周鑫 谷建海

(臨沂市腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部,山東 臨沂 276001)

近年來,胃癌已成為我國最常見的消化道惡性腫瘤之一。由于缺乏臨床癥狀多數(shù)患者診斷為晚期,化療是胃癌晚期患者的主要治療段,但往往產(chǎn)生骨髓抑制、肝腎功能損害、胃腸道反應(yīng)等毒副作用〔1〕。因此,尋找新的治療藥物已成為醫(yī)務(wù)工作者亟待解決的問題。橄欖苦苷作為橄欖油、橄欖葉等橄欖產(chǎn)品的主要生物酚成分,是公認(rèn)的抗氧化劑。橄欖苦苷通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖和腫瘤形成、逆轉(zhuǎn)放療抵抗在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌等腫瘤中具有抗癌活性〔2～5〕。有報道稱,橄欖苦苷磁性納米顆粒還可抑制胃癌細(xì)胞增殖,是預(yù)防和治療胃腺癌的潛在藥物〔6〕。微小RNA(miRNA)可作為治療人類疾病的潛在藥物靶點。既往研究報道,非小細(xì)胞肺癌中miR-4792表達(dá)降低,上調(diào)其表達(dá)具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲等生物學(xué)活性〔7〕。此外,miR-4792通過靶向叉頭框基因(FOX)C1能夠抑制鼻咽癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和侵襲〔8〕。但miR-4792在胃癌中是否發(fā)揮抗癌作用并不清楚。本研究旨在分析不同濃度橄欖苦苷對胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響,并探討其是否通過調(diào)控miR-4792表達(dá)發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑 胃癌細(xì)胞AGS購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;橄欖苦苷(純度≥98%)購于四川省維克奇生物科技有限公司;細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)、總蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物公司;康寧24-Transwell小室購自南京迅貝生物科技有限公司;上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)兔多克隆抗體、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)兔單克隆抗體、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔單克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗購自北京義翹神州科技股份公司;Lipofectamine2000、cDNA合成試劑盒購自美國Invitrogen公司;SYBR Premix Ex Taq購自日本TaKaRa公司;miR-4792模擬物(mimics)、抑制物(anti-miR-4792)及相應(yīng)對照(miR-NC、anti-miR-NC)購自上海生工生物公司。

1.2方法

1.2.1橄欖苦苷對AGS細(xì)胞增殖的影響 分別采用含0、100、200、400 μg/ml橄欖苦苷〔9〕的杜爾伯格伊戈爾培養(yǎng)基(DMEM)置于37 ℃、含5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱孵育AGS細(xì)胞,依次標(biāo)記為對照組、橄欖苦苷低劑量組、橄欖苦苷中劑量組、橄欖苦苷高劑量組。孵育48 h后,收集5×102個細(xì)胞均勻鋪6孔板,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10～12 d。甲醇固定細(xì)胞集落,0.5%結(jié)晶紫染色20 min。以顯微鏡下大于50個細(xì)胞的集落為有效克隆數(shù)。每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗獨立重復(fù)9次。同時將5×103個AGS細(xì)胞接種96孔板,加入含對應(yīng)劑量橄欖苦苷的DMEM培養(yǎng)液富于細(xì)胞48 h,更換為新鮮培養(yǎng)液,向各孔添加CCK-8溶液(10 μl/孔)孵育細(xì)胞2 h。設(shè)置450 nm波長,酶標(biāo)儀測量各孔光密度(OD)。增殖抑制率=(A對照組-A實驗組)/(A對照組-A空白組)×100%。每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗獨立重復(fù)9次。

1.2.2橄欖苦苷對AGS細(xì)胞遷移的影響 將1×104個橄欖苦苷處理48 h的AGS細(xì)胞接種6孔板,當(dāng)細(xì)胞生長至一層時,用200 μl槍頭尖端在細(xì)胞表面劃一直線。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌去除細(xì)胞碎片。在劃痕0 h、培養(yǎng)24 h后用Image軟件確定創(chuàng)面寬度。劃痕愈合率=〔寬度(0 h)-寬度(24 h)〕/寬度(0 h)×100%。每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗獨立重復(fù)9次。

1.2.3橄欖苦苷對AGS細(xì)胞侵襲的影響 采用包被80 μl基質(zhì)膠的24-Transwell小室(0.8 mg/ml)進(jìn)行侵襲實驗。收集橄欖苦苷處理48 h的AGS細(xì)胞,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。Transwell小室接種200 μl約2×104個懸浮細(xì)胞,下腔接種600 μl含10%血清培養(yǎng)基。常規(guī)孵育24 h,4%多聚甲醛室溫固定Transwell膜下表面15 min,PBS洗2次,0.5%結(jié)晶紫染色30 min。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇3個視野對染色的侵襲性細(xì)胞拍照,以平均值表示AGS細(xì)胞侵襲數(shù)量。每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗獨立重復(fù)9次。

1.2.4橄欖苦苷對AGS細(xì)胞miR-4792表達(dá)的影響 使用Trizol試劑從對照組、橄欖苦苷處理組細(xì)胞中提取總RNA。采用cDNA合成試劑盒獲得cDNA,然后SYBR Premix Ex Taq進(jìn)行實時定量PCR(RT-qPCR)。內(nèi)源對照為U6。PCR參數(shù)為:95 ℃ 10 min,95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。PCR循環(huán)結(jié)束后,進(jìn)行熔解曲線分析。AGS細(xì)胞中miR-4792的相對表達(dá)水平以2-ΔΔCt法計算。每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗獨立重復(fù)9次。

1.2.5橄欖苦苷對AGS細(xì)胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響 總蛋白提取試劑盒分離橄欖苦苷處理組AGS細(xì)胞總蛋白,用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒進(jìn)行定量。蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后,轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯膜,5%脫脂牛奶封閉后,然后對膜進(jìn)行免疫檢測。采用1∶1 000稀釋的E-cadherin一抗、N-cadherin一抗、內(nèi)參GAPDH一抗室溫孵育膜2 h。再用1∶1 000稀釋山羊抗兔IgG二抗室溫孵育膜1 h。滴加化學(xué)發(fā)光檢測試劑進(jìn)行顯色。Quantify One軟件分析測定目的蛋白條帶相對灰度值。每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗獨立重復(fù)9次。

1.2.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將2×105個對數(shù)期AGS細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng),按照Lipofectamine2000說明分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-4792 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-4792至60%匯合AGS細(xì)胞,隨后收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞。轉(zhuǎn)染miR-NC、轉(zhuǎn)染miR-4792 mimics的AGS細(xì)胞記為miR-NC組、miR-4792組。用含400 μg/ml橄欖苦苷的DMEM培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染anti-miR-NC或者轉(zhuǎn)染anti-miR-4792細(xì)胞48 h,記為橄欖苦苷+anti-miR-NC組、橄欖苦苷+anti-miR-4792組。

1.2.7過表達(dá)miR-4792或者抑制miR-4792表達(dá)聯(lián)合橄欖苦苷處理對AGS細(xì)胞生物學(xué)性的影響 收集miR-NC組、miR-4792組、橄欖苦苷+anti-miR-NC組、橄欖苦苷+anti-miR-4792組AGS細(xì)胞,按照上述步驟觀察過表達(dá)miR-4792或者抑制miR-4792表達(dá)聯(lián)合橄欖苦苷對AGS細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗獨立重復(fù)9次。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1橄欖苦苷對胃癌AGS細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較,橄欖苦苷處理組AGS細(xì)胞克隆形成個數(shù)均顯著下降,增殖抑制率顯著升高(均P<0.05)。見表1、圖1。

表1 橄欖苦苷對胃癌AGS細(xì)胞增殖的影響

2.2橄欖苦苷對胃癌AGS細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與對照組比較,橄欖苦苷處理組AGS細(xì)胞N-cadherin蛋白表達(dá)量、劃痕愈合率、侵襲數(shù)量顯著降低,E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高(均P<0.05)。見圖2、表2、圖3。

圖2 橄欖苦苷對胃癌AGS細(xì)胞遷移(×200)、侵襲(結(jié)晶紫染色,×400)及形態(tài)(×200)的影響

1～4:對照組、橄欖苦苷低劑量組、橄欖苦苷中劑量組、橄欖苦苷高劑量組圖3 Western印跡檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)

圖4 miR-4792過表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響

圖5 miR-4792過表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞克隆形成的影響(結(jié)晶紫染色,×20)

圖6 miR-4792過表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞遷移(×200)、侵襲(結(jié)晶紫染色,×400)及形態(tài)(×200)的影響

表2 橄欖苦苷對胃癌AGS細(xì)胞遷移、侵襲及miR-4792表達(dá)的影響

2.3橄欖苦苷對胃癌AGS細(xì)胞miR-4792表達(dá)的影響 與對照組比較,橄欖苦苷處理組AGS細(xì)胞miR-4792表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.4miR-4792過表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較,miR-4792組AGS細(xì)胞miR-4792表達(dá)顯著升高(P<0.05),提示miR-4792過表達(dá)的AGS細(xì)胞株構(gòu)建成功。與miR-NC組比較,miR-4792組AGS細(xì)胞克隆形成個數(shù)、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)量、N-cadherin蛋白表達(dá)量顯著下降,而增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。見圖4～6、表3。

表3 miR-4792過表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.5抑制miR-4792表達(dá)逆轉(zhuǎn)了橄欖苦苷(400 μg/ml)對胃癌AGS細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響 與橄欖苦苷+anti-miR-NC組比較,橄欖苦苷+anti-miR-4792組AGS細(xì)胞miR-4792表達(dá)量顯著降低,細(xì)胞克隆形成個數(shù)、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)量、N-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高,而增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著降低(均P<0.05)。見圖7～圖9、表4。

1,2:橄欖甘苷+anti-miR-NC組、橄欖苦苷+anti-miR-4792組圖7 抑制miR-4792表達(dá)逆轉(zhuǎn)了橄欖苦苷對胃癌AGS細(xì)胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響

圖8 抑制miR-4792表達(dá)逆轉(zhuǎn)了橄欖苦苷對胃癌AGS細(xì)胞克隆形成的影響(結(jié)晶紫染色,×20)

圖9 抑制miR-4792表達(dá)逆轉(zhuǎn)了橄欖苦苷對胃癌AGS細(xì)胞遷移(×200)、侵襲(結(jié)晶紫染色,×400)及形態(tài)(×200)的影響

表4 抑制miR-4792表達(dá)逆轉(zhuǎn)了橄欖苦苷對胃癌AGS細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

3 討 論

橄欖苦苷在多種人類癌癥中顯示出抗腫瘤特性。Zhang等〔10〕研究表明,橄欖苦苷在體外對食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用,并抑制體內(nèi)異種移植瘤形成。Liu等〔11〕證實橄欖苦苷可消除核因子(NF)-κB激活級聯(lián)反應(yīng),進(jìn)而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞大量凋亡。此外,Lu等〔12〕發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷可能通過激活自噬來抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究提示橄欖苦苷對胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為具有抑制作用。有數(shù)據(jù)表明,EMT與癌細(xì)胞的遷移、侵襲及癌癥轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)〔13〕。在EMT過程中,上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào),間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)上調(diào)〔14〕。本研究結(jié)果表明,橄欖苦苷可能通過抑制EMT進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲。

miRNA表達(dá)失調(diào)可影響細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖、凋亡,參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。前期研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌中橄欖苦苷通過下調(diào)致癌基因miR-21和miR-155的表達(dá)來誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡,抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲〔15,16〕。橄欖苦苷在體外和體內(nèi)均能增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性,其機(jī)制與抑制氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α誘導(dǎo)的miR-519d表達(dá)有關(guān)〔17〕。此外,橄欖苦苷通過調(diào)控Let-7d表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞表現(xiàn)出抗癌作用〔18〕。本研究結(jié)果提示,橄欖苦苷在胃癌中的抗腫瘤作用可能與上調(diào)miR-4792有關(guān)。據(jù)報道,miR-4792在非小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌、急性髓性白血病中起著抑癌作用,miR-4792通過靶向Kindlin-3抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔7,8,19〕。本研究結(jié)果說明,橄欖苦苷對胃癌細(xì)胞AGS增殖、遷移和侵襲的抑制作用可能是通過上調(diào)miR-4792表達(dá)實現(xiàn)的。