梁伊靈 黃波 付星瑋 李曉波 薄威 張忠 王旭光 王柏芳 張珉

(1沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病理教研室,遼寧 沈陽 110034;2遼寧省腫瘤醫(yī)院病理科)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一〔1〕,已成為我國城市人口惡性腫瘤的首要死因,約80%的肺癌病例為非小細胞肺癌(NSCLC),其病理類型包括鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌等〔2〕,約75%的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期,5年生存率很低〔3〕。尋找調(diào)控NSCLC進展的關(guān)鍵因子,揭示其發(fā)揮調(diào)控作用的分子機制,將有助于臨床對NSCLC的診斷及治療。

環(huán)指蛋白(RNF)181又稱為HSPC238〔4〕,屬于RNF超家族,具有RING型結(jié)構(gòu)域〔5〕,其基因組全長716個堿基,編碼153個氨基酸〔6〕,在胰腺、肝臟、腎臟等25個組織中均有表達〔7〕。環(huán)指結(jié)構(gòu)域?qū)儆阡\指型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域,由40～60個氨基酸組成,并含有C3HC4氨基酸基序(7個半胱氨酸和1個組氨酸非連續(xù)排列),可以結(jié)合兩個鋅離子(Zn2+)〔8〕,多數(shù)含有RING結(jié)構(gòu)域的蛋白具有E3泛素連接酶活性,可以同時結(jié)合泛素化酶及其底物,導致底物降解,是參與泛素化途徑的重要蛋白。RNF181在多種腫瘤組織中存在表達,但在腫瘤進展過程中發(fā)揮的調(diào)控作用尚存在爭議,其在NSCLC中的表達情況及其調(diào)控腫瘤進展的分子機制目前尚無報道,需進一步深入研究。本課題通過研究RNF181對NSCLC進展所發(fā)揮的調(diào)控作用,查找其調(diào)控的關(guān)鍵靶點分子及下游信號通路,揭示其調(diào)控腫瘤進展的分子機制,以期為NSCLC臨床診斷及治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1病例選取 選取2013年6月至2018年12月經(jīng)手術(shù)切除后并經(jīng)病理診斷確診的肺腺癌組織45例及肺鱗癌組織30例,以各病例癌旁肺組織作為對照?；颊咝g(shù)前均未進行放療、化療或內(nèi)分泌治療,年齡38～82歲,平均年齡59.8歲;男43例,女32例;病理學分級Ⅰ級39例,Ⅱ和Ⅲ級36例,出現(xiàn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 38例。以上病例均進行蘇木素-伊紅(HE)染色,并由沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院兩位病理科醫(yī)師復核確診,根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2015年頒布的肺癌組織學分型標準進行病理分型,并根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2017年頒布的第8版肺癌腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移(TNM)分期系統(tǒng)進行肺癌分期、分級。本實驗經(jīng)沈陽醫(yī)學院倫理委員會批準實行,患者均簽署知情同意書。

1.2免疫組織化學染色

1.2.1主要試劑 磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.2～7.6)、抗原修復緩沖液(檸檬酸法,pH6.0)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、非免疫山羊血清封閉液、即用型免疫組織化學染色EliVision plus試劑盒(鼠/兔)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)辣根過氧化物酶顯色試劑盒等均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,RNF181單克隆抗體(鼠抗人)購于美國Santa cruz公司(SC-376343)。

1.2.2主要方法 手術(shù)切除的肺癌組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定,采用常規(guī)石蠟包埋;制作連續(xù)的4 μm厚切片,用涂有0.5%多聚賴氨酸處理的載玻片撈出;所有切片在同一實驗室采用同一批號試劑進行后續(xù)實驗;免疫組織化學染色采用兩步法:將切片放入70 ℃烤片機烤1 h;將切片用二甲苯脫蠟,梯度酒精水化;進行抗原修復(以pH6.0檸檬酸鈉為緩沖液進行高壓修復2 min);3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;非免疫山羊血清阻斷非特異性結(jié)合;RNF181一抗(1∶650)4 ℃孵育過夜;Evision A液、B液37 ℃各孵育15 min;DAB顯色,蘇木素復染核,自來水返藍,常規(guī)梯度酒精脫水,二甲苯透明,封片觀察。結(jié)果判定:每張免疫組織化學染色切片,隨機選取10個(×400)視野,并隨機計數(shù)細胞200個,進行RNF181陽性結(jié)果判定,判定標準如下:陽性染色主要位于胞質(zhì),(1)染色強度:沒有陽性染色計0分,淺黃色計1分,棕色計2分,棕褐色計3分;(2)陽性染色范圍:陽性染色腫瘤細胞范圍<10%計0分,10%～25%計1分,26%～50%計2分,51%～75%計3分,>75%計4分。兩項評分相乘得最終評分(0～12分),得分<6分為RNF181低表達,≥6分為高表達。

1.3細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 A549和H1299細胞株購于中國科學院上海細胞庫,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(Biological Industries,美國)在37 ℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。RNF181質(zhì)粒購自北京傲銳東源生物科技有限公司,其中RNF181 開放閱讀框(ORF)構(gòu)建于PCMV6載體中,轉(zhuǎn)染此載體過表達RNF181,作為PCMV6-RNF181組,轉(zhuǎn)染PCMV6空載體作為對照,即PCMV6組。RNF181小干擾RNA(siRNA)購自蘇州吉瑪基因公司,序列分別為:①陰性對照(NC):正義引物:5′-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義:5′-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT-3′;②siRNA1:正義引物:5′-GGCGUCCUAUUUCGAUGAATT-3′,反義:5′-UUCA-UCGAAAUAGGACGCCTT-3′;③siRNA2:正義引物:5′-CCCACUGAUGACGACAUUTT-3′,反義:5′-AAGUGUCGUCAUCAGUGGGTT-3′;④siRNA3:正義引物:5′-GAUGCCUUGCCAUCACCUUTT-3′,反義:5′-AAGGU-GAUGGCAAGGCAUCTT-3′。轉(zhuǎn)染NC作為對照組,分別轉(zhuǎn)染siRNA序列②、③、④,作為RNAi1、RNAi2、RNAi3組。細胞轉(zhuǎn)染試劑為LipofectamineTM3000(購于Thermo Fisher Scientific,美國),按照說明書推薦劑量進行轉(zhuǎn)染,48 h后提取蛋白。

1.4Western印跡實驗 將H1299和A549細胞轉(zhuǎn)染48 h后,NP40裂解液(碧云天,中國)裂解細胞提取蛋白,并用二喹啉甲酸(BCA)法(碧云天,中國)進行蛋白定量。40 μg總蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后,轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,美國)上,用TBST(含5%脫脂奶粉)封閉1.5 h后。加入稀釋后的一抗,一抗稀釋比例如下:RNF181(1∶800,SantaCruz Biotechnology,美國)、細胞周期蛋白(cyclin)D1、cyclinA2、cyclinB1、內(nèi)皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)型鈣黏附蛋白(N-cadherin)、Snail同源物1(Snail)、Snail同源物2(Slug,1∶1 000,Cell Signaling Technology,美國)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、微管蛋白(α-tublin,1∶20 000,proteintech,中國)。之后用過氧化物酶耦聯(lián)抗鼠或兔IgG(1∶1 000,Cell Signaling Technology,美國)室溫孵育2 h,滴加電化學發(fā)光(ECL)液(Thermo Scientific,美國)使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon,中國)檢測蛋白表達及活化水平。

1.5MTT實驗 饑餓培養(yǎng)細胞后轉(zhuǎn)染,24 h后接種于96孔板中〔4×103個細胞/(100 μl·孔)〕,每孔加入20 μl(5 mg/ml)MTT培養(yǎng)4 h,移除孔內(nèi)溶液加入二甲基亞砜(DMSO,150 μl/孔),震蕩后用酶標儀(Molecular Devices,美國)檢測在490 nm處的OD值,每種處理條件均有5個復孔,連續(xù)觀察5 d。

1.6Transwell實驗 將Transwell上室底部預先鋪置基質(zhì)膠,細胞轉(zhuǎn)染24 h后消化并重懸于無血清RPMI1640培養(yǎng)液中,上室內(nèi)加入〔2×105個細胞/(100 μl·孔)〕細胞懸液,在下室內(nèi)加入600 μl含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液,放入孵箱中培養(yǎng)22 h后,取出孔板,吸出小室中的培養(yǎng)液,用棉簽擦掉上室內(nèi)的細胞,PBS淋洗后將小室放入4%多聚甲醛中固定10 min后吸出,將小室放入結(jié)晶紫染液中染色5 min后經(jīng)清水洗滌,倒置顯微鏡下隨機選取5個視野對侵襲細胞進行計數(shù)。

1.7流式細胞技術(shù)檢測細胞周期 采用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h使細胞周期同步化,更換正常培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)染48 h后,經(jīng)胰酶消化,吹打制成單細胞懸液,PBS洗滌、離心棄上清,經(jīng)75%乙醇4 ℃固定過夜,PBS洗滌、洗滌離心棄上清,加入碘化丙啶(PI)重懸細胞避光孵育30 min,流式細胞儀分析細胞周期。

2 結(jié) 果

2.1RNF181在NSCLC中低表達,并抑制腫瘤進展 免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn),RNF181主要定位于細胞質(zhì),肺癌組織中RNF181表達水平(4.19±2.10)顯著低于癌旁肺組織(9.39±1.54,t=17.17,P<0.01)。見圖1。不同肺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況對RNF181表達影響差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 RNF181的表達與臨床病理指標之間的關(guān)系〔n(%)〕

圖1 NSCLC組織中RNF181免疫組織化學染色(×400)

2.2RNF181抑制NSCLC細胞侵襲、增殖能力 Western 印跡檢測顯示,H1299及A549細胞NC組RNF181蛋白表達量顯著高于RNAi1組、RNAi2組及RNAi3組(P<0.05),2種細胞系中RNAi2干擾效果最為明顯,將其用于后續(xù)實驗。見圖2、表2。Transwell實驗結(jié)果顯示,H1299和A549細胞PCMV6-RNF181組侵襲細胞顯著少于PCMV6組(P<0.05),RNAi2組侵襲細胞顯著多于NC組(P<0.05)。見表3、圖3。MTT實驗結(jié)果顯示,2～5 d H1299和 A549細胞PCMV6-RNF181組增殖能力顯著低于PCMV6組(P<0.05),RNAi2組的增殖能力顯著高于NC組(P<0.05)。見表4。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),H1299和A549細胞PCMV6-RNF181組處于G0/G1期的細胞數(shù)顯著多于PCMV6組(P<0.05),RNAi2組處于G0/G1期的細胞數(shù)顯著少于NC組(P<0.05)。見圖4、表5。上述結(jié)果提示RNF181可抑制NSCLC細胞的侵襲能力,且可通過調(diào)控細胞周期抑制細胞增殖能力。

1～6:PCMV6組、PCMV6-RNF181組、NC組、RNAi1組、RNAi2組、RNAi3圖2 Western印跡檢測各組H1299、A549細胞中RNF181的過表達及干擾效率

表2 在H1299及A549細胞中過表達及干擾

表3 RNF181對NSCLC細胞侵襲能力的影響

表4 MTT實驗檢測RNF181對 NSCLC細胞增殖能力的影響

表5 RNF181對NSCLC細胞周期G0/G1期的影響

圖3 Transwell實驗檢測RNF181對NSCLC細胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

圖4 流式細胞技術(shù)檢測RNF181對NSCLC細胞周期的影響

2.3RNF181通過抑制EMT抑制NSCLC侵襲 上調(diào)H1299及A549細胞中RNF181的表達水平后,E-cadherin的表達水平顯著增高,而N-cadherin、Snail和Slug的表達水平顯著下降(P<0.05)。而敲低RNF181表達水平后得到相反的結(jié)果,E-cadherin的表達水平顯著下降,N-cadherin、Snail及Slug的表達水平顯著升高(P<0.05)。見表6、圖6。上述結(jié)果提示,RNF181 可能通過抑制EMT降低H1299及A549細胞的侵襲能力。

表6 RNF181對NSCLC細胞EMT及細胞周期相關(guān)蛋白表達的調(diào)控作用

2.4RNF181通過調(diào)控細胞周期抑制NSCLC增殖 上調(diào)H1299及A549細胞中RNF181的表達水平后,cyclinD1的表達水平顯著下降(P<0.05),而下調(diào)RNF181表達水平后得到相反的結(jié)果(P<0.05),而cyclinB1、cyclinA2的表達水平并未發(fā)生相應變化(P>0.05)。見表6、圖5。上述研究結(jié)果提示RNF181可能通過抑制cyclinD1的表達水平介導細胞G1/S期阻滯,進而抑制NSCLC增殖。

1～4:PCMV6組、PCMV6-RNF181組、NC組、RNAi2組圖5 RNF181對NSCLC細胞EMT及細胞周期相關(guān)蛋白的表達調(diào)控

3 討 論

本文表明,RNF181主要定位于細胞質(zhì),其在NSCLC組織中相對低表達,且與肺癌臨床病理分期及腫瘤局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負相關(guān),提示RNF181可能對NSCLC進展發(fā)揮抑制作用。

Transwell實驗發(fā)現(xiàn)RNF181可抑制A549及H1299細胞侵襲能力,同步進行的Western印跡實驗發(fā)現(xiàn)RNF181可上調(diào)E-cadherin的表達水平,下調(diào)N-cadherin、Snail、Slug的表達水平。E-cadherin是上皮細胞的標志物〔9,10〕,E-cadherin 表達的丟失是上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)最早發(fā)生的步驟之一〔11〕。Snail和Slug是E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制劑,N-cadherin是間質(zhì)細胞的標志物,細胞發(fā)生EMT時,三者的表達水平可能相應增加〔12〕。EMT是上皮細胞逐漸失去自身特有的表型而逐漸獲得間質(zhì)細胞表型的轉(zhuǎn)換過程,在生長發(fā)育,纖維化等多種生理、病理過程中發(fā)揮重要作用,尤其在腫瘤進展過程中,腫瘤細胞常通過EMT獲得更強的侵襲、轉(zhuǎn)移能力及生存能力〔13〕。本研究結(jié)果提示,RNF181可通過調(diào)控EMT抑制NSCLC細胞侵襲能力。

MTT實驗結(jié)果顯示,RNF181可以抑制A549,H1299兩種細胞的增殖能力,經(jīng)流式細胞技術(shù)檢測細胞周期發(fā)現(xiàn):上調(diào)RNF181的表達水平可將細胞周期阻滯于G1/S期。通過Western印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn):RNF181對cyclinA2、cyclinB1等蛋白表達水平無明顯影響,但其可引起cyclinD1表達水平下降。細胞通過進入細胞周期不斷分裂增殖,細胞周期相關(guān)蛋白及其激酶和抑制物對細胞周期發(fā)揮重要調(diào)控作用〔14～16〕,cyclinD1與CDK4/6結(jié)合可促進細胞通過G1/S期,加速分裂增殖〔17,18〕,本研究結(jié)果提示,RNF181可通過抑制cyclinD1表達水平阻滯細胞G1/S期轉(zhuǎn)換,進而抑制NSCLC增殖能力。

現(xiàn)有研究中對RNF181調(diào)控腫瘤進展作用的報道尚存在矛盾之處,RNF181在彌漫大B細胞淋巴瘤、肝癌、胃癌、乳腺浸潤性導管癌中低表達,并且與腫瘤進展及不良預后相關(guān)〔5,19～24〕。研究發(fā)現(xiàn),RNF181可通過發(fā)揮E3泛素連接酶作用抑制NF-κB信號通路,進而抑制彌漫大B細胞淋巴瘤的生長〔5,8〕。Wang等〔19〕發(fā)現(xiàn),肝癌組織中RNF181表達水平低于癌旁組織,RNF181通過抑制細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/促分裂素原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)信號通路抑制肝癌細胞的體外生長和體內(nèi)成瘤能力。過表達RNF181可導致肝癌的細胞周期阻滯〔25〕。采用順鉑治療肝癌時,RNF181可通過死亡受體途徑促進肝癌細胞凋亡〔26,27〕。體外細胞學實驗發(fā)現(xiàn),過表達RNF181可以明顯抑制肝癌細胞的生長,而敲低RNF181可得到相反的結(jié)果〔28,29〕。RNF181在乳腺浸潤性導管癌中低表達,且與局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)〔30〕。有研究報道了胃癌組織中RNF181的表達水平低于癌旁組織,并且與腫瘤分化、腫瘤大小、臨床病理分期及患者總體生存時間呈負相關(guān),RNF181在體外細胞學實驗及動物模型體內(nèi)實驗中均可通過抑制腫瘤細胞增殖及促進凋亡來抑制胃癌的生長〔21〕。在人胃癌細胞系中,RNF181通過抑制ERK/MAPK信號通路活性,調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1/ D3,p21及CDK4/6的表達水平,從而控制細胞周期從G1期到S期的進展,與細胞學實驗結(jié)果相呼應,胃癌臨床標本中RNF181的表達水平與cyclinD1、CDK4的表達水平呈負相關(guān),揭示了胃癌病變中RNF181-ERK/MAPK-cyclin D1/CDK4通路可抑制胃癌進展〔23〕。

與上述研究結(jié)果相反,部分研究發(fā)現(xiàn),RNF181可促進腫瘤進展。研究發(fā)現(xiàn),RNF181可增加結(jié)腸癌細胞增殖能力并可促進腫瘤血管生成〔31〕。Zhu等〔32〕發(fā)現(xiàn)在ERα陽性乳腺癌細胞中,RNF181通過對ERα特定位點的泛素化修飾防止其進入蛋白酶體降解,進而介導乳腺癌抵抗內(nèi)分泌治療。Zhou等〔26〕發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌中,RNF181通過調(diào)控Hippo/YAP通路促進腫瘤細胞侵襲、遷移及增殖能力。

而基于腸癌的部分研究出現(xiàn)了體內(nèi)、體外實驗結(jié)果不一致的現(xiàn)象,RNF181高表達于癌旁組織,但腸癌體外細胞學實驗中,干擾RNF181并未明顯影響腫瘤的生長能力〔33〕,而下調(diào)RNF181可明顯抑制裸鼠體內(nèi)種植腸癌的生長〔34～36〕。

上述看似矛盾的結(jié)果提示,腫瘤微環(huán)境,RNF181上、下游分子表達水平及相關(guān)信號通路的活化情況均可能影響并改變RNF181的生物學功能,進而影響其對腫瘤進展的調(diào)控方向,發(fā)揮“促癌”或“抑癌”的功能,對其生物功能的研究不能脫離其周圍環(huán)境及遺傳背景等多方面因素,需要綜合考量、分析。

綜上,RNF181可分別通過調(diào)控細胞周期及EMT抑制NSCLC細胞增殖及侵襲能力,其抑制NSCLC進展作用的分子機制仍需深入研究,以期為肺癌診斷及治療提供新的靶點。