程吟 曹振峰 黃怡 盧洪梅 郭文濤

(1廣東醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 東莞 523808;2海南體育職業(yè)技術(shù)學(xué)院;3廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

急性心肌梗死和心力衰竭是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一。心肌缺血時(shí),心肌組織因心肌缺氧和營養(yǎng)供應(yīng)不足而死亡,再灌注治療如通過溶栓或經(jīng)皮冠狀動脈介入等干預(yù)是心肌梗死的治療選擇,可使心肌組織損傷最小化〔1〕。然而,再灌注本身也可加劇心肌損害,使心臟更容易發(fā)生室性心律失常、心肌功能障礙和猝死,是急性心肌梗死臨床治療后的嚴(yán)重并發(fā)癥之一〔2〕,給家庭和社會帶來了日益沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,如何保證缺血心肌組織血供的恢復(fù),制定預(yù)防心肌缺血再灌注(I/R)損傷的有效策略至關(guān)重要。

心臟I/R損傷是通過一系列相互關(guān)聯(lián)的途徑介導(dǎo)的,包括活性氧的過度產(chǎn)生、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及線粒體代謝紊亂〔3〕。大量研究表明,線粒體動力學(xué)失衡是心肌I/R損傷過程中導(dǎo)致線粒體功能障礙和心肌細(xì)胞凋亡的重要因素〔4〕。在生理情況下,線粒體通過裂變和融合不斷分裂和延長,從而以動態(tài)的方式保持其形態(tài)。線粒體裂變產(chǎn)生小的線粒體碎片,而融合形成伸長的相互連接網(wǎng)絡(luò),因此線粒體融合對于維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要〔5〕。研究認(rèn)為,線粒體融合對線粒體能量的產(chǎn)生及功能具有一定的保護(hù)作用,而I/R時(shí)線粒體融合減少,在心肌I/R損傷中起關(guān)鍵作用〔6〕。視神經(jīng)萎縮(OPA)1是一種嵌在線粒體內(nèi)膜中的蛋白,主要控制線粒體融合。Wang等〔7〕研究發(fā)現(xiàn),心肌I/R損傷中OPA1表達(dá)降低,可加重線粒體碎片化,導(dǎo)致線粒體功能障礙和線粒體凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致心肌I/R損傷發(fā)生;而過表達(dá)的OPA1已被證明可以逆轉(zhuǎn)線粒體功能,改善I/R大鼠心臟功能〔8〕。因此調(diào)控心肌細(xì)胞線粒體融合,尤其是OPA1可能是治療心肌I/R損傷潛在的治療靶點(diǎn)。

研究認(rèn)為,運(yùn)動是一種眾所周知的非藥物干預(yù)手段,能夠改善健康和患病個(gè)體的心血管健康,并被證明可以持續(xù)改善心肌梗死患者的生活質(zhì)量,減少住院和心源性死亡〔9〕。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí),運(yùn)動的長期適應(yīng)性變化與急性心肌梗死發(fā)生率降低有關(guān),并通過減輕心肌細(xì)胞死亡,對I/R心臟產(chǎn)生有益的保護(hù)作用。Campos等〔10〕研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動可以通過減少心力衰竭時(shí)線粒體碎片的積累重建線粒體分裂-融合平衡,改善心力衰竭大鼠心臟功能。而Li等〔11〕研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動預(yù)干預(yù)可通過增加線粒體融合下調(diào)海馬區(qū)β淀粉樣蛋白(Aβ)水平,緩解癡呆小鼠的認(rèn)知功能下降?；谏鲜鑫墨I(xiàn)可知,運(yùn)動訓(xùn)練對線粒體動力學(xué)具有有益的影響,可以推測運(yùn)動預(yù)干預(yù)可能通過增強(qiáng)線粒體融合減輕I/R大鼠心肌損傷。本研究通過構(gòu)建大鼠心肌I/R模型,觀察8 w有氧運(yùn)動預(yù)干預(yù)對I/R大鼠心肌梗死面積、心律失常的發(fā)生及融合蛋白OPA1表達(dá)的影響,探討運(yùn)動預(yù)處理對I/R大鼠心肌的保護(hù)效應(yīng)及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 雄性SD大鼠共39只,體質(zhì)量220～250 g,由廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供〔使用許可證SYXK(粵)2015-0104〕。實(shí)驗(yàn)開始前,將所有大鼠置于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中飼養(yǎng)(室溫 22 ℃±2 ℃,濕度 50%±5%,晝夜循環(huán)12 h),自由進(jìn)食和飲水。適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1 w后,將大鼠隨機(jī)分為:假手術(shù)(sham)組、缺血再灌注(I/R)組、缺血再灌注運(yùn)動(I/R+E)組,每組13只。心肌I/R期間I/R組死亡2只,I/R+E組死亡1只。

1.2跑臺運(yùn)動方案 參考Bedford等〔12〕中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動訓(xùn)練方案,共8 w(5 d/w)。跑臺運(yùn)動速度為20 m/min 開始,一開始每天運(yùn)動15 min,每3 d運(yùn)動時(shí)間增加5 min,直至每天運(yùn)動時(shí)間為60 min時(shí),運(yùn)動時(shí)間不再變化,坡度為 由0 ° 調(diào)為5 °。

1.3心肌I/R模型建立 跑臺運(yùn)動結(jié)束后,I/R組及I/R+E組建立心肌I/R模型。術(shù)前大鼠禁食12 h,腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠,仰臥位固定大鼠,連接小動物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣(潮氣量設(shè)置為5～6 ml,通氣速率60 ～ 70次/min,實(shí)驗(yàn)采用加熱平臺將大鼠體溫維持在37 ℃)。術(shù)中電極夾連接大鼠四肢,使用Ⅱ?qū)?lián)心電圖記錄大鼠心臟活動(圖1),待心電圖基線穩(wěn)定后,常規(guī)手術(shù)備皮在第三和第四根肋骨之間開胸暴露心臟,確定左前降支(LAD),并在其遠(yuǎn)端約2 mm用6-0 絲線結(jié)扎,以心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高和缺血區(qū)心肌組織顏色發(fā)紺證實(shí)心肌缺血。缺血30 min后松開LAD,缺血心肌持續(xù)再灌注90 min,以ST段逐漸降低,左室前壁缺血組織顏色明顯恢復(fù),心電圖T波反轉(zhuǎn),證實(shí)再灌注成功。Sham組進(jìn)行相同手術(shù),只穿線不進(jìn)行心臟結(jié)扎。

圖1 大鼠心臟LAD結(jié)扎前、LAD結(jié)扎即刻及再灌注即刻心電圖

1.4大鼠I/R期間心律失常監(jiān)測 于缺血及再灌注期間采用標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)連續(xù)檢測各組心電圖變化,根據(jù)Lambeth原則〔1〕觀察室性心動過速(VT)、室性顫動(VF)和室性早搏(PVB)發(fā)生率,并記錄缺血及再灌注期間VT、VF及PVB第1次出現(xiàn)的時(shí)間和缺血及再灌注期間心律失?？偝掷m(xù)時(shí)間。

1.5伊文氏藍(lán)2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)雙著色法測定心肌梗死面積 心肌再灌注90 min結(jié)束時(shí),再次結(jié)扎冠狀動脈,經(jīng)主動脈灌注2%伊文藍(lán)3 ml,以確定心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)。迅速取下心臟,冰鹽水沖洗濾紙?jiān)嚫珊笾糜?20 ℃的冰箱冷凍15 min后切成2 mm冠狀切片,隨后切片被置于1% TTC中染色15 min,孵育20 min(37 ℃)。TTC將心肌危險(xiǎn)區(qū)染成深紅色,灰白色區(qū)域?yàn)槿毖Ｋ绤^(qū),非缺血區(qū)心肌呈深藍(lán)色,最后將切片置于4%多聚甲醛溶液中,室溫下固定過夜。拍攝心肌切片圖像,使用 Image-ProV6.0 分析計(jì)算出梗死區(qū)面積(IFA)與危險(xiǎn)區(qū)面積(RA)的比值,即為心肌梗死面積百分比(IFA/RA)%。

1.6心肌組織OPA1免疫組織化學(xué)染色 再灌注90 min后取左心室前壁心肌組織,4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,連續(xù)切片5張(5 μm),將切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后入3% H2O2室溫孵育30 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后(3次×5 min)加山羊血清封閉液,室溫下放置10 min后滴加OPA1兔抗鼠多克隆抗體(1∶300),室溫孵育1 h后4 ℃過夜,PBS漂洗(3次×5 min)后滴加山羊抗兔IgG 二抗(1∶300),室溫孵育1 h、PBS漂洗3次×5 min后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色1～3 min,自來水充分沖洗后蘇木素復(fù)染2～3 min,梯度酒精脫水、二甲苯透明、樹膠封片。光鏡下觀察并拍照,每張切片取5個(gè)視野(400倍)采集圖像,利用形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對心肌組織OPA1表達(dá)進(jìn)行分析,用心肌組織5個(gè)不同視野內(nèi)OPA1細(xì)胞個(gè)數(shù)的平均值表示心肌組織OPA1表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1跑臺運(yùn)動預(yù)干預(yù)對I/R大鼠缺血期及再灌注期心律失常的影響 與sham組比較,I/R組心肌缺血及復(fù)灌過程中I/R期間VT、VF及PVB發(fā)生率均顯著增加,第1次出現(xiàn)心律失常的時(shí)間及心律失常持續(xù)時(shí)間均明顯延長(均P<0.05)。與I/R組比較,8 w跑臺運(yùn)動預(yù)干預(yù)可顯著降低大鼠心肌缺血及復(fù)灌過程中VT、VF及PVB發(fā)生率(P<0.05,P<0.01),且能明顯延長I/R大鼠心肌缺血及復(fù)灌期間第1次出現(xiàn)心律失常的時(shí)間,明顯縮短心律失常持續(xù)時(shí)間(P<0.01)。見表1。

表1 各組缺血期及再灌注期心律失常比較

2.2跑臺運(yùn)動預(yù)干預(yù)對I/R大鼠心肌梗死面積的影響 與sham組〔(0.96±0.70)%〕比較,I/R組及I/R+E組心肌IFA/RA〔(44.36±9.43)%、(36.02±4.74)%〕均明顯增加(P<0.05)。經(jīng)過8 w跑臺運(yùn)動預(yù)干預(yù),與I/R組比較,I/R+E組心肌IFA/RA明顯下降(P<0.01)。見圖2。

圖2 各組心肌(TTC染色)

2.3跑臺運(yùn)動預(yù)干預(yù)對IR大鼠心肌組織OPA1表達(dá)的影響 與sham組(11.08±1.98)比較,I/R組及IR+E組心肌組織OPA1表達(dá)(6.27±1.56、8.08±1.78)均顯著降低(P<0.005);與I/R組比較,I/R+E組心肌組織OPA1表達(dá)顯著增多(P<0.05)。見圖3。

3 討 論

急性心肌梗死后,早期成功的心肌再灌注,如采用溶栓治療或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療是減小心肌梗死面積、提高臨床療效的最有效策略,但再灌注本身可導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡,使心臟更容易發(fā)生室性心律失常及猝死〔13〕。研究表明,I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷可觸發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)及I/R導(dǎo)致心臟電生理變化均可增加心肌對心律失常的易感性〔14〕。Lee等〔15〕研究發(fā)現(xiàn),大鼠室性心律失常發(fā)生在LAD閉塞后及再灌注期內(nèi),表現(xiàn)為PVB、VT和VF,并且大鼠心律失常評分及死亡率均顯著增高。并且Jiang等〔16〕研究發(fā)現(xiàn),I/R可使大鼠心梗面積增加、心律失常發(fā)生率和死亡率均顯著增加,心肌組織及心臟功能嚴(yán)重受損,本研究得到相同結(jié)果。

近年來,缺血預(yù)處理已經(jīng)成為預(yù)防心肌I/R損傷、改善心律失常及心臟功能的主要研究途徑〔17〕。作為安全有效、臨床可操作性強(qiáng)的處理措施,運(yùn)動預(yù)處理已被報(bào)道可以有效降低心血管疾病的發(fā)病率和死亡率〔18〕。Meta分析顯示,經(jīng)常進(jìn)行體育鍛煉的受試者中心肌梗死的發(fā)生率明顯較低,而經(jīng)常運(yùn)動的心臟病患者的生存率要高于不運(yùn)動的心臟病患者。并且動物實(shí)驗(yàn)證實(shí),運(yùn)動預(yù)干預(yù)可通過介導(dǎo)抗心肌炎癥及凋亡等通路抵抗心肌I/R損傷,包括減少心律失常(VT、VF及PVB)及心肌梗死等現(xiàn)象的發(fā)生〔19〕。此外有研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動預(yù)干預(yù)(3 d,跑臺速度 18 m/min)可通過抗炎通路預(yù)防心肌I/R損傷,減輕心律失常的發(fā)生及心肌壞死,發(fā)揮心臟保護(hù)作用〔20〕。本研究結(jié)果與上述學(xué)者研究結(jié)果一致。然而Veiga等〔21〕研究發(fā)現(xiàn),雌性大鼠心肌梗死前進(jìn)行8 w游泳運(yùn)動預(yù)干預(yù)(1 h/d,5 d/w)并不能減少LAD永久性閉塞大鼠梗死面積,也不能對心肌缺血大鼠提供心臟保護(hù)作用,可能是因?yàn)橛谰眯怨跔顒用}閉塞可能比短暫缺血再灌注對心肌組織造成更大的損害有關(guān)。據(jù)報(bào)道,I/R誘發(fā)心律失常的發(fā)生率和嚴(yán)重程度取決于心肌梗死的面積,本研究8 w跑臺運(yùn)動預(yù)干預(yù)降低I/R大鼠心律失常發(fā)生可能與此運(yùn)動減小I/R大鼠的心肌梗死面積有關(guān),具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

線粒體是不斷發(fā)生融合和分裂的動態(tài)細(xì)胞器,線粒體裂變和融合的失衡導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)異常和功能障礙,在I/R損傷的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用〔22〕。研究表明,心肌I/R時(shí)抑制線粒體裂變、促進(jìn)線粒體融合已被證實(shí)可以改善I/R中異常的線粒體形態(tài),增加三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生,減少線粒體凋亡,逆轉(zhuǎn)線粒體功能,改善心肌I/R損傷的心臟性能〔23〕。研究表明,在調(diào)節(jié)線粒體融合中起關(guān)鍵作用的OPA1對各種心臟疾病特別是心肌I/R損傷具有保護(hù)作用〔24〕。Varanita等〔25〕研究發(fā)現(xiàn),線粒體OPA1表達(dá)下降與線粒體功能障礙及IR損傷的敏感性增加有關(guān)。并且Le Page等〔26〕研究發(fā)現(xiàn),與正常小鼠比較,OPA1缺失的小鼠梗死面積明顯增大,心律失常的發(fā)生率更高。而心臟保護(hù)劑褪黑素最近被證明可通過增強(qiáng)與OPA1相關(guān)的線粒體融合對I/R大鼠提供心臟保護(hù),從而減少I/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡及心肌梗死面積。

本研究結(jié)果說明,I/R后線粒體融合減少,從而導(dǎo)致了I/R心肌損傷的發(fā)生。近年來,與OPA1相關(guān)的線粒體融合已成為治療急性心肌I/R損傷潛在發(fā)展的新靶點(diǎn)。Ghahremani等〔27〕研究發(fā)現(xiàn),8 w有氧運(yùn)動可通過提高心肌梗死大鼠心肌融合蛋白OPA1的表達(dá),減少大鼠心肌梗死面積、改善心肌病理變化,表明有氧運(yùn)動是一種非藥理學(xué)的有效的干預(yù)心肌梗死的治療方式。Zhao等〔28〕研究表明,8 w游泳運(yùn)動預(yù)干預(yù)(15 min/d,5次/w)可通過調(diào)節(jié)線粒體裂變及融合信號改善線粒體形態(tài),抑制心肌梗死小鼠心肌纖維化和細(xì)胞凋亡,從而恢復(fù)心肌梗死后線粒體形態(tài)并改善心臟功能。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),2 w跑臺運(yùn)動預(yù)處理(20 m/min,30 min/d)可以上調(diào)腦缺血再灌注大鼠線粒體OPA1表達(dá)、但對分裂蛋白的表達(dá)無顯著影響,說明此運(yùn)動訓(xùn)練可通過增加線粒體融合對腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用〔29〕。本研究結(jié)果與上述學(xué)者研究結(jié)果一致。而馬靜芬〔30〕研究發(fā)現(xiàn),一次急性運(yùn)動(分別為45、90、120 min)即刻均可使線粒體融合蛋白OPA1表達(dá)減少,心肌線粒體融合趨勢下降、分裂趨勢增強(qiáng),從而增加心肌的炎癥反應(yīng)。因此,針對不同研究得到不同結(jié)果可能與運(yùn)動干預(yù)方式不同有關(guān)。心臟線粒體去極化已被證明有助于心律失常的發(fā)生,并且線粒體融合蛋白增加可減少心肌I/R損傷引起的心臟線粒體去極化,產(chǎn)生抗心律失常作用。Dai 等〔31〕研究認(rèn)為,I/R導(dǎo)致的心肌梗死面積增加與線粒體融合不足有關(guān)。因此,本研究8 w跑臺運(yùn)動預(yù)干預(yù)可能通過增加線粒體融合發(fā)揮心肌保護(hù)作用,從而減輕心肌I/R損傷,最終導(dǎo)致IR大鼠心律失常減少,梗死面積減小。但是,線粒體融合蛋白OPA1通過何種途徑發(fā)揮心肌保護(hù)作用,需要進(jìn)一步研究證實(shí)。