姜偉華 高永山 劉娜 張媛 楊燕君 王貴剛 董躍華 張振明

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院 1胸外科,河北 張家口 075000;2手術(shù)室)

肺癌是最致命的惡性腫瘤之一,全世界每年新增病例超過180萬例〔1〕。肺癌存在許多病理類型,但約85%的肺癌患者被診斷為非小細胞肺癌,其5年生存率僅為10%〔2,3〕。盡管近年來在肺癌診斷和治療方面取得了顯著進展,但預后仍不樂觀〔4,5〕。

嵌合抗原受體(CAR)T細胞在治療多種B細胞白血病和淋巴瘤方面已經(jīng)顯示出良好的臨床效果〔6,7〕,但在針對實體腫瘤方面仍然存在挑戰(zhàn)〔8〕?；谝?guī)律間隔成簇短回文重復序列(CRISPR)/CRISPR關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)(Cas)9方法對原代T細胞進行編輯的策略增強了CAR-T細胞治療實體瘤的前景〔9,10〕。

程序性死亡受體(PD)-1在T細胞激活后會短暫上調(diào),是抑制T細胞發(fā)揮免疫功能的主要效應(yīng)分子之一〔11〕。本研究中,選擇肺癌中普遍高表達的表皮生長因子受體(EGFR)作為靶點,開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9破壞PD-1的CAR-T細胞,來探索這種利用基因編輯破壞PD-1的EGFR-CAR-T細胞是否可以有效地抑制肺癌的進展。

1 材料和方法

1.1血液、細胞系和主要試劑 健康人外周血由河北北方學院附屬第一醫(yī)院提供,所有流程經(jīng)過河北北方學院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準,志愿者均知情同意。HCC827、NCI-H1650、NCI-H23及A549細胞系購自中科院上海細胞庫,所有細胞使用DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

聚凝胺(Polyberene)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑、膠原酶Ⅰ及蘇木素染液購自上海翌圣生物科技有限公司;聚蔗糖(Ficol)試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司;CD3/CD28激活磁珠購自美國Gibco公司;T細胞培養(yǎng)基購自德國美天旎公司;乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司;CD45-APC-Cy7、CD3-藻紅蛋白(PE)、PD-1-APC及EGFR-PE抗體購自美國Biolegend公司;兔抗PD-1抗體購自美國CST公司;白細胞介素(IL)-2購自北京義翹神州生物科技有限公司;EGFR-CAR慢病毒購自上海吉凱生物科技有限公司;PD-1引導RNA(gRNA,GGCCAGGATGGTTCTTAGGT)由安徽通用生物有限公司合成;Cas9蛋白購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2外周血單核細胞(PBMC)的分離及CAR-T細胞的構(gòu)建 按照Ficol試劑的說明書,采用密度梯度離心法獲得PBMC,按照2×106/ml密度進行培養(yǎng),6 h后小心吸取上清,離心重懸后獲得PBMC。取6×106個PBMC,加入80 μl CD3/CD28激活磁珠,培養(yǎng)24 h,之后將細胞均分為3份,分別為未轉(zhuǎn)導T細胞(UT)組、野生型EGFR-CAR-T細胞(CAR-T)組及PD-1敲除的EGFR-CAR-T細胞(PD-1-CAR-T)組。在CAR-T及PD-1-CAR-T組中加入8 μg/ml的Polyberene,在加入100 μl EGFR-CAR慢病毒,4 000 r/min離心60 min,放入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。24 h后在PD-1-CAR-T組中加入3.6 μg的Cas9和3.6 μg的gRNA充分混合,置于調(diào)整密度為1×108/ml,并置于0.2 cm的電轉(zhuǎn)杯中。電轉(zhuǎn)結(jié)束后,將細胞重懸于T細胞培養(yǎng)基中,在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3LDH釋放實驗檢測CAR-T細胞對靶細胞的細胞毒性 取1×104個腫瘤細胞置于96孔板中,待細胞密度為80%時分別加入UT、CAR-T及PD-1-CAR-T,共孵育24 h。孵育結(jié)束后離心取上清,按照LDH細胞毒性檢測試劑盒的說明檢測對靶細胞的細胞毒性。細胞毒性按如下方法計算:細胞毒性(%)=(處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度)/(細胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度)×100%。

1.4流式細胞術(shù)檢測CAR-T細胞陽性率、EGFR、PD-1表達情況及腫瘤組織中T細胞比例 CAR-T細胞陽性率:分別取1×105個慢病毒感染5 d后的UT、CAR-T及PD-1-CAR-T,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后,使用100 μl PBS重懸細胞,使用流式細胞儀進行檢測;EGFR表達:分別取1×106個HCC827、NCI-H1650、NCI-H23及A549細胞,PBS清洗3次后,將每種細胞均分為兩份,使用100 μl PBS重懸細胞,在染色組的管子中加入5 μl EGFR-PE的抗體,冰箱中孵育30 min,PBS清洗3次后,使用300 μl PBS重懸細胞,使用流式細胞儀進行檢測;PD-1表達檢測:收集1.3中共孵育結(jié)束后的懸浮細胞,PBS清洗3次后,使用50 μl PBS重懸細胞,加入2 μl CD3-PE和PD-1-APC抗體,冰箱中孵育30 min,PBS清洗3次后,使用100 μl PBS重懸細胞,使用流式細胞儀進行檢測;

腫瘤組織中T細胞檢測:取新鮮分離的腫瘤組織10 mg,將其剪碎后加入1 ml含有1 mg/ml膠原酶Ⅰ的PBS,37 ℃孵育1 h,使用70 μm濾網(wǎng)過濾,收集的細胞用PBS清洗3次后,使用100 μl PBS重懸細胞,加入5 μl CD3-PE和CD45-APC-Cy7抗體,冰箱中孵育30 min,PBS清洗3次后,使用300 μl PBS重懸細胞,使用流式細胞儀進行檢測。

1.5體內(nèi)移植瘤模型檢測CAR-T細胞的腫瘤抑制功能 15只M-NSG重度免疫缺陷小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司,所有動物實驗經(jīng)過河北北方學院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準,動物飼養(yǎng)于河北北方學院附屬第一醫(yī)院SPF動物中心。本部分所用的表達紅色熒光蛋白的NCI-H23細胞系(NCI-H23-RFP)由本實驗前期構(gòu)建保存。取1×107個NCI-H23-RFP細胞皮下注射到小鼠的背部皮下,第7天腫瘤長至100 mm3時分別通過尾靜脈回輸1×107個UT、CAR-T及PD-1-CAR-T,分別在接瘤后第7天和第21天進行活體成像檢測。待小鼠死亡后取腫瘤組織進行瘤重檢測。

1.6免疫組織化學法檢測腫瘤組織中PD-1的表達 取20 mg分離的小鼠腫瘤組織,使用4%多聚甲醛(PFA)固定24 h,之后經(jīng)過脫水包埋及切片后,制成組織切片。在組織切片上滴加50 μl 山羊血清室溫封閉2 h,之后滴加50 μl抗PD-1抗體,在冰箱中孵育過夜,次日滴加50 μl山羊抗兔二抗,室溫孵育1 h,之后通過DAB顯色,蘇木素染色后封片,在顯微鏡下觀察并拍照。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1CAR-T及PD-1-CAR-T細胞的鑒定 EGFR-CAR的序列結(jié)構(gòu)如圖1A所示。對構(gòu)建的T細胞進行流式檢測,結(jié)果表明,未經(jīng)基因編輯的CAR-T細胞的陽性率為41.3%,經(jīng)過CRISPR/Cas9敲除PD-1的CAR-T細胞的陽性率為52.7%(圖1B)。

A.EGFR CAR結(jié)構(gòu);B.流式細胞術(shù)檢測CAR表達圖1 EGFR CAR-T細胞的性質(zhì)

2.2腫瘤細胞表面EGFR的表達檢測 HCC827細胞不表達EGFR,NCI-H1650低表達EGFR(16.3%),NCI-H23及A549細胞高表達EGFR,分別為97.6%、99.8%(圖2)。

1:對照;2:抗體染色圖2 腫瘤細胞中EGFR的表達

2.3CAR-T及PD-1-CAR-T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性及PD-1表達檢測 CAR-T及PD-1-CAR-T組對HCC827細胞的殺傷活性較UT組無差異,CAR-T及PD-1-CAR-T細胞對NCI-H1650、NCI-H23及A549細胞的殺傷活性顯著高于UT組,而PD-1-CAR-T細胞對NCI-H23及A549細胞的殺傷活性較CAR-T組進一步提高,見表1。此外,對與NCI-H23細胞共孵育的效應(yīng)細胞進行流式檢測,結(jié)果表明CAR-T組PD-1細胞比例〔(25.600±2.600)%〕明顯高于UT組〔(5.377±0.544)%,P<0.000 1〕,PD-1-CAR-T組PD-1細胞比例〔(11.630±1.365)%〕顯著低于CAR-T組(P<0.001),見圖3。

圖3 T細胞中PD-1表達水平

2.4CAR-T及PD-1-CAR-T細胞的體內(nèi)抗腫瘤活性 回輸PD-1-CAR-T細胞的小鼠體內(nèi)的腫瘤熒光強度低于回輸CAR-T細胞組(圖4A)。生存曲線顯示,回輸PD-1-CAR-T細胞較回輸CAR-T細胞可以延長小鼠的生存期(圖4B)。此外,CAR-T組腫瘤質(zhì)量〔(353.300±48.440)mg〕明顯低于UT組〔(831.300±37.580)mg,P<0.000 1〕;PD-1-CAR-T組腫瘤質(zhì)量〔(152.700±59.000)mg〕也顯著低于CAR-T組(P<0.01)。

A.NCI-H23腫瘤細胞在7、21 d時的體內(nèi)成像;B.治療后的生存曲線圖4 CAR-T細胞的體內(nèi)抗腫瘤活性

2.5腫瘤浸潤T細胞檢測及腫瘤中PD-1的表達水平檢測 CAR-T組腫瘤中T細胞比例〔(7.733±0.710)%〕明顯高于UT組〔(0.103±0.046)%,P<0.000 1〕;PD-1-CAR-T組腫瘤中T細胞比例〔(12.330±0.603)%〕顯著高于CAR-T組(P<0.001),見圖5。免疫組化結(jié)果表明,CAR-T組腫瘤組織中PD-1細胞數(shù)〔(213.700±22.740)個〕明顯高于UT組〔(53.330±15.500)個,P<0.000 1〕;PD-1-CAR-T組腫瘤組織中PD-1細胞數(shù)〔(92.000±11.530)個〕顯著低于CAR-T組(P<0.001)。見圖6。

圖5 腫瘤組織中T細胞浸潤

圖6 各組腫瘤組織中PD-1表達(蘇木素染色,×100)

3 討 論

肺癌是一種免疫抑制型癌癥,其腫瘤微環(huán)境限制抗腫瘤免疫,促進腫瘤進展,是肺癌治療的重要障礙〔12〕。本研究結(jié)果表明,基于CRISPR/Cas9敲除PD-1可顯著提高CAR-T細胞對實體瘤的療效。

盡管CAR-T細胞和免疫檢查點抑制劑這兩種主要的癌癥免疫治療方法為癌癥患者帶來了更多的治療希望,但控制一些癌癥的進展,特別是實體腫瘤,仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)〔13,14〕。據(jù)報道,CAR-T細胞在腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤功效大打折扣,很大一部分原因是其自身PD-1的表達抑制了抗腫瘤效應(yīng)功能〔15〕。CAR-T細胞和PD-1受體抑制劑的聯(lián)合使用可以改善腫瘤發(fā)展和患者的總生存期〔16〕。通過PD-1失活受體或PD-1信號轉(zhuǎn)換受體實現(xiàn)的PD-1信號阻斷同樣可以提高CAR-T細胞的療效〔17〕。PD-1阻斷抗體的阻斷作用是短暫的,需要反復給藥〔18,19〕。近期有研究表明,CRISPR/Cas9介導的PD-1的敲除可以增強CD19-CAR-T細胞的功能〔20〕。本研究中構(gòu)建的PD-1敲除的EGFR-CAR-T細胞不僅在體外增強了對腫瘤細胞的殺傷作用,在體內(nèi)的腫瘤抑制功效同樣卓越,抗腫瘤功能被顯著增強。然而,在體外研究中,PD-1敲除的EGFR-CAR-T細胞較未敲除PD-1的EGFR-CAR-T細胞殺傷能力并無顯著增加,這一現(xiàn)象可能與腫瘤細胞表面EGFR的低表達有關(guān)。

CAR-T細胞的擴增和持久性是體內(nèi)抗腫瘤療效的關(guān)鍵〔21〕。研究人員發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子核酸酶(TALEN)介導的腫瘤反應(yīng)性淋巴細胞中的PD-1失活增強了T細胞的持久性,并改善了體內(nèi)對黑色素瘤和纖維肉瘤的抗腫瘤療效〔22〕。也有研究證明PD-1失活受體的共轉(zhuǎn)導增加了28ζCAR-T細胞的增殖能力,并逆轉(zhuǎn)了PD-1配體介導對CAR-T細胞抗腫瘤活性的抑制作用〔9〕。在本研究中,PD-1缺失的EGFR-CAR-T細胞較野生型EGFR-CAR-T細胞的體內(nèi)持久性明顯增強,這也可能與其卓越的腫瘤抑制功能有關(guān)。

高效和便捷的基因編輯手段為改進過繼性免疫治療的療效開辟了多樣化的途徑。如PD-1編輯的CAR-T細胞的抗腫瘤功能增強,便可允許醫(yī)生使用更少的細胞來達到同等的治療效果〔23〕。然而對于這種編輯方案,一個潛在的風險是PD-1缺陷的CAR-T細胞仍然表達自身反應(yīng)性TCR,可能導致類似于系統(tǒng)性PD-1抗體阻斷的自身免疫疾病〔24〕。然而,其他研究小組報告了通過刪除內(nèi)源性TCR基因來產(chǎn)生“通用”型異體T細胞來預防移植物抗宿主病〔25〕?？紤]到基于多重CRISPR/Cas9編輯的可操作性,添加靶向內(nèi)源性TCR的gRNA和選擇性去除TCR+細胞將產(chǎn)生高效的、腫瘤特異性的CAR-T細胞。

綜上,CRISPR/Cas9介導的PD-1敲除可以在體外和體內(nèi)改善CAR-T細胞的效應(yīng)功能,增強其對肺癌的抑制活性。本研究有助于下一代CAR-T細胞的開發(fā),為肺癌的治療提供一種潛在的手段。