王柳青 魯建華 肖騁 陳夢(mèng)宇 謝丁玲

(咸寧市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北 咸寧 437000)

阿爾茨海默病(AD)是一種發(fā)生于老年人群的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,患者腦組織結(jié)構(gòu)和功能隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生衰老和退化,可嚴(yán)重?fù)p害患者學(xué)習(xí)認(rèn)知能力,極大降低其生活質(zhì)量,給家庭和社會(huì)均帶來(lái)很大負(fù)擔(dān)〔1～4〕。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,補(bǔ)體系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、溶酶體和炎癥等多種物質(zhì)及病理反應(yīng)涉及其中,研究發(fā)現(xiàn),清除活性氧(ROS),抑制淀粉樣斑塊引發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活,可減輕腦組織神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激損傷,改善AD神經(jīng)功能減退癥狀〔5,6〕。Ras同源基因家族成員(Rho)A/Rho相關(guān)的卷曲螺旋激酶(ROCK)2信號(hào)通路在AD的發(fā)病及病情進(jìn)展中起到重要的調(diào)控作用,阻滯其信號(hào)途徑傳導(dǎo),可對(duì)抗炎癥反應(yīng),增強(qiáng)抗氧化活性,降低氧化應(yīng)激水平,減輕AD大鼠海馬神經(jīng)元損傷,最終改善其認(rèn)知功能障礙癥狀〔7,8〕。芍藥苷是一種水溶性單萜苷,提取自芍藥或牡丹根皮中,具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)靜、解痙、抗氧化等藥理作用,可有效減輕AD動(dòng)物模型β-淀粉樣蛋白(Aβ)過(guò)度沉積,阻止腦組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng),減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,改善AD臨床癥狀〔9,10〕,但芍藥苷是否可通過(guò)調(diào)控RhoA/ROCK2通路影響AD大鼠認(rèn)知功能障礙,目前尚未有詳細(xì)闡述,本文通過(guò)構(gòu)建AD大鼠模型,對(duì)此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SD大鼠,雄性,SPF級(jí),13～14月齡,體質(zhì)量350～365 g,購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,合格證號(hào)501628,許可證號(hào)SCXK(冀)2019-8-116。嚴(yán)格按照動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)范于咸寧市中心醫(yī)院動(dòng)物中心適應(yīng)飼養(yǎng),溫度22.5～25.5 ℃,相對(duì)濕度50%～55%,明暗光照以12 h/12 h循環(huán)交替。

1.2主要試劑及儀器 Aβ1～42多肽(A99280)購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司;芍藥苷(純度>98%,L07M9Q60533)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;Rhosin(HY-12646)購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(E607318-0200)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒(C503021-0500)、丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒(D799762-0100)、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒(D799593-0050)、RIPA裂解液(C500005-0050)購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司;活性氧(ROS)測(cè)定試劑盒(E004-1-1)、白細(xì)胞介素(IL)-6測(cè)試盒(H007)、干擾素(IFN)-γ測(cè)試盒(H025)購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司;兔源GAPDH一抗(ab181602)、兔源RhoA抗體(ab187027)、兔源ROCK2抗體(ab125025)、羊抗兔二抗(ab150077)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

水迷宮視頻分析系統(tǒng)(DB001 Morris)購(gòu)自北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司;酶標(biāo)儀(M200 PRO)購(gòu)自瑞士TECAN公司;超薄切片機(jī)(EM UC7)購(gòu)自德國(guó)Leica公司;光學(xué)顯微鏡(IX71)購(gòu)自日本Olympus公司;大鼠腦立體定位注射儀購(gòu)自日本Narishige公司;垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(1658033)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司等。

1.3制備AD模型大鼠及分組給藥 參照文獻(xiàn)〔11〕中方法建立AD模型:以40 mg/kg的劑量腹腔注射進(jìn)禁食12 h大鼠體內(nèi),待大鼠完全麻醉后,剃去頭頂毛發(fā),消毒后剪開(kāi)暴露顱骨,以骨鉆打開(kāi)顱骨,通過(guò)腦立體定位儀定位海馬CA1區(qū),向其中緩慢注入2 g/L的Aβ1～42多肽溶液2 μl,留針5 min后縫合切口,7 d后通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,當(dāng)其明顯減弱時(shí),表明AD模型制備合格,隨機(jī)分為模型組、芍藥苷(20 mg/kg)組、Rhosin(RhoA抑制劑,40 mg/kg)組、芍藥苷(20 mg/kg)+Rhosin(40 mg/kg)組,另外選取12只SD大鼠,以同樣操作向其海馬CA1區(qū)注射2 μl生理鹽水作為假手術(shù)組。

以生理鹽水溶解芍藥苷與Rhosin配制藥液,得到4 mg/ml的芍藥苷藥液〔12〕、8 mg/ml的Rhosin藥液〔13〕、濃度分別為4、8 mg/ml的芍藥苷和Rhosin混合藥液,藥物干預(yù)組大鼠均以5 ml/kg的劑量腹腔注射,假手術(shù)組和模型組大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水,用藥1次/d,共持續(xù)用藥21 d。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 末次用藥結(jié)束后24 h,參照文獻(xiàn)〔14〕中方法進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),訓(xùn)練大鼠自水池的4個(gè)象限尋找平臺(tái),到第6天時(shí)測(cè)定大鼠逃避潛伏期,即大鼠自入水直至找到水下平臺(tái)所花費(fèi)時(shí)間,超過(guò)90 s仍未找到平臺(tái)的大鼠,逃避潛伏期記為90 s,重復(fù)測(cè)量3次,取平均值。

1.5檢測(cè)大鼠海馬組織病理形態(tài)及收集標(biāo)本 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,使用乙醚氣體麻醉大鼠,采用2 ml注射器吸取頸動(dòng)脈血1.2 ml,轉(zhuǎn)入離心管中4 ℃離心,小心吸出上清,分組標(biāo)記后存在-80 ℃?zhèn)溆?將大鼠斷頭處死,剝離出大腦,每組隨機(jī)選出6個(gè)大腦,分離出海馬組織,轉(zhuǎn)移至凍存管中,標(biāo)記組別后存在液氮中備用;各組剩余的6個(gè)大腦,做清洗、固定、脫水、包埋處理后,采用切片機(jī)切為連續(xù)冠狀切片,選出含有清晰海馬結(jié)構(gòu)的薄片,進(jìn)行脫蠟、水化處理,使用試劑盒按照其說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)步驟進(jìn)行HE染色,以蒸餾水漂洗后,轉(zhuǎn)移至載玻片上封片,使用光學(xué)顯微鏡觀察海馬組織病理形態(tài),并任意選出5個(gè)視野拍照。

1.6檢測(cè)大鼠海馬組織SOD、ROS、MDA水平和血清IL-6、IFN-γ含量1.5中的血清,提前取出以冰水浴解凍,采用試劑盒按照其各自說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)步驟測(cè)定各組IL-6、IFN-γ含量。1.5中的海馬組織取出,加入RIPA裂解液,通過(guò)勻漿、離心提出總蛋白,以BCA法測(cè)出其濃度后,每組各取120 μl,采用試劑盒按照其各自說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)步驟測(cè)定其中SOD、ROS、MDA水平。

1.7Western印跡檢測(cè)各組大鼠海馬組織RhoA/ROCK2通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取出1.6中剩余的蛋白樣品液,均煮沸(100 ℃)5 min變性,通過(guò)電泳(110 V,90 min)將20 mg各組蛋白分離開(kāi),并通過(guò)濕轉(zhuǎn)(400 mA,60 min)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,然后以5%脫脂奶粉封閉其非特異位點(diǎn)(37.5 ℃,90 min),將RhoA、ROCK2、GAPDH 3種目的蛋白條帶裁下,以對(duì)應(yīng)一抗溶液孵育(4 ℃,12 min),TBST洗膜3次(5 min/次),以羊抗兔二抗溶液孵育(37.5 ℃,90 min)后,以同樣操作再次洗膜,將蛋白條帶顯色后拍照,并采用Quantity One軟件對(duì)其灰度進(jìn)行定量后統(tǒng)計(jì),最終得出各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組認(rèn)知功能 與假手術(shù)組相比,模型組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05);與模型組相比,藥物干預(yù)組逃避潛伏期均顯著縮短(P<0.05);與芍藥苷組、Rhosin組相比,芍藥苷+Rhosin組逃避潛伏期均顯著縮短(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組逃避潛伏期、IL-6、IFN-γ、MDA含量及SOD、ROS活性比較

2.2各組海馬組織病理形態(tài)檢測(cè)結(jié)果 假手術(shù)組海馬組織結(jié)構(gòu)完好,神經(jīng)元形態(tài)及排列正常;模型組神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)萎縮,變性死亡,排列紊亂疏松,數(shù)目明顯減少,海馬組織呈現(xiàn)明顯損傷;與模型組相比,藥物干預(yù)組海馬組織上述病理?yè)p傷均減輕;與芍藥苷組、Rhosin組相比,芍藥苷+Rhosin組海馬組織上述病理?yè)p傷均進(jìn)一步減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組海馬組織神經(jīng)元(HE染色,×400)

2.3各組海馬組織SOD和ROS、MDA含量 與假手術(shù)組相比,模型組海馬組織SOD活性顯著降低(P<0.05),ROS、MDA含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,藥物干預(yù)組海馬組織SOD含量明顯升高,ROS、MDA含量均明顯降低(P<0.05);與芍藥苷組、Rhosin組相比,芍藥苷+Rhosin組海馬組織SOD含量明顯升高,ROS、MDA含量均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4各組血清致炎因子IL-6和IFN-γ含量 與假手術(shù)組相比,模型組血清致炎因子IL-6和IFN-γ含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,藥物干預(yù)組血清致炎因子IL-6和IFN-γ含量均顯著降低(P<0.05);與芍藥苷組、Rhosin組相比,芍藥苷+Rhosin組血清致炎因子IL-6和IFN-γ含量均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.5各組海馬組織RhoA/ROCK2通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與假手術(shù)組相比,模型組海馬組織RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組相比,藥物干預(yù)組海馬組織RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05);與芍藥苷組、Rhosin組相比,芍藥苷+Rhosin組海馬組織RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

1～5:假手術(shù)組、模型組、芍藥苷組、Rhosin組、芍藥苷+Rhosin組圖2 各組海馬組織RhoA/ROCK2通路相關(guān)蛋白的Western印跡檢測(cè)

表2 各組海馬組織RhoA/ROCK2通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討 論

Aβ引發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是AD發(fā)生的經(jīng)典假說(shuō),證據(jù)表明,Aβ多肽可誘導(dǎo)腦組織發(fā)生明顯的炎癥和氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致Aβ大量沉積腦內(nèi)形成斑塊,誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡丟失,損害AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能〔15,16〕。本文結(jié)果表明,Aβ1～42多肽可誘導(dǎo)ROS與炎性細(xì)胞因子大量合成釋放,降低內(nèi)源性抗氧化活性,引發(fā)強(qiáng)烈過(guò)氧化及炎癥反應(yīng),導(dǎo)致海馬神經(jīng)元死亡缺失,造成大鼠認(rèn)知功能障礙,揭示AD模型構(gòu)建成功。

目前臨床中常用的AD治療藥物,無(wú)法從根本上阻止疾病進(jìn)展,還存在一定副作用,而中藥因其安全性在AD的防治中得到越來(lái)越多的重視,芍藥苷是具有明顯消炎抑菌、減輕過(guò)氧化與應(yīng)激反應(yīng)功效的單萜苷類(lèi)化合物,可有效抑制氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng),減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性腦損傷,并保護(hù)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能〔17,18〕,還可有效抑制Aβ斑塊形成,修復(fù)神經(jīng)遞質(zhì)正常平衡,明顯改善AD記憶能力減退癥狀〔8〕,本文結(jié)果表明,芍藥苷可提升AD大鼠抗氧化活性,減輕其腦組織炎癥及過(guò)氧化損傷,改善認(rèn)知功能,進(jìn)一步證實(shí)了芍藥苷對(duì)AD的療效。

RhoA/ROCK2是觸發(fā)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要信號(hào),隨著老化進(jìn)展,其信號(hào)蛋白在腦組織中表達(dá)顯著增加,下調(diào)RhoA/ROCK2通路蛋白表達(dá),可對(duì)抗Aβ多肽誘導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),降低氧化應(yīng)激水平,延緩神經(jīng)突觸丟失,促使神經(jīng)元細(xì)胞存活,提升衰老造成的學(xué)習(xí)記憶功能減退,改善其認(rèn)知能力〔19,20〕,由此可知,RhoA/ROCK2信號(hào)是防治AD的重要作用靶點(diǎn),本文結(jié)果表明,Rhosin能增強(qiáng)芍藥苷對(duì)AD的治療效果,揭示芍藥苷可能通過(guò)抑制RhoA/ROCK2通路激活改善AD大鼠認(rèn)知功能障礙。

綜上所述,芍藥苷可下調(diào)RhoA及ROCK2蛋白表達(dá),增強(qiáng)AD大鼠抗氧化活性,抑制其腦組織炎癥產(chǎn)生,降低氧化應(yīng)激水平,減輕海馬神經(jīng)元凋亡缺失,修復(fù)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,改善其認(rèn)知功能,為芍藥苷在AD臨床治療上的推廣應(yīng)用提供了新的有力證據(jù),并探討了其藥理機(jī)制,后續(xù)會(huì)通過(guò)激活RhoA/ROCK2通路做更深入的研究。