王磊 郭繼東 韓藝輝 王喜萍 趙雪燕

(1石河子市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,新疆 石河子 832000;2北京阜外醫(yī)院冠心病一病區(qū))

急性心肌梗死(AMI)是全球范圍內(nèi)心力衰竭和猝死的主要原因。在AMI中及時進(jìn)行閉塞血管的血運重建是搶救缺血性心肌的常用方法,但當(dāng)氧氣重新輸送至缺氧心肌時,就會發(fā)生心臟缺血/再灌注(I/R)損傷〔1〕。心臟I/R會引起心肌細(xì)胞功能障礙,導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡,可能會增加心肌梗死面積增加,加重患者的病情〔2〕。因此,解決或減輕局部缺血和再灌注損傷仍然是一個挑戰(zhàn)。目前,在許多臨床前研究中抑制I/R損傷的治療主要集中在I/R損傷的發(fā)生和調(diào)節(jié)機(jī)制上〔3〕。氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥和細(xì)胞死亡引起的組織改變在I/R損傷的發(fā)展中具有重要作用。但是,I/R損傷的確切機(jī)制仍不完全清楚。

自噬是維持缺血性損傷過程中細(xì)胞正常代謝平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的必要條件,在缺血和再灌注過程中都非常重要〔4〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α是AMI后心臟適應(yīng)性變化過程中的主要調(diào)節(jié)因子之一,當(dāng)細(xì)胞受到低氧刺激時,上調(diào)HIF-1α的表達(dá),可通過誘導(dǎo)自噬發(fā)揮對心肌的保護(hù)作用〔5〕;且HIF-1α的表達(dá)水平與缺氧誘導(dǎo)的自噬程度顯著相關(guān)〔6〕。但HIF-1α通過何種途徑誘導(dǎo)自噬激活尚不十分明確。N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾是哺乳動物信使RNA的最常見修飾,研究發(fā)現(xiàn)在缺氧/復(fù)氧(H/R)處理的心肌細(xì)胞和I/R處理的小鼠心臟中,m6A修飾增加,參與H/R處理的心肌細(xì)胞自噬和凋亡〔7〕。YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白(YTHDF)1作為RNA m6A甲基化重要的閱讀器,是RNA m6A甲基化發(fā)揮主要功能的效應(yīng)分子,也是HIF-1α轉(zhuǎn)錄因子的新型直接靶基因〔8〕,與心肌細(xì)胞的增殖和心臟再生有關(guān)〔9〕。而HIF-1α對H/R后心肌細(xì)胞自噬的影響是否與YTHDF1有關(guān)還未可知,本研究旨在探討HIF-1α對H/R后心肌細(xì)胞自噬的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實驗材料 小鼠心肌細(xì)胞(美國ATCC,YB-3031)購自上海鈺博生物科技有限公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Gbico公司;Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑(L3037)購自Sigma-Aldrich;pcDNA3.1-HIF-1α和其陰性對照質(zhì)粒(pcDNA3.1-NC)及RT-qPCR引物均由上海GenePharma合成;YTHDF1 siRNA和其陰性對照(siRNA-NC)購自Santa Cruz Biotechnology;CCK-8試劑盒(C0038)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1062L)、RIPA裂解液(P0013B)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(P0010)、自噬雙標(biāo)腺病毒Ad-mCherry-GFP-LC3B(mCherry-GFP-LC3B腺病毒,C3011-1ml)均購自碧云天生物科技公司;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(二硝基苯肼比色法,A020-1-2)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)測定試劑盒(免疫抑制法,E006-1-1)、肌鈣蛋白(cTn)I測定試劑盒(膠乳增強(qiáng)免疫比濁法)(E019-1-1)均購自南京建成生物工程研究所;兔抗HIF-1α(ab179483)、YTHDF1(ab252346)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3(ab128025)、Beclin-1(ab207612)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP,ab205718)購自英國abcam公司;兔抗自噬相關(guān)蛋白2同源物A(ATG2A,15011)、自噬相關(guān)蛋白(ATG)14(96752)購自美國Cell Signaling Technology公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司);ABI Prism? 7300型熒光定量PCR系統(tǒng)(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡、IX73倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司;BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀購自美國BD公司;蛋白轉(zhuǎn)膜裝置、ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理 將小鼠心肌細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,并在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔1 d更換1次培養(yǎng)基。在細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時開始實驗。

為了模擬I/R損傷,對心肌細(xì)胞進(jìn)行了H/R處理。取對數(shù)生長期的心肌細(xì)胞,胰蛋白酶消化后以6×106個/ml的濃度接種在96孔板中,待細(xì)胞融合約80%后,使用Lipofectamine3000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞。細(xì)胞分為對照組(正常培養(yǎng))、H/R組(行H/R處理:在37 ℃下于含1% O2、94% N2和5% CO2的缺氧培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,然后在含氧量正常的條件下培養(yǎng)6 h)、pcDNA3.1-NC組(pcDNA3.1-HIF-1α的陰性對照轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞48 h后進(jìn)行H/R處理)、HIF-1α過表達(dá)組(pcDNA3.1-HIF-1α轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞48 h后進(jìn)行H/R處理)、HIF-1α過表達(dá)+si-NC組(pcDNA3.1-HIF-1α和YTHDF1 siRNA陰性對照共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞,48 h后進(jìn)行H/R處理)、HIF-1α過表達(dá)+si-YTHDF1組(pcDNA3.1-HIF-1α和YTHDF1 siRNA共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞,48 h后進(jìn)行H/R處理)。

1.2.2實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測細(xì)胞中HIF-1α和YTHDF1 mRNA表達(dá) 使用TRIzol試劑提取細(xì)胞中總RNA,分光光度計測量總RNA的濃度,然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20 μl):cDNA(200 ng/μl) 2 μl,SYBR? Premix Ex TaqTM(2×) 10 μl,上下游(引物序列:HIF-1α上游引物:5′-CCACAGGACAGTACAGGATG-3′、下游:5′-TCAAGTCGTGCTGAATAATAC-3′;YTHDF1上游引物:5′-GTGTATGAGGTGGTCAGCAT-3′、下游:5′-CTTGTTGAGGGAGTCACTGT-3′;β-actin上游引物:5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′、下游:5′-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′;各0.4 μl,ddH2O 7.2 μl。循環(huán)條件:94 ℃ 10 min,然后再94 ℃持續(xù)10 s,60 ℃ 20 s和72 ℃ 1 min進(jìn)行40個循環(huán)。用β-actin作為內(nèi)參對照,采用2-ΔΔCt方法計算HIF-1α和YTHDF1 mRNA相對表達(dá)量。

1.2.3CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將心肌細(xì)胞以每孔2×103個細(xì)胞的密度接種在96孔板中,培養(yǎng)過夜,按照1.2.1中步驟進(jìn)行分組及處理。復(fù)氧6 h后,向每孔中加入CCK-8溶液10 μl,于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h,然后于450 nm波長處測定各孔吸光度(A),計算細(xì)胞活力。以培養(yǎng)基為空白孔調(diào)零,細(xì)胞活力=(實驗組A值-空白孔A值)/(對照組A值-空白孔A值)×100%。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 心肌細(xì)胞按照1.2.1中進(jìn)行分組與處理,復(fù)氧6 h后,用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞,PBS洗滌后加500 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml。取細(xì)胞懸浮液100 μl,然后分別加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5 μl,避光孵育15 min。再加入400 μl 1×結(jié)合緩沖液,用流式細(xì)胞儀檢測各組心肌細(xì)胞凋亡率。

1.2.5試劑盒檢測細(xì)胞上清液中CK-MB、LDH、cTnI水平 收集各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液,4 ℃、3 000 r/min離心10 min,分離上清,二硝基苯肼法測定上清液中LDH水平,免疫抑制法檢測CK-MB水平,免疫比濁法檢測cTnI水平。具體步驟參考試劑盒說明書操作進(jìn)行。

1.2.6mCherry-GFP-LC3重組腺病毒轉(zhuǎn)染的免疫熒光法檢測心肌細(xì)胞自噬 將mCherry-GFP-LC3腺病毒以40 MOI(感染復(fù)數(shù))于37 ℃在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)導(dǎo)于24孔板中培養(yǎng)的心肌細(xì)胞(1×105個/孔),持續(xù)24 h。轉(zhuǎn)導(dǎo)后,將細(xì)胞與新鮮培養(yǎng)基在37 ℃下孵育12 h,按照1.2.1中步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染和H/R,并于激光共聚焦顯微鏡下隨機(jī)選擇3個區(qū)域,計數(shù)每個細(xì)胞的自噬體(mCherry+GFP黃色)和自噬溶酶體(mCherry紅色)的數(shù)量。

1.2.7Western印跡檢測心肌細(xì)胞HIF-1α、YTHDF1及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞,使用RIPA裂解液提取細(xì)胞中蛋白質(zhì)。BCA法測定總蛋白濃度后,通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(zhì)樣品(40～60 μg),并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下,用5%脫脂牛奶封閉2 h,然后在4 ℃下與一抗(HIF-1α、YTHDF1、LC3、ATG2A、ATG14、Beclin1、β-actin,稀釋度1∶500)孵育過夜。隨后與辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的二抗(稀釋度1∶1 000)在室溫下孵育1 h,并使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)進(jìn)行檢測。以β-actin為內(nèi)參蛋白,分析結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗重復(fù)至少3次,使用GraphPad Prism9.0軟件進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov檢驗、t檢驗、方差分析、Bonferroni事后檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組心肌細(xì)胞HIF-1α和YTHDF1的表達(dá) 與對照組相比,H/R組心肌細(xì)胞中HIF-1α和YTHDF1mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05);與H/R組相比,HIF-1α過表達(dá)組、HIF-1α過表達(dá)+si-NC組、HIF-1α過表達(dá)+si-YTHDF組心肌細(xì)胞中HIF-1α和YTHDF1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05);與HIF-1α過表達(dá)組相比,HIF-1α過表達(dá)+si-YTHDF1組YTHDF1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 各組HIF-1α、YTHDF1表達(dá)、細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡率

1～6:對照組,H/R組,pcDNA3.1-NC組,HIF-1α過表達(dá)組,HIF-1α過表達(dá)+si-NC組,HIF-1α過表達(dá)+si-YTHDF1組;圖4同圖1 Western印跡檢驗各組心肌細(xì)胞中HIF-1α和YTHDF1蛋白表達(dá)

2.2各組心肌細(xì)胞活力與細(xì)胞凋亡率 與對照組相比,H/R組心肌細(xì)胞活力顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與H/R組相比,HIF-1α過表達(dá)組、HIF-1α過表達(dá)+si-NC組、HIF-1α過表達(dá)+si-YTHDF組心肌細(xì)胞活力顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與HIF-1α過表達(dá)組相比,HIF-1α過表達(dá)+si-YTHDF1組細(xì)胞活力顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組心肌細(xì)胞凋亡率

2.3各組LDH、CK-MB、cTnI水平 與對照組相比,H/R組LDH、cTnI、CK-MB水平顯著升高(P<0.05);與H/R組相比,HIF-1α過表達(dá)組、HIF-1α過表達(dá)+si-NC組、HIF-1α過表達(dá)+si-YTHDF組心肌細(xì)胞LDH、cTnI、CK-MB水平顯著降低(P<0.05);與HIF-1α過表達(dá)組相比,HIF-1α過表達(dá)+si-YTHDF1組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH、cTnI、CK-MB水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組LDH、CK-MB、cTnI水平、自噬體和自噬溶酶體數(shù)量比較

2.4各組心肌細(xì)胞自噬情況 對照組心肌細(xì)胞表現(xiàn)出基礎(chǔ)自噬,很少有自噬體和自噬溶酶體。與對照組相比,H/R組Ad-LC3-心肌細(xì)胞自噬體和自噬溶酶體數(shù)量顯著增加(P<0.05);與H/R組相比,HIF-1α過表達(dá)組、HIF-1α過表達(dá)+si-NC組、HIF-1α過表達(dá)+si-YTHDF組Ad-LC3-心肌細(xì)胞自噬體和自噬溶酶體數(shù)量顯著增加(P<0.05);與HIF-1α過表達(dá)組相比,HIF-1α過表達(dá)+si-YTHDF1組心肌細(xì)胞自噬體和自噬溶酶體數(shù)量顯著降低(P<0.05)。見表2、圖3。

圖3 各組心肌細(xì)胞表達(dá)(mCherry-GFP-LC3免疫熒光,×1 000)

2.5各組心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 與對照組相比,H/R組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1、ATG2A、ATG14表達(dá)顯著增加(P<0.05);與H/R組相比,HIF-1α過表達(dá)組、HIF-1α過表達(dá)+si-NC組、HIF-1α過表達(dá)+si-YTHDF組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1、ATG2A、ATG14表達(dá)顯著增加(P<0.05);與HIF-1α過表達(dá)組相比,HIF-1α過表達(dá)+si-YTHDF1組心肌細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1、ATG2A、ATG14表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表3、圖4。

表3 各組心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

圖4 Western印跡檢測各組心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

自噬在人體許多疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,包括AMI。AMI伴有多種病理特征,例如心肌細(xì)胞凋亡和心肌重塑。心肌細(xì)胞凋亡是AMI后心肌損傷的主要原因,缺氧是引起心肌細(xì)胞凋亡的重要因素。適度的心肌自噬可減少心肌細(xì)胞的凋亡并改善心肌細(xì)胞的存活〔10〕。

HIF-1α是低氧環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,負(fù)責(zé)誘導(dǎo)有助于適應(yīng)缺氧的基因表達(dá),如可調(diào)節(jié)一系列與糖酵解、葡萄糖代謝、線粒體功能、細(xì)胞存活、凋亡和抗氧化應(yīng)激相關(guān)的基因表達(dá)〔11〕。正常生理條件下,細(xì)胞內(nèi)不斷合成的HIF-1α可通過泛素-蛋白酶途徑降解;但是當(dāng)細(xì)胞受到低氧刺激時,HIF-1α的降解受到抑制,在胞內(nèi)大量聚集,導(dǎo)致HIF-1α易位到細(xì)胞核中并通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)從而維持細(xì)胞的能量代謝。研究發(fā)現(xiàn),在AMI和心肌細(xì)胞缺氧后,HIF-1α表達(dá)呈上升趨勢〔12〕;HIF-1α的激活還刺激自噬,這是一種溶酶體介導(dǎo)的降解途徑,可通過去除危險成分(尤其是不健康的線粒體和過氧化物酶體)來維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)〔13〕。在缺氧條件下,心肌細(xì)胞可誘導(dǎo)自噬,HIF-1α過表達(dá)可增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)的自噬,改善心肌細(xì)胞的凋亡,保護(hù)心肌免受I/R損傷〔14～16〕。H/R刺激抑制心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力,培養(yǎng)液中LDH、cTnI和CK-MB的水平可反映H/R引起的心肌細(xì)胞損傷程度〔17,18〕。Ding等〔19〕研究顯示,使用HIF-1α-siRNA可減少低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬。這些數(shù)據(jù)表明,HIF-1α誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞H/R損傷過程中自噬通量的上調(diào)。

研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α在缺氧條件下可激活YTHDF1轉(zhuǎn)錄,而YTHDF1是RNA m6A甲基化的閱讀器,也是HIF-1α調(diào)控的下游靶基因,其表達(dá)水平與缺氧誘導(dǎo)的自噬顯著相關(guān)〔8〕。Beclin-1是自噬的直接執(zhí)行者,參與自噬泡的形成,其表達(dá)量越高說明細(xì)胞的自噬活性越強(qiáng);LC3位于自噬泡的膜表面,其含量與自噬泡形成的數(shù)量呈正比,并通過將位于胞質(zhì)中的LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為結(jié)合自噬體的LC3Ⅱ,在自噬體形成中起關(guān)鍵作用〔20〕。因此,Beclin-1和LC3的表達(dá)量可以用來衡量細(xì)胞自噬的程度。自噬相關(guān)基因ATG2A和ATG14是YTHDF1的下游目標(biāo),也是細(xì)胞中自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白,在缺氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌中,缺氧以HIF-1α依賴的方式上調(diào)了YTHDF1的表達(dá),而且YTHDF1可在CDS上直接結(jié)合并識別ATG2A和ATG14的m6A甲基化,從而通過募集起始因子和促進(jìn)核糖體負(fù)載來促進(jìn)ATG2A和ATG14的翻譯與缺氧誘導(dǎo)的自噬;敲除YTHDF1會降低正常氧和缺氧條件下肝癌細(xì)胞中LC3的表達(dá)〔8〕。Han等〔9〕研究發(fā)現(xiàn),YTHDF1在新生兒心臟中的含量在出生后有所減少,ALKBH5過表達(dá)上調(diào)了YTHDF1 mRNA和蛋白表達(dá),可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖,有助于恢復(fù)受損心臟組織;敲除ALKBH5或使用YTHDF1 siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,可降低YTHDF1表達(dá),抑制心肌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果提示,HIF-1α對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用可能與上調(diào)YTHDF1的表達(dá)有關(guān)。