中的預(yù)后價(jià)值。我們共發(fā)現(xiàn)4個(gè)SE-lncRNAs對(duì)宮頸癌預(yù)后具有顯著影響,分別是LINC01106、SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021對(duì)宮頸癌的總生存具有顯著影響(P<0.05)。LINC01106已被證明是一種促癌因子,其表達(dá)水平增高與直腸癌預(yù)后變差有關(guān)[15]。我們的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表明,JQ1抑制了LINC01106的表達(dá),這與TCGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果相符,我們的研究為未來(lái)探討LINC01106作為JQ1靶點(diǎn)提供了思路。SNHG14已被發(fā)現(xiàn)對(duì)子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后有顯著影響[16]。ITGB2-AS1被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的進(jìn)展[17]。而LINC02021在腫瘤中的具體機(jī)制與表現(xiàn)尚未見表達(dá),未來(lái)可以通過該基因作為切入點(diǎn),探討其在宮頸癌等惡性腫瘤中的價(jià)值。

綜上所述,JQ1具有顯著抑制HeLa細(xì)胞增殖的能力。JQ1可能通過改變超級(jí)增強(qiáng)子相關(guān)lncRNAs的表達(dá)譜,進(jìn)而影響宮頸癌的總生存。SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021、LINC01106等基因的不同表達(dá)狀態(tài),對(duì)宮頸癌的預(yù)后具有顯著影響,但其具體機(jī)制,還需要未來(lái)開展實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步探索。