李肅 馬海軍 拜承萍

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院 1急診科,青海 西寧 810000;2急救中心;3神經(jīng)內(nèi)科)

缺氧缺血性腦損傷是造成神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要原因,研究顯示0.1%～0.2%新生兒會發(fā)生缺氧缺血性腦損傷,部分患兒或出現(xiàn)腦癱、認知障礙等后遺癥,氧化應(yīng)激、神經(jīng)細胞凋亡等均可引起缺氧缺血性腦損傷〔1,2〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度超過200 nt的內(nèi)源性非編碼RNA分子,其可參與神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的多種生理過程,并可能調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞增殖及凋亡〔3,4〕。抑制LINC00707表達可減輕細胞損傷〔5〕。但LINC00707與缺氧缺血性腦損傷相關(guān)研究報道相對較少。Starbase預(yù)測LINC00707和miR-876-5p存在互補序列,研究表明銀屑病角質(zhì)形成細胞中miR-876-5p的表達下調(diào),上調(diào)其表達可抑制細胞增殖及侵襲〔6〕。但miR-876-5p在缺氧缺血性腦損傷中的作用機制尚未可知。因此,本研究建立缺氧缺血腦損傷模型,探討LINC00707是否可通過靶向調(diào)節(jié)miR-876-5p表達而影響海馬神經(jīng)元凋亡及氧化應(yīng)激。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 大鼠海馬神經(jīng)元細胞HT-22購自美國ATCC;RNA提取試劑、Lipofectamine2000、LINC00707過表達載體(pcDNA-LINC00707)及其對照空載體(pcDNA)購自美國Invitrogen;反轉(zhuǎn)錄試劑與SYBR Green熒光定量PCR試劑購自北京天根生化;si-LINC00707、si-NC、miR-876-5p mimics、miR-NC、anti-miR-876-5p、anti-miR-NC購自廣州銳博生物;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;含有LINC00707和miR-876-5p互補序列的野生型載體WT-LINC00707與含有LINC00707和miR-876-5p突變序列的突變型載體MUT-LINC00707購自美國Prpmega;熒光素酶活性檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶;兔抗鼠活化的含半胱酸的天冬氨酸水解酶(Cleaved-caspase)-3抗體及其對應(yīng)二抗購自美國Santa Cruz。

1.2實驗處理與分組 建立缺氧缺血腦損傷細胞模型〔7〕:取對數(shù)生長期HT-22細胞,加入50 μmol/L谷氨酸與D-Hanks液浸泡30 min,培養(yǎng)基洗滌2次,加入含有15%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,記為Hypoxia ischemia組。同時將正常培養(yǎng)的細胞記為NC組。細胞轉(zhuǎn)染:用不含血清的細胞培養(yǎng)液與si-NC、si-LINC00707、miR-NC、miR-876-5p mimics、anti-miR-NC+si-LINC00707、anti-miR-876-5p+si-LI-NC00707混合后室溫孵育5 min(A液),用不含血清的細胞培養(yǎng)液與Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑充分混合(B液),A液與B液充分混勻后室溫孵育20 min,并將其加入HT-22細胞,6 h棄上清液后更換正常培養(yǎng)液,并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。細胞轉(zhuǎn)染成功后進行缺氧缺血處理,分別記為si-NC+Hypoxia ischemia組、si-LINC00707+Hypoxia ischemia組、miR-NC+Hypoxia ischemia組、miR-876-5p+Hypoxia ischemia組、anti-miR-NC+si-LINC00707+Hypoxia ischemia組、anti-miR-876-5p+si-LINC00707+Hypoxia ischemia組。

1.3qRT-PCR檢測LINC00707、miR-876-5p的表達水平 RNA提取試劑分別提取各組HT-22細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA 2 μl進行qRT-PCR擴增,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共36次循環(huán)。應(yīng)用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測LINC00707、miR-876-5p相對表達量。

1.4利用試劑盒檢測MDA的水平與SOD、CAT的活性 收集各組HT-22細胞后采用反復(fù)凍融法裂解液細胞,按照試劑盒說明書檢測MDA水平與SOD、CAT活性。

1.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 取各組HT-22細胞加入預(yù)冷PBS洗滌,1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min后棄上清,加入500 μl結(jié)合緩沖液,按照凋亡檢測試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.6雙熒光素酶報告實驗檢測LINC00707和miR-876-5p的靶向關(guān)系 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-NC、miR-876-5p mimics分別與WT-LINC00707或MUT-LINC00 707共轉(zhuǎn)染至HT-22細胞,轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞,檢測細胞相對熒光素酶活性。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA、pcDNA-LINC00707、si-NC、si-LINC00707分別轉(zhuǎn)染至HT-22細胞,轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞,采用qRT-PCR實驗檢測細胞中miR-876-5p的表達量。

1.7Western印跡檢測Cleaved-caspase-3蛋白表達量 取各組HT-22細胞加入適量RIPA裂解液提取細胞總蛋白,取50 μg蛋白樣品上樣并經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白,分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,分別加入Cleaved-caspase-3(1∶1 000)與內(nèi)參β-actin抗體(1∶2 000)稀釋液4 ℃孵育過夜,孵育二抗稀釋液(1∶3 000),室溫孵育1 h,應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1缺氧缺血處理的海馬神經(jīng)元細胞模型中,LINC00707和miR-876-5p的表達情況 與NC組比較,Hypoxia ischemia組LINC00707表達明顯升高,miR-876-5p表達明顯降低(均P<0.001),見表1。

表1 兩組LINC00707和miR-876-5p的表達

2.2LINC00707低表達抑制缺氧缺血損傷后海馬神經(jīng)元凋亡和氧化應(yīng)激 與NC組比較,Hypoxia ischemia組MDA水平明顯升高,SOD、CAT活性明顯降低,細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高(均P<0.05);與si-NC+Hypoxia ischemia組比較,si-LINC00707+Hypoxia ischemia組MDA水平明顯降低,SOD、CAT活性明顯升高,細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯降低(P<0.05),見圖1、圖2、表2。

1～4:NC組、Hypoxia ischemia組、si-NC+Hypoxia ischemia組、si-LINC00707+Hypoxia ischemia組圖1 Western印跡檢測Cleaved-caspase-3蛋白表達

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡

表2 LINC00707低表達抑制缺氧缺血損傷后海馬神經(jīng)元凋亡和氧化應(yīng)激

2.3miR-876-5p抑制缺氧缺血損傷后海馬神經(jīng)元凋亡和氧化應(yīng)激 與miR-NC+Hypoxia ischemia組比較,miR-876-5p+Hypoxia ischemia組MDA水平明顯降低,SOD、CAT活性明顯升高,細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯降低(均P<0.001),見表3、圖3、圖4。

圖3 miR-876-5p抑制缺氧缺血損傷后海馬神經(jīng)元凋亡

1,2:miR-NC+Hypoxia ischemia組、miR-876-5p+Hypoxia ischemia組圖4 miR-876-5p抑制缺氧缺血損傷后Cleaved-caspase-3蛋白表達

表3 miR-876-5p抑制缺氧缺血損傷后海馬神經(jīng)元凋亡和氧化應(yīng)激

2.4LINC00707靶向結(jié)合miR-876-5p,調(diào)控miR-876-5p的表達 Starbase預(yù)測LINC00707和miR-876-5p存在結(jié)合位點,見圖5。miR-876-5p過表達可降低野生型載體WT-LINC00707的熒光素酶活性(P<0.001),見表4。pcDNA組、pcDNA-LINC00707組、si-NC組、si-LINC00707組miR-876-5P表達水平依次為1.00±0.08、0.45±0.04、0.99±0.09、1.91±0.16,4組間miR-876-5P表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);pcDNA組、pcDNA-LINC00707 組miR-876-5P表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);si-NC組、si-LINC00707組miR-876-5P表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。LINC00707可負向調(diào)控miR-876-5p的表達。

圖5 Starbase對LINC00707和 miR-876-5p結(jié)合進行預(yù)測示意

表4 雙熒光素酶活性檢測

2.5anti-miR-876-5p可以逆轉(zhuǎn)si-LINC00707對缺氧缺血損傷后海馬神經(jīng)元凋亡和氧化應(yīng)激的影響 與anti-miR-NC+si-LINC00707+Hypoxia ischemia組比較,anti-miR-876-5p+si-LINC00707+Hypoxia ischemia組MDA水平明顯升高,SOD、CAT活性明顯降低,細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯升高(均P<0.001),見表5、圖6、7。

1～2:anti-miR-NC+si-LINC00707+Hypoxia ischemia組、anti-miR-876-5p+si-LINC00707+Hypoxia ischemia組;圖7同圖6 anti-miR-876-5p可以逆轉(zhuǎn)si-LINC00707對缺氧缺血損傷后海馬神經(jīng)元凋亡

圖7 miR-876-5p可以逆轉(zhuǎn)LINC00707對缺氧缺血損傷后Cleaved-caspase-3蛋白表達水平的影響

表5 anti-miR-876-5p可以逆轉(zhuǎn)si-LINC00707對缺氧缺血損傷后海馬神經(jīng)元凋亡和氧化應(yīng)激的影響

3 討 論

敲低LINC00707表達可減輕脂多糖誘導(dǎo)的人正常胚肺成纖維細胞損傷〔8〕。LINC00707具有促進人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨作用〔9〕。另有研究表明,LINC00707在肝癌中呈高表達,并可促進肝癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移〔10〕。但LINC00707在缺氧缺血性腦損傷中的表達尚未可知。本研究結(jié)果提示,LINC00707在缺氧缺血性腦損傷中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。腦缺血后氧自由基生成量增加,而SOD、CAT等抗氧化酶過度消耗導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)加重,氧自由基可氧化不飽和脂肪酸并可破壞細胞膜從而造成核酸等損傷,MDA屬于脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,其含量與氧自由基密切相關(guān)〔11〕。本研究結(jié)果提示,干擾LINC00707表達可增強缺氧缺血腦損傷后海馬神經(jīng)元細胞抗氧化能力從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激還可引起神經(jīng)細胞凋亡,腦缺血發(fā)生后缺血核心區(qū)的主要表現(xiàn)為神經(jīng)元凋亡,線粒體膜通透性改變可激活caspase級聯(lián)反應(yīng)從而激活caspase-3,caspase-3具有執(zhí)行細胞凋亡的能力〔12〕。本研究結(jié)果提示,干擾LINC00707表達可抑制缺氧缺血腦損傷后海馬神經(jīng)元凋亡。

本研究證實,LINC00707與miR-876-5p存在靶向調(diào)控關(guān)系,提示LINC00707可能通過靶向miR-876-5p影響缺氧缺血腦損傷后海馬神經(jīng)元凋亡及氧化應(yīng)激。研究表明miR-876-5p在乳腺癌〔13〕、肝細胞癌〔14〕、骨肉瘤〔15〕中表達下調(diào),上調(diào)其表達可抑制腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲。本研究結(jié)果提示,LINC00707可通過靶向miR-876-5p而促進缺氧缺血腦損傷后海馬神經(jīng)元凋亡及氧化應(yīng)激。

綜上,缺氧缺血腦損傷后海馬神經(jīng)元中LINC00707表達上調(diào),miR-876-5p表達下調(diào),LINC00707靶向結(jié)合miR-876-5p并可負向調(diào)控miR-876-5p的表達,干擾LINC00707表達可通過上調(diào)miR-876-5p表達而抑制缺氧缺血腦損傷后海馬神經(jīng)元凋亡及氧化應(yīng)激,LINC00707可能成為預(yù)防與治療缺氧缺血性腦損傷的新靶點。但仍需進行體內(nèi)動物實驗驗證LINC00707/miR-876-5p在缺氧缺血性腦損傷中的作用機制。