黎珊珊 區(qū)島良 張梅 謝桃梅

(儋州市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,海南 儋州 571700)

糖尿病(DM)是一種以高血糖、胰島素抵抗和相對(duì)胰島素缺乏為特征的代謝性疾病〔1〕。高血糖引起的血管并發(fā)癥,導(dǎo)致DM患者的發(fā)病率和死亡率顯著增高〔2,3〕。DM血管并發(fā)癥主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮損傷和功能障礙,與血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少密切相關(guān)〔4〕。因此,尋找新的藥物,抑制高血糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞受損對(duì)臨床治療DM血管并發(fā)癥,改善DM治療效果具有重要意義。巴戟天是一種茜草科植物中草藥,具有治療腎虛、宮冷不孕和陽(yáng)痿遺精等功效,且已被證實(shí)能夠促進(jìn)血管生成〔5〕。叉頭框蛋白(FOX)P2是叉頭盒蛋白家族成員之一,能夠在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)G補(bǔ)綴FHA域血管生成因子(AGGF)1表達(dá),增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移〔6〕。然而,巴戟天對(duì)高糖誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在探索巴戟天含藥血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖、凋亡及遷移的影響,并初步研究其與FOXP2/AGGF1通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、藥品及試劑 HUVEC(批號(hào)CL-0122)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;巴戟天(批號(hào)14000863870)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)馮了性(藥材)飲片有限公司;內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM,批號(hào)1001)、噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(批號(hào)M8180)、胎牛血清(批號(hào)11011-8611)、0.25%胰蛋白酶消化液(批號(hào)T1350)、Trizol試劑盒(批號(hào)15596-018)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)T2210-200T)、RIPA裂解液(批號(hào)R0010)、基質(zhì)膠(批號(hào)356234)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液(批號(hào)PE0010)均購(gòu)自北京Solarbio公司;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)KGA108)購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;FOXP2、AGGF1及GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司合成;FOXP2兔抗人單克隆抗體(批號(hào)720031)、AGGF1兔抗人多克隆抗體(批號(hào)A303-633A)、GAPDH兔抗人多克隆抗體(批號(hào)PA1-16777)、山羊抗兔lgG(H+L)二抗(批號(hào)A32731)均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2主要儀器 BBD6220型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;2720型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司;Gel DocTMXR+型凝膠成像儀、ELX-8081U型酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;MA100N型倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.3方法

1.3.1含藥血清和不含藥血清的制備 選取5周齡健康清潔級(jí)雄性SD大鼠24只,體質(zhì)量100～140 g,購(gòu)自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2018-0009,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(鄂)2018-0057,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):DM0019101307,大鼠飼養(yǎng)于海南省疾病預(yù)防控制中心,禁食12 h后,隨機(jī)分成4組,即不含藥血清組、0.5 g/kg巴戟天給藥組、1.0 g/kg巴戟天給藥組和2.0 g/kg巴戟天給藥組,每組6只,1 g巴戟天相當(dāng)于生藥3 g,給予灌胃處理,藥物劑量等效于臨床劑量(按照人和動(dòng)物表面積折算等效劑量比率計(jì)算)。給藥方式:2次/d,2 ml/次,連續(xù)灌胃3 d,第4天一次性服用全天劑量,不含藥血清組給予等量生理鹽水灌胃。禁食12 h,采血,末次給藥1 h后,乙醚麻醉,無(wú)菌條件下心臟采血、靜置2 h,離心(3 000 r/min,15 min),分離上清液,同組混合,56 ℃水浴滅活30 min,分裝后得不含藥血清、0.5、1.0和2.0 g/kg巴戟天含藥血清,-20 ℃保存?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)通過(guò)儋州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循3R原則。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 將新購(gòu)置的HUVEC用ECM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清+1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子+1%青霉素/鏈霉素混合液)于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合80%左右,胰酶消化傳代,收集3～5代對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3高糖模型的建立 將1.3.2中HUVEC接種于96孔板(4.5×104個(gè)/孔),隨機(jī)分為對(duì)照組和高糖組,D-葡萄糖終濃度為:對(duì)照組(5.5 mmol/L)、高糖組(10、15、20、30、40 mmol/L),每組6個(gè)復(fù)孔,并設(shè)置調(diào)零孔,培養(yǎng)24 h,采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率:吸去上清液,每孔添加100 μl二甲基亞砜(DMSO),充分震蕩后,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔570 nm下吸光值(OD值),計(jì)算存活率,存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-調(diào)零孔OD值)/(對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值)。取存活率為50%左右的高糖濃度建立HUVEC損傷模型。

1.3.4含藥血清干擾后細(xì)胞活性檢測(cè) 收集1.3.3中使用30 mmol/L D-葡萄糖誘導(dǎo)24 h的HUVEC,接種于96孔板(4.5×104個(gè)/孔),隨機(jī)分為空白對(duì)照組、對(duì)照組、巴戟天低、中、高劑量組,用1.3.1中制備的不含藥血清和不同濃度的巴戟天含藥血清對(duì)應(yīng)處理對(duì)照組、巴戟天低、中、高劑量組細(xì)胞,空白對(duì)照組不做任何處理,24 h后,采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率。

1.3.5Annexin Ⅴ-FITC/PI實(shí)驗(yàn) 收集1.3.2中HUVEC,接種于6孔板(1.2×106個(gè)/孔),按照1.3.4中方法隨機(jī)分組并處理,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。胰酶(不含EDTA)消化收集細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗、離心、500 μl結(jié)合緩沖液重懸,加入10 μl/管Annexin Ⅴ-FITC和5 μl/管 PI,混合均勻,避光保存15 min,吹打均勻后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HUVEC凋亡情況。凋亡率(%)=凋亡早期細(xì)胞比例+凋亡晚期細(xì)胞比例。

1.3.6劃痕實(shí)驗(yàn) 調(diào)整1.3.2中HUVEC密度為6×105個(gè)/ml,接種于6孔板(2 ml/孔),待細(xì)胞匯合率大于85%,使用200 μl槍頭做劃痕處理,按照1.3.4中分組方法并處理24 h,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,顯微鏡下觀察并記錄,ImageJ處理圖像,計(jì)算各組HUVEC平均愈合率。愈合率=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.3.7Transwell實(shí)驗(yàn) 收集1.3.2中HUVEC,接種于包被Matrigel基底膠的Transwell上室(5×106個(gè)/ml,200 μl),按照1.3.4中方法分組并處理,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,分別加入200 μl無(wú)血清ECM培養(yǎng)基。下室加入對(duì)應(yīng)濃度的巴戟天含藥血清及200 μl ECM完全培養(yǎng)基,孵育24 h。取出小室,甲醛固定25 min,結(jié)晶紫染色20 min,風(fēng)干,隨機(jī)選取6個(gè)視野,顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.3.8qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 參照Trizol說(shuō)明書(shū),提取1.3.4中各組細(xì)胞總RNA,并計(jì)算RNA純度(OD260 nm/OD280 nm)。反轉(zhuǎn)錄得cDNA。取2.5 μl cDNA模板,上下引物各1 μl,對(duì)各組HUVEC細(xì)胞FOXP2、AGGF1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性30 s,58 ℃退火45 s,62 ℃延伸30 s,共40次循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法分析目標(biāo)基因表達(dá)情況。引物序列如下:FOXP2上游引物5′-TGGATGACCGAAGCACTGCTCA-3′,下游5′-TGGGAGATGGTTTGGGCTCTGA-3′;AGGF1上游引物5′-TGGTCCAACACTAAGTAAGGAGG-3′,下游5′-CCCTACGTTTTCCAGCTCTATCT-3′;GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAA-AAT-3′,下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.3.9Western印跡分析實(shí)驗(yàn) 按照1.3.4中方法分組、鋪板并使用巴戟天含藥血清處理后,加入250 μl/孔R(shí)IPA裂解液低溫裂解30 min,離心收集上清。12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、封閉液封閉4 h,加入一抗FOXP2、AGGF1和GAPDH(1∶5 000),室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,加入二抗(1∶10 000),TBST洗膜3次,ECL曝光顯影,觀察條帶并拍照記錄,Image-J處理圖片,以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算FOXP2/GAPDH、AGGF1/GAPDH比值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析,進(jìn)一步兩組間比較行SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1高糖誘導(dǎo)對(duì)HUVEC增殖抑制作用 與對(duì)照組〔(97.48±2.11)%〕相比,高糖組(10、15、20、30、40 mmol/L)HUVEC存活率依次降低〔(97.48±2.11)%、(91.09±3.34)%、(84.27±2.23)%、(71.77±3.06)%、(51.69±2.47)%、(37.84±2.63)%,P<0.05〕。

2.2巴戟天含藥血清對(duì)HUVEC活性影響 與空白對(duì)照組和對(duì)照組相比,巴戟天低、中、高劑量組HUVEC存活率依次明顯升高(P<0.05),呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表1。

表1 巴戟天含藥血清作用后各組HUVEC存活、凋亡、遷移及侵襲

2.3巴戟天含藥血清對(duì)HUVEC凋亡的影響 與空白對(duì)照組和對(duì)照組相比,巴戟天低、中、高劑量組HUVEC凋亡率依次明顯降低(P<0.05),呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組細(xì)胞凋亡

2.4巴戟天含藥血清對(duì)HUVEC遷移能力、侵襲數(shù)量的影響 與空白對(duì)照組和對(duì)照組相比,巴戟天低、中、高劑量組HUVEC劃痕愈合率、侵襲數(shù)量依次明顯升高(均P<0.05),呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表1、圖2、圖3。

圖2 各組HUVEC遷移(×100)

圖3 巴戟天含藥血清對(duì)HUVEC侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

2.5巴戟天含藥血清對(duì)HUVEC FOXP2及AGGF1表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組和對(duì)照組相比,巴戟天低、中、高劑量組中FOXP2、AGGF1 mRNA及蛋白表達(dá)水平依次明顯升高(P<0.05),呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表2、圖4。

1～5:空白對(duì)照組、對(duì)照組、巴戟天低劑量組、巴戟天中劑量組、巴戟天高劑量組圖4 Western印跡檢測(cè)各組HUVEC FOXP2、AGGF1蛋白表達(dá)

表2 各組FOXP2、AGGF1 mRNA及蛋白表達(dá)比較

3 討 論

在我國(guó),DM發(fā)病率高達(dá)10.9%,居全球第一〔7〕。血管并發(fā)癥是導(dǎo)致DM患者死亡率高的首要原因,而血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是血管并發(fā)癥的標(biāo)志〔8〕。高糖狀態(tài)能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)凋亡,損傷血管內(nèi)皮〔9〕,因此,減輕高糖誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用是潛在的治療目標(biāo)。本研究首先構(gòu)建了高糖損傷模型,結(jié)果顯示,當(dāng)D-葡萄糖濃度大于30 mmol/L,HUVEC損傷嚴(yán)重(存活率<50%),不利于后續(xù)研究,因此選擇30 mmol/L作為模擬高血糖損傷內(nèi)皮細(xì)胞的最佳濃度。

巴戟天藥材來(lái)源于巴戟天干燥根,主要成分有寡糖、蒽醌、環(huán)烯醚萜等,在滋補(bǔ)腎陽(yáng)方面具有良好的功效〔10〕。近年來(lái),冉志芳等〔11〕研究發(fā)現(xiàn),巴戟天能夠促進(jìn)斑馬魚(yú)節(jié)間血管生成;另外,作為巴戟天主要活成物質(zhì)之一,巴戟天糖鏈對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化具有促進(jìn)作用〔5〕;傅文生等〔12〕研究發(fā)現(xiàn),巴戟天結(jié)合振動(dòng)干擾,對(duì)治療Ⅱ型糖尿病大鼠具有積極作用。本研究結(jié)果提示,巴戟天含藥血清能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,推測(cè)巴戟天可能對(duì)DM血管并發(fā)癥患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至其他部位是血管形成的關(guān)鍵,而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移侵襲功能有利于新血管形成〔13〕。Chen等〔14〕研究發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)后HUVEC的遷移能力明顯降低;王寧〔15〕研究證實(shí),巴戟天糖鏈能夠提高缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的HUVEC遷移能力;本研究結(jié)果提示,巴戟天含藥血清能夠促進(jìn)高糖誘導(dǎo)下HUVEC的遷移能力,與上述研究結(jié)果一致。DM血管并發(fā)癥與血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡及遷移關(guān)系密切相關(guān)〔16〕,因此推測(cè),巴戟天可能是緩解DM血管并發(fā)癥潛在的有效中草藥之一。

FOXP2能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的細(xì)胞遷移行為〔17,18〕。AGGF1是一種血管生成因子,正常狀態(tài)下在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)〔19〕。Zhang等〔20〕研究證實(shí),AGGF1對(duì)體內(nèi)生理性血管生成至關(guān)重要,與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移有關(guān)。本研究結(jié)果提示,巴戟天含藥血清促進(jìn)HUVEC增殖及遷移,可能與激活FOXP2/AGGF1表達(dá)水平相關(guān)。Liu等〔21〕研究發(fā)現(xiàn),激活FOXP2/AGGF1通路,對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移具有促進(jìn)作用,與本研究結(jié)果一致,因此推測(cè)巴戟天可能通過(guò)激活FOXP2/AGGF1信號(hào)通路,促進(jìn)高糖誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上,巴戟天含藥血清可促進(jìn)HUVEC增殖、遷移、侵襲,并抑制細(xì)胞凋亡,可能與激活FOXP2/AGGF1信號(hào)通路相關(guān),表明巴戟天在減緩DM血管并發(fā)癥方向具有潛在治療價(jià)值,可能為改善DM血管并發(fā)癥的治療效果提供了參考依據(jù)。但鑒于DM發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性及體外實(shí)驗(yàn)與臨床疾病之間的巨大差異,本文將進(jìn)一步聯(lián)合DM血管并發(fā)癥小鼠模型和臨床試驗(yàn),針對(duì)巴戟天調(diào)控機(jī)制及作用效果進(jìn)行更深入的探索。