黃輝 蔣勁松 周明朗 代國勝 冀慶軍 何苗 柴偉 孫敬武

(1亳州市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,安徽 亳州 236800;2中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院))

鼻息肉是耳鼻喉科常見疾病,但目前鼻息肉發(fā)病原因及機(jī)制尚未完全清楚。隨著鼻內(nèi)鏡及各種醫(yī)療科技的不斷進(jìn)步,治療已不再是難以實(shí)現(xiàn)的目標(biāo),可是仍有部分患者治療后復(fù)發(fā)。研究表明,鼻息肉的進(jìn)展與許多細(xì)胞因子有關(guān)〔1,2〕。也有研究發(fā)現(xiàn)多種慢性炎癥參與鼻息肉發(fā)病〔3〕。白細(xì)胞介素(IL)-35是一種多源性細(xì)胞因子,在炎癥反應(yīng)中激活血管內(nèi)皮細(xì)胞及白細(xì)胞。黏蛋白(MUC)5AC是腺體細(xì)胞產(chǎn)生,在呼吸系統(tǒng)中分泌。免疫球蛋白(Ig)E由呼吸道及胃黏膜等層漿細(xì)胞產(chǎn)生。目前這三類呼吸道相關(guān)因子與鼻息肉發(fā)生關(guān)系的臨床研究較少。本文探討RNA干擾技術(shù)沉默MUC5AC、IgE、IL-35基因?qū)Ρ丘つど掀ぜ?xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1一般材料 收集亳州市人民醫(yī)院2019年6月至2020年7月手術(shù)切除后存檔的慢性鼻竇炎鼻息肉組織石蠟包埋標(biāo)本40例,其中男27例,女13例,年齡31～71歲,平均(52.33±10.41)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)首次鼻息肉摘除術(shù)者;(2)術(shù)前2 d未使用激素藥物治療;(3)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)精神異常者;(2)鼻內(nèi)真菌感染者;(3)支氣管哮喘者;(4)嚴(yán)重系統(tǒng)疾病者。選擇正常下鼻甲組織對照組,其中男16例,女12例,年齡35～72歲,平均(51.04±10.37)歲。兩組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),符合道德倫理要求。

1.2材料和儀器 胰蛋白酶購自杭州昕誠生物科技有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自廣州捷威斯生物科技有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自信裕生物(上海)公司;MUC5AC、IgE、IL-35、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3單克隆抗體的二抗均購于美國Abcam;細(xì)胞凋亡試劑盒購于ACTGene公司;酶標(biāo)儀購于北京沃格東方科技有限公司;流式細(xì)胞儀購自廣州泰勒生物科技有限公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自綿陽榮盛科技公司。特異性siRNA設(shè)計(jì)由上海閃晶生物科技公司合成。

1.3MUC5AC、IgE、IL-35表達(dá)檢測 將鼻息肉組織及下鼻甲組織研磨,加入裂解液,在冰塊上靜置1 h,設(shè)定12 000 r/min離心20 min,取出上清液。根據(jù)試劑盒操作說明檢測MUC5AC、IgE、IL-35的蛋白濃度。依次變性、電泳,凝膠,轉(zhuǎn)膜,封閉。加入一抗,4 ℃孵育過夜,TBST緩沖液洗膜后加入羊抗鼠IgG,37 ℃孵育2 h。TBST清洗后加入電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光劑顯影,凝膠成像。選定β-actin為內(nèi)參,分析蛋白表達(dá)水平。

1.4鼻黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng) 將鼻息肉組織〔4〕,用PBS沖洗后加入含有蛋白酶的培養(yǎng)液中,在4 ℃中放置18 h后制成細(xì)胞懸液。加入錐蟲藍(lán)后稀釋細(xì)胞懸液,在37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后放入細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、霍亂霉素、氫化可的松、維生素A酸,三碘甲狀腺氨酸、表皮生長因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)基,隔天換液,培養(yǎng)3～4 d。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的鼻黏膜上皮細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中,然后加入細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)24 h。并分為MUC5AC對照組、MUC5AC siRNA組及MUC5AC si-NC組,IgE對照組、IgE siRNA組及IgE si-NC組,IL-35對照組、IL-35 siRNA組及IL-35 si-NC組,分別轉(zhuǎn)染磷酸鹽緩沖液、200 ng/ml miR-21 mimic和200 ng/ml miR-NC,轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液。

1.6細(xì)胞凋亡檢測 將細(xì)胞接種于孔板中,處理后用預(yù)冷的PBS清洗2遍細(xì)胞,加入緩沖液制成重懸細(xì)胞,加入5 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC-AnnexinⅤ)混勻后加入染料,室溫下避光孵育15 min,將細(xì)胞懸浮液在流式細(xì)胞儀上檢測,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率。

1.7凋亡蛋白caspase3檢測 轉(zhuǎn)然后細(xì)胞培養(yǎng)48 h,在冰上進(jìn)行裂解反應(yīng),在12 000 r/min的離心機(jī)上離心15 min,收取上清液后用BCA試劑盒檢測caspase3蛋白表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素分析。

2 結(jié) 果

2.1鼻黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)情況 培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞圓形,為貼壁生長時(shí)期,部分呈多角形;3 d后細(xì)胞多聚集生長,呈長梭形;6 d后細(xì)胞集落進(jìn)一步增大、增多。見圖1。

圖1 鼻黏膜細(xì)胞生長情況(×200)

2.2鼻息肉組織相對蛋白表達(dá) IL-35在鼻息肉組織中的表達(dá)顯著低于鼻甲組織(P<0.05)。MUC5AC、IgE在鼻息肉組織中表達(dá)顯著高于鼻甲組織(P<0.05)。見表1。

表1 MUC5AC、IgE、IL-35鼻息肉組織中表達(dá)比較

2.3轉(zhuǎn)染后相對蛋白表達(dá) MUC5AC、IgE、IL-35的si-NC組(1.31±0.40、0.74±0.31、0.59±0.06)轉(zhuǎn)染與其相對應(yīng)的對照組相對蛋白表達(dá)(1.32±0.42、0.78±0.36、0.60±0.03)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在轉(zhuǎn)染特異性siRNA后,其相對應(yīng)的相對蛋白表達(dá)量(0.78±0.36、0.41±0.12、0.22±0.03)均明顯降低(均P<0.05)。

2.4細(xì)胞凋亡變化 IL-35對鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡具有抑制作用,結(jié)果顯示,IL-35 siRNA組細(xì)胞凋亡率〔(25.16±3.02)%〕顯著高于si-NC組〔(17.85±2.37)%;t=4.661,P<0.01〕。MUC5AC可以促進(jìn)鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡,MUC5AC siRNA組凋亡率〔(10.29±2.04)%〕明顯低于si-NC組(t=5.920,P<0.01)。IgE siRNA組細(xì)胞凋亡率〔(8.22±1.84)%〕明顯低于si-NC組(t=7.846,P<0.01)。見圖2。

圖2 各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡的影響

2.5凋亡相關(guān)蛋白caspase3表達(dá) IL-35 siRNA組caspase3表達(dá)量(1.21±0.07)相對于對照組(1.02±0.04)明顯升高(P<0.05)。IgE siRNA組、MUC5AC siRNA組caspase3表達(dá)量(0.33±0.02、0.47±0.05)相對于對照組明顯降低(P<0.05)。見圖3。

1～4:對照組、IL-35 siRNA組、IgE siRNA組、MUC5AC siRNA組圖3 各組凋亡相關(guān)蛋白caspase3表達(dá)

3 討 論

慢性鼻-鼻竇炎是耳鼻喉科常見的一類鼻腔黏膜變性疾病,發(fā)病后會嚴(yán)重影響到患者生活質(zhì)量及健康狀況,主要臨床特征有鼻塞、流膿涕、嗅覺下降及頭痛〔4〕。鼻息肉是慢性鼻-鼻竇炎特殊類型,也是常見慢性炎癥反應(yīng)疾病。RNA干擾(RNAi)是特異性的RNA轉(zhuǎn)錄后出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。在上世紀(jì)末期發(fā)現(xiàn)的RNAi其實(shí)是siRNA與對應(yīng)的mRNA特異結(jié)合、降解來阻止mRNA翻譯,引起生物細(xì)胞內(nèi)同源基因發(fā)生特異性沉默,已經(jīng)成為調(diào)控基因表達(dá)的方法之一〔5〕。研究RNAi技術(shù)對疾病發(fā)生和基因改變的機(jī)制,能夠幫助專家進(jìn)一步了解通過基因影響細(xì)胞,為從基因水平疾病治療提供理論依據(jù)和思路〔6〕。

MUC是一類主要由多糖組成的糖蛋白,因其大分子結(jié)構(gòu)影響?zhàn)ひ旱牧髯儗W(xué)特性。已發(fā)現(xiàn)的20種黏蛋白中,絕大多數(shù)的黏蛋白的表達(dá)在人呼吸道黏膜中。MUC5AC被認(rèn)為是呼吸道黏液的重要成分〔7〕。正常的人體中,多種黏蛋白對黏膜有著很大的保護(hù)作用,其中MUC5AC對氣道黏液高分泌反應(yīng)具有重要的指導(dǎo)意義,MUC5B可以清除病毒,具有非特異性免疫應(yīng)答作用,MUC7對細(xì)菌具有清理作用〔8,9〕。本研究結(jié)果顯示,鼻息肉組織中MUC5AC過表達(dá),MUC5AC siRNA組成功誘導(dǎo)鼻黏膜細(xì)胞MUC5AC基因沉默,轉(zhuǎn)染后免疫組化檢測顯示MUC5AC表達(dá)被靶向抑制。染色凋亡結(jié)果表明,下調(diào)MUC5AC可降低鼻黏膜細(xì)胞凋亡。caspase蛋白是細(xì)胞凋亡主要蛋白,其中caspase3是執(zhí)行凋亡的啟動者。通過激活caspase3,觸發(fā)相關(guān)凋亡的蛋白表達(dá)。并且caspase3蛋白表達(dá)水平與臨床多種疾病產(chǎn)生與發(fā)展過程密切相關(guān),凋亡蛋白可能參與鼻息肉的發(fā)病過程。本研究結(jié)果提示,MUC5AC蛋白可能通過調(diào)控caspase3來影響鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡。

IgE如今大多數(shù)用于診斷過敏反應(yīng)的主要指標(biāo)〔10〕,雖然IgE在人類的血清中含量較少,但其在免疫炎癥免疫反應(yīng)中起重要作用〔11〕。IgE對鼻竇炎鼻息肉的發(fā)生有重要影響,IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)引起鼻炎、鼻竇疼痛、癢等多種癥狀。研究表明,IgE在鼻息肉中的表達(dá)水平增加,引發(fā)嚴(yán)重的嗜酸性炎癥〔12,13〕。但I(xiàn)gE介導(dǎo)的鼻息肉促炎反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制仍有待充分研究。

IL-35作為自身免疫性調(diào)控因子在疾病中被研究,其作用是通過誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的功能紊亂來抑制機(jī)體的免疫功能,同時(shí)還能夠調(diào)節(jié)多類細(xì)胞因子〔14,15〕。IL-35參與疾病炎癥反應(yīng)發(fā)生,如哮喘和變應(yīng)性鼻炎等,它在多種疾病表達(dá)有明顯差異〔16,17〕。本研究結(jié)果推測,可能是IL-35通過抑制caspase3表達(dá)來抑制鼻黏膜細(xì)胞凋亡。有學(xué)者猜測〔18〕,IL-35通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞抑制免疫反應(yīng),所以鼻息肉組織IL-35表達(dá)水平也低于正常人。

綜上,IL-35在鼻息肉組織中低表達(dá),MUC5AC、IgE在鼻息肉組織中高表達(dá),沉默MUC5AC、IgE的表達(dá)能抑制鼻黏膜細(xì)胞凋亡,沉默IL-35能促進(jìn)鼻黏膜細(xì)胞凋亡。