王曉紅，韓世玉，孫運(yùn)朋，張芳，羅澤虎，陳彪

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，貴陽(yáng) 550025）

0 引言

來(lái)自自然、農(nóng)業(yè)和工業(yè)來(lái)源的重金屬對(duì)耕地的污染已成為世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。鎘(Cd)是一種重要的重金屬污染物，被認(rèn)為是最具毒性的重金屬之一。鎘污染土壤的修復(fù)是當(dāng)前農(nóng)業(yè)面臨的一個(gè)重要問(wèn)題。用于這一目的的不同的物理和化學(xué)方法都存在成本高、勞動(dòng)強(qiáng)度大、土壤性質(zhì)改變和土壤原生微生物區(qū)系干擾等嚴(yán)重的局限性。相比之下，植物修復(fù)技術(shù)是一種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)高效、人們接受度較高的技術(shù)[2]。植物可以提取或穩(wěn)定土壤中的Cd，在污染土壤修復(fù)中得到廣泛應(yīng)用，一些Cd超富集植物可以在不影響其正常生長(zhǎng)的情況下從污染土壤中吸收和提取Cd。然而，多數(shù)Cd超富集植物是草本植物，其生物量小、根系淺、生長(zhǎng)緩慢。相比之下，人們逐漸提出使用具有大生物量和多分枝生根系統(tǒng)的木本植物來(lái)修復(fù)Cd污染土壤[3]。

桑樹(shù)是一個(gè)具有較高經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的木本植物，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、根系深、地上生物量大、耐剪伐等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于石漠化、鹽堿地、戈壁沙漠等多種植物修復(fù)系統(tǒng)中[4]。同時(shí)，桑樹(shù)還被證明能夠耐受Cd、Cr、Pb、Co、Cu等重金屬，具有修復(fù)重金屬污染土壤的極好潛力[5-7]。此外，利用桑樹(shù)進(jìn)行Cd污染土壤修復(fù)也是一種經(jīng)濟(jì)可行的做法，因?yàn)樯Ｈ~是家蠶的飼料，可用于蠶業(yè)發(fā)展。目前，多數(shù)研究集中在桑樹(shù)對(duì)Cd脅迫生理反應(yīng)或部分耐Cd 基因的功能研究[8-9]。全面闡明桑樹(shù)中Cd 吸收、積累、轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒的機(jī)制對(duì)進(jìn)一步提高桑樹(shù)在Cd污染土壤中的植物修復(fù)價(jià)值具有重要意義。

Cd 通過(guò)抑制光合作用、呼吸和氮代謝，擾亂水和礦物質(zhì)養(yǎng)分的吸收和分配，阻礙植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[10-11]。為減輕Cd 的毒害作用，植物已經(jīng)進(jìn)化出一系列的解毒策略，包括螯合作用、細(xì)胞壁固定、區(qū)室化作用和抗氧化系統(tǒng)解除重金屬毒害[12]。這些解毒機(jī)制的闡明需要廣泛的轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝研究。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是從分子水平闡明其機(jī)制的有效方法，該技術(shù)具有效率高、通量大、運(yùn)行時(shí)間快、準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，常用于發(fā)現(xiàn)和表征基因、分析功能基因變異、識(shí)別和量化轉(zhuǎn)錄本[13]。利用這種方法已鑒定出柳樹(shù)[3]、白菜[14]和蘿卜[15]等的Cd脅迫相關(guān)基因。此外，比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析已用于揭示植物中Cd積累的機(jī)制[14,16]。這些研究極大地提高了人們對(duì)Cd耐受和積累的分子調(diào)控機(jī)制的理解。本研究將桑樹(shù)幼苗在Cd 處理12、24、48 h后，采用Illumina HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序及分析，旨在了解桑樹(shù)對(duì)Cd的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、隔離和耐受機(jī)制，并在植物修復(fù)研究中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)于2021 年3—8 月在貴州省蠶業(yè)研究所植物生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)桑樹(shù)品種為‘桂桑優(yōu)12’，購(gòu)自廣西蠶業(yè)推廣總站。挑選完整、飽滿的種子，75%酒精滅菌60 s，無(wú)菌水沖洗5 次。將滅菌后的桑樹(shù)種子接種到MS 培養(yǎng)基上，16 h/8 h 光周期、24℃條件下萌發(fā)培養(yǎng)。待胚根長(zhǎng)至2 cm左右時(shí)取出幼苗，接種到添加50 μmol/L CdCl2的MS培養(yǎng)基中，每瓶接種10棵幼苗；同時(shí)，以未添加CdCl2的幼苗為對(duì)照。分別在處理12、24、48 h取樣，迅速用無(wú)菌水將幼苗沖洗干凈后放入液氮中速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

分別收集Cd 處理和對(duì)照組12、24、48 h 的桑樹(shù)幼苗提取RNA用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。總RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由北京百邁克生物公司完成。主要流程如下：用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；加入Fragmentation Buffer 將mRNA 進(jìn)行隨機(jī)打斷；以mRNA 為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第一條cDNA 鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H、DNA polymerase I 合成第二條cDNA 鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA；純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A 尾并連接測(cè)序接頭，然后用AMPure XP beads 進(jìn)行片段大小選擇；最后通過(guò)PCR 富集得到cDNA 文庫(kù)。對(duì)檢測(cè)合格的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組從頭組裝和功能注釋

fastq格式的原始讀取首先通過(guò)內(nèi)部的perl腳本進(jìn)行處理，從原始數(shù)據(jù)中刪除包含接頭的序列，超過(guò)10%未知核苷酸的序列以及低質(zhì)量的序列，以獲得干凈序列。使用Trinity軟件對(duì)干凈讀數(shù)進(jìn)行組裝。隨后，基于數(shù)據(jù)庫(kù)NR(NCBI non-redundant protein sequences)、Swiss-Prot、GO(Gene Ontology)、KOG/COG/eggNOG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and genome)，使用BLASTx對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋，期望值E-value≤10-5。使用HMMER 將預(yù)測(cè)的氨基酸序列與Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，期望值E-value≤10-10，獲得注釋信息。

1.4 Unigenes的差異表達(dá)分析

為了確定Cd 脅迫下的差異表達(dá)基因，用Bowtie軟件將干凈序列映射到組裝的轉(zhuǎn)錄組上。使用RSEM估計(jì)基因表達(dá)水平，unigenes 的表達(dá)水平用FPKM 歸一化。使用DEGSeq 鑒定Cd 處理樣本和對(duì)照組之間的差異基因。2 組之間的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.01 和|log2 Fold Change|≥1 被作為差異表達(dá)的閾值。隨后，使用topGO 和KOBAS 分別對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。

1.5 qRT-PCR分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，隨機(jī)選擇4個(gè)DEGs進(jìn)行qRT-PCR。以桑樹(shù)MaACT基因作為內(nèi)參基因[17]，根據(jù)各基因序列設(shè)計(jì)引物（表1），在Bio-Rad實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測(cè)差異基因表達(dá)水平。根據(jù)2×RealStar Green Fast Mixture（GenStar，北京）試劑盒的說(shuō)明書(shū)配制qRT-PCR反應(yīng)體系：2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL、模板cDNA 1 μL、正/反引物各0.5 μL(10 μmol/L)，ddH2O 8 μL。PCR程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。采用2ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 研究所用qRT-PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹(shù)幼苗轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、組裝與注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)

為全面分析Cd脅迫下桑樹(shù)幼苗的轉(zhuǎn)錄組，將對(duì)照組T1N (12 h)、T2N (24 h)、T3N (48 h)和Cd 處理組T1P(12 h)、T2P(24 h)、T3P(48 h)的6個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，6個(gè)樣本分別產(chǎn)生了37398420～49460056條原始序列，去除低質(zhì)量序列后，獲得了36139366～47208418 條干凈序列，占原始序列的94.99%以上，Q30在92.15%～93.44%之間（表2），說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較高，可以進(jìn)行下一步的數(shù)據(jù)整理和分析。使用Trinity軟件對(duì)干凈序列進(jìn)行從頭組裝，結(jié)果得到39758個(gè)unigenes，長(zhǎng)度在201～13312 bp之間。這些unigenes的平均長(zhǎng)度和N50 分別為1134.51、1968 bp，平均GC含量為41.72%（表3）。

表2 Illumina轉(zhuǎn)錄組測(cè)序總結(jié)

表3 非冗余轉(zhuǎn)錄本統(tǒng)計(jì)

2.2 Unigenes功能注釋與分類

組裝后，通過(guò)查詢7個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)基因功能，39758 個(gè)unigenes 得到注釋（表4）。其中，有26280 個(gè)unigenes(66.10%)在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了注釋，18589個(gè)unigenes(46.76%)在Swiss-prot 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了注釋，18606個(gè)unigenes(46.8%)在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了注釋，只有7201個(gè)unigenes(18.11%)在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了注釋。

表4 桑樹(shù)unigenes在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋結(jié)果

在KOG分析中，有13734個(gè)單基因被分成25組用于功能預(yù)測(cè)和分類（圖1）。其中，僅一般功能預(yù)測(cè)(3831)包含的基因數(shù)量最多，其次是翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶(1465)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(1344)、碳水化合物運(yùn)輸和代謝(833)和轉(zhuǎn)錄(762)。此外，18606 個(gè)單基因被注釋為一個(gè)或多個(gè)GO 術(shù)語(yǔ)，并被分為3 個(gè)類別和57 個(gè)組（圖2）。對(duì)于生物過(guò)程(biological process，BP)類別，細(xì)胞過(guò)程(12445)代表最大的組，其次是代謝過(guò)程(11271)、生物調(diào)控(5578)和刺激反應(yīng)(4620)。在分子功能(molecular function，MF)類別中，結(jié)合(12335)、催化活性(10218)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性(1229)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性(1190)是最常見(jiàn)的組。在細(xì)胞成分(cellular component，CC)類別中，前5 名分別是細(xì)胞組分(14509)、細(xì)胞器(9053)、膜(5491)、細(xì)胞器的部分(4674)和膜部分(4125)。

圖2 桑樹(shù)轉(zhuǎn)錄本GO注釋分類

2.3 差異表達(dá)基因分析

分別對(duì)Cd 脅迫和對(duì)照處理12 h (T1N_vs_T1P)、24 h (T2N_vs_T2P)、48 h (T3N_vs_T3P) 樣本的unigenes 進(jìn)行差異表達(dá)分析（圖3）。在T1N_vs_T1P組，共有6319 個(gè)差異表達(dá)基因，其中，4411 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，1908 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；7737 個(gè)基因在T2N_vs_T2P 中存在差異，其中，2129 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，5608 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；而在T3N_vs_T3P 中，共有6561 個(gè)差異表達(dá)基因，其中，3389 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，3172 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)（圖3A），表明桑樹(shù)幼苗在Cd 脅迫不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。值得注意的是，有534 個(gè)基因在不同時(shí)期均有差異（圖3B），其中有4 個(gè)基因(TRINITY_DN10246_c0_g4、TRINITY_DN9070_c0_g1、TRINITY_DN12871_c0_g1、TRINITY_DN7347_c1_g2)注釋為ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，其在Cd 脅迫過(guò)程中上調(diào)表達(dá)，表明它們可能在整個(gè)Cd脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用。

圖3 桑樹(shù)各處理組差異表達(dá)基因

2.4 差異表達(dá)基因GO富集分析

為了進(jìn)一步研究差異表達(dá)基因在Cd 脅迫下的生物學(xué)功能，進(jìn)行了GO 富集分析。Cd 脅迫12、24、48 h后，每組DEGs可分為生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能3類，選取富集顯著程度最高的10個(gè)GO條目分析（圖4）。在生物過(guò)程類別，Cd 脅迫不同時(shí)間后，差異表達(dá)基因主要集中于能量代謝、DNA代謝和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的組中，如ATP代謝過(guò)程(ATP metabolic process)、ADP代謝過(guò)程(ADP metabolic process)、DNA 重組(DNA recombination)、DNA 代謝過(guò)程(DNA metabolic process)和急性炎癥反應(yīng)(acute inflammatory response)等；在細(xì)胞組分類別，MHC 蛋白復(fù)合體(MHC protein complex)、NADPH 脫氫酶復(fù)合體[NAD(P)H dehydrogenase complex (plastoquinone)]、細(xì)胞(cell body)和細(xì)胞壁(cell wall)等是幾個(gè)富集的組；在分子功能類別，主要富集的組與能量轉(zhuǎn)換、DNA 復(fù)制與轉(zhuǎn)錄過(guò)程酶活性有關(guān)，例如，NADH 脫氫酶活性(NADH dehydrogenase activity)、RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子活性(RNA polymerase II transcription factor activity)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(DNA binding transcription factor activity)和DNA 聚合酶活性(DNA polymerase activity)等；其他富集的組還包括?；d體蛋白質(zhì)合成酶活性(3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase activity)和7-脫氧馬錢酸葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性(7-deoxyloganetic acid glucosyltransferase activity)等。這些GO 富集結(jié)果表明，Cd脅迫引起桑樹(shù)幼苗能量代謝、酶催化活性，以及DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)途徑基因的差異表達(dá)，這些過(guò)程可能在桑樹(shù)幼苗抵抗Cd脅迫中起到重要的作用。

2.5 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑以及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫(kù)。以q＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)KEGG中每個(gè)通路應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析，找出差異表達(dá)基因中顯著性富集的通路。結(jié)果如圖5 所示。在Cd 脅迫不同時(shí)間，谷胱甘肽代謝(glutathione metabolism)、倍半萜和三萜生物合成(sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis)、光合作用-天線蛋白(photosynthesis-antenna proteins)、苯丙素的生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、光合作用(photosynthesis)、戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換(pentose and glucuronate interconversions)、異黃酮生物合成(isoflavonoid biosynthesis)、半乳糖代謝(galactose metabolism)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、類黃酮生物合成(flavonoid biosynthesis)和DNA 復(fù)制(DNA replication)等11 條代謝通路差異表達(dá)基因富集程度較高，這些代謝通路可能與桑樹(shù)中Cd的代謝相關(guān)。

圖5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

2.6 差異轉(zhuǎn)錄因子分析

許多類型的轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與非生物和生物脅迫反應(yīng)，并在各種植物發(fā)育過(guò)程和脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。與對(duì)照相比，在Cd 脅迫不同時(shí)期，桑樹(shù)幼苗中共鑒定了148 個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，代表了36個(gè)不同的家族（圖6）。其中，bHLH、MYB、B3、NAC、MYB-related和WRKY家族是擁有差異基因較多的轉(zhuǎn)錄因子家族。

圖6 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子分類

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組的比較結(jié)果，隨機(jī)選擇4 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)（圖7），這些基因的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)到的基因表達(dá)變化是一致的，表明轉(zhuǎn)錄組譜數(shù)據(jù)是可靠的。

3 結(jié)論與討論

Cd是一種常見(jiàn)的環(huán)境污染物，對(duì)人類健康構(gòu)成潛在的威脅。如何有效地治理Cd 污染，降低Cd 對(duì)生物體的潛在風(fēng)險(xiǎn)，已成為一個(gè)重要的社會(huì)問(wèn)題[18]。雖然已經(jīng)開(kāi)展了各種研究來(lái)探討植物對(duì)Cd反應(yīng)的生理、遺傳和分子基礎(chǔ)，但桑樹(shù)中Cd 吸收、積累和運(yùn)輸?shù)姆肿诱{(diào)控機(jī)制在很大程度上仍未被認(rèn)識(shí)。作為一種重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，桑樹(shù)被認(rèn)為是解析重金屬調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的最重要的木本植物之一[9,19]。

最近，RNA-Seq方法已被廣泛應(yīng)用于許多重要的植物的從頭轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝，如蘿卜[15]、玉米[20]、柳樹(shù)[3]和水稻[21]。在本研究中，通過(guò)從頭轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和組裝，從Cd 脅迫下的桑樹(shù)幼苗中獲得了39758 個(gè)非冗余轉(zhuǎn)錄本?；赑fam、Nr、GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)BLAST和功能生物信息學(xué)分析，成功地注釋了全部轉(zhuǎn)錄本序列。本研究中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將為進(jìn)一步研究桑樹(shù)中Cd脅迫響應(yīng)基因和功能提供有價(jià)值的信息。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析使人們能夠全面了解桑樹(shù)響應(yīng)Cd 脅迫有關(guān)的基因和過(guò)程。在Cd 脅迫下，桑樹(shù)共檢測(cè)到15882 個(gè)差異表達(dá)基因。其中，分別有6319、7737、6561 個(gè)差異表達(dá)基因在脅迫12、24、48 h 被鑒定，表明Cd脅迫導(dǎo)致桑樹(shù)大量基因進(jìn)行了重編程。在這些差異表達(dá)基因中有4 個(gè)轉(zhuǎn)錄本被注釋為ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，它們可能對(duì)桑樹(shù)Cd耐受性具有重要作用。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛存在于動(dòng)植物中，負(fù)責(zé)各類底物在生物膜上的運(yùn)輸，包括重金屬、激素和羧酸鹽等[22]。已有的報(bào)道表明，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)Cd吸收轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要的調(diào)節(jié)作用，AtABCC3缺陷型擬南芥幼苗對(duì)不同Cd 濃度的敏感性增加，過(guò)度表達(dá)AtABCC3基因的幼苗對(duì)Cd的耐受性增加[23]。

Cd 通過(guò)多種毒害作用抑制植物生長(zhǎng)。已有研究表明，Cd會(huì)損害光合機(jī)構(gòu)，改變光合過(guò)程，最終導(dǎo)致植物生長(zhǎng)抑制[24]。Cd 還會(huì)改變氧化酶的活性來(lái)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，從而對(duì)植物產(chǎn)生不利影響[25]。相反，植物會(huì)通過(guò)增強(qiáng)防御反應(yīng)，如金屬螯合、液泡隔離、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)以及強(qiáng)化抗氧化機(jī)制來(lái)抵抗重金屬威脅[26]。本研究中，KEGG富集分析表明，具有差異表達(dá)的基因在谷胱甘肽代謝、次生代謝、光合作用、能量代謝和DNA復(fù)制等相關(guān)代謝通路富集程度較高。這些結(jié)果與構(gòu)樹(shù)類似，在Cd 脅迫下，構(gòu)樹(shù)差異表達(dá)基因在多個(gè)KEGG 途徑富集，包括苯丙烷生物合成、氧化磷酸化和類黃酮生物合成等[16]。表明植物在抵抗Cd 脅迫時(shí)具有相似的機(jī)制。

已有的研究表明，許多轉(zhuǎn)錄因子家族在Cd脅迫中起著重要作用。Hu 等[27]報(bào)道水稻的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子OsMYB45參與水稻的Cd脅迫反應(yīng)，OsMYB45突變導(dǎo)致對(duì)Cd 處理的超敏反應(yīng)，而OsMYB45過(guò)度表達(dá)補(bǔ)充了突變體表型。Yang等[28]報(bào)道ThWRKY7可能通過(guò)激活ThVHAc1基因表達(dá)來(lái)提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)Cd的抗性。此外，蘿卜中bZIP、MYB、ERF、C2H2、NAC 家族被證明在介導(dǎo)Cd 脅迫反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用[15]。bHLH、GRAS、WRKY、bZIP 家族在構(gòu)樹(shù)Cd 脅迫中具有復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[16]。在本研究中，大量轉(zhuǎn)錄因子在Cd 脅迫下差異表達(dá)，包括bHLH、MYB、NAC、WRKY等轉(zhuǎn)錄因子家族。表明不同轉(zhuǎn)錄因子家族的調(diào)控可能會(huì)觸發(fā)植物對(duì)Cd 脅迫的響應(yīng)，也說(shuō)明Cd信號(hào)調(diào)控的復(fù)雜性。

總之，本研究從桑樹(shù)幼苗轉(zhuǎn)錄組中分離到39758個(gè)非冗余轉(zhuǎn)錄本，其中15882個(gè)基因在Cd脅迫下受到差異調(diào)控。KEGG 富集分析表明，這些差異表達(dá)基因參與了許多代謝、生物合成和非生物脅迫響應(yīng)途徑的過(guò)程。同時(shí)，還鑒定了一些ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和大量轉(zhuǎn)錄因子，這些發(fā)現(xiàn)將為研究桑樹(shù)Cd脅迫反應(yīng)的分子機(jī)制提供有價(jià)值的信息。