趙娟 張京京 武雨晴 張迪 宗雅迪 雷宇華 耿麗娜

(河北醫(yī)科大學 1教學實驗中心,河北 石家莊 050017;2基礎醫(yī)學院;3河北師范大學化學與材料科學學院)

肺癌在2020年中國癌癥新發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)中均居于首位〔1〕。肺癌已經(jīng)成為嚴重威脅我國國民生命健康的公眾衛(wèi)生問題。白藜蘆醇(RES)作為純天然化合物其具有多種生物活性,如抗炎、抗癌、抗氧化及改善心血管功能等作用〔2～5〕。研究證明,RES可用于治療肝癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤〔6,7〕。但RES化學性質不穩(wěn)定,進入人體后易被氧化,且存在水溶性差、口服吸收性差、難以持久作用等缺點,導致生物利用率下降〔8〕。脂質體(LIP)作為藥物載體材料,其結構類似細胞生物膜,具有可溶性好,化學性質穩(wěn)定,促進所攜帶藥物吸收等優(yōu)點〔9,10〕。采用納米LIP對RES進行包封和載運,可延緩藥物釋放、緩解藥物的毒性、增強藥物穩(wěn)定性,提高療效〔11,12〕。本研究RES-LIP對A549細胞增殖及凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1材料與試劑 RES(純度>98%)購自上海源葉生物科技有限公司;大豆卵磷脂(純度>75%)購自北京源華美磷脂科技有限公司;膽固醇(純度>95%)購自上海源葉生物科技有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司;胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自北京華美公司;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、羅丹明123購自北京索萊寶科技有限公司;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)凋亡檢測試劑購自美國BD公司。A549細胞購自北京協(xié)和細胞庫。

1.2主要儀器與設備 RE-2000旋轉蒸發(fā)儀購自上海亞榮生化儀器廠;CPS2超聲波粉碎機購自寧波新芝超聲有限公司;CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司;倒置熒光顯微鏡(IX71)購自日本Olympus公司;ELX900型酶標儀購自美國Bio-Tek公司;流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3RES-LIP的制備 采用薄膜旋轉蒸發(fā)-超聲法制備納米RES-LIP混懸液。膜材比按卵磷脂和膽固醇質量比=10∶1,藥脂比按RES與卵磷脂質量比=1∶40制備。用無水乙醇將其完全溶解后轉移至圓底燒瓶,45 ℃緩慢旋轉成膜。磷酸鹽緩沖液(PBS)水化洗膜得到RES-LIP混懸液,水浴超聲后避光透析,所得產(chǎn)物RES-LIP于電鏡拍照,于4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?3〕。

1.4細胞培養(yǎng)與分組 A549細胞培養(yǎng)采用RPMI1640培養(yǎng)基,含10% FBS、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài),待細胞生長至80%融合時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代。將細胞分為:對照組、LIP組、RES組和RES-LIP組。

1.5MTT法檢測細胞增殖活性 取對數(shù)生長期細胞,制成1×105/ml的細胞懸液接種于96孔板中,每組6個平行孔,每孔加100 μl細胞懸液。置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。第2天棄去完全培養(yǎng)基,加入用無血清的基本培養(yǎng)基稀釋的LIP、RES和RES-LIP 100 μl,終濃度均為0、5、10、20、40 μg/ml。培養(yǎng)24 h后,每孔加20 μl 5 mg/ml的MTT,再放入培養(yǎng)箱放置4 h,倒掉上清,向每個孔加入150 μl DMSO,震蕩10 min使其混合均勻,用酶標儀在490 nm波長處測定各孔光吸收值(OD值)。細胞增殖率以各處理組與對照組OD值之比的百分率表示。

1.6細胞形態(tài)學觀察 將對數(shù)生長期的A549細胞按1×105/ml濃度接種于24孔板中,每孔400 μl,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞生長融合率到80%時,棄去原液,分4組加藥:對照組、LIP組、RES組和RES-LIP組,其中RES組和RES-LIP組RES含量均為10 μg/ml,對照組是等體積的基本培養(yǎng)基,LIP組是等體積的LIP。常規(guī)培養(yǎng)24 h,用PBS洗滌,于倒置顯微鏡下觀察拍照。拍照之后加入4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min,棄固定液,用PBS洗3次,加入DAPI(5 μg/ml)避光孵育5 min。棄熒光染液,PBS洗3次,倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)變化。

1.7流式細胞術分析細胞凋亡 實驗采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡,流式細胞儀定量分析。取對數(shù)生長期細胞A549,將1×105/ml的細胞懸液接種于細胞瓶中,置于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。按上述1.4分組加藥處理細胞24 h,棄去原液,消化離心,分別用PBS和1 ml 1×緩沖液洗滌兩次后,加1×Annexin Ⅴ結合液400 μl并吹打細胞成懸浮液,其終濃度大約為1×106/ml,再向其加Annexin Ⅴ-FITC染色液5 μl,混勻后在避光室溫放置15 min,然后加PI染色液10 μl,避光孵育5 min,最后用流式細胞儀檢測。繪制直方圖并計算出早期和晚期細胞凋亡率。

1.8線粒體膜電位(MMP)檢測 取對數(shù)生長期細胞,制成1×105/ml的細胞懸液接種于細胞瓶中,置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。按1.4分組加藥處理細胞24 h。棄培養(yǎng)基,消化離心,PBS洗滌后,用0.5 ml的PBS重懸A549細胞,再加入10 μg/ml的羅丹明123染色液,常溫避光處理15 min后,用流式細胞儀檢測并計算MMP值。MMP = log(X-Mode)× 340。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1RES-LIP制備模式 采用薄膜旋蒸-超聲法,制備了粒徑約100 nm,包封率約為90%的RES-LIP,相關藥物粒徑、電位等表征參閱已發(fā)表的論文〔13〕。制備模式和電鏡如圖1所示。

圖1 RES-LIP制備模式(A)和電鏡(B,×120 000)

2.2RES-LIP對A549細胞增殖的影響 LIP組的細胞增殖活性與對照組相比,無統(tǒng)計學差異(P>0.05),說明采用天然大豆卵磷脂和膽固醇制備的LIP無毒性,不影響A549細胞的增殖活性。相反,RES和RES-LIP兩組結果顯示,A549細胞增殖活性隨著藥物濃度的增加而降低(P<0.05),其中20～40 μg/ml的RES和RES-LIP可極顯著抑制A549細胞增殖(P<0.01);與RES組相比,10～40 μg/ml的RES-LIP組均增加了對A549細胞的毒性,顯著抑制了細胞增殖(P<0.05)。見表1。

表1 LIP、RES及RES-LIP對A549細胞增殖的影響

細胞形態(tài)學觀察顯示,對照組與LIP組的A549細胞呈梭形或多邊形,排列緊密,形態(tài)飽滿,細胞核大。而RES組和RES-LIP組細胞增殖活性受到抑制,細胞數(shù)量明顯下降,細胞排布稀疏,部分細胞失去原有正常形態(tài),細胞輪廓模糊,變圓并脫落。RES-LIP組細胞發(fā)生上述形態(tài)變化比RES組更顯著。見圖2。

圖2 RES-LIP對A549細胞形態(tài)的影響(×40)

2.3RES-LIP對A549細胞凋亡的影響 對照組和LIP組細胞核形態(tài)正常,呈現(xiàn)圓形或者橢圓形,細胞核界限比較清晰,藍色熒光染色比較均勻。與對照組相比,RES組和RES-LIP組細胞核出現(xiàn)了不同程度的核固縮和碎裂,呈現(xiàn)出典型的凋亡細胞特點。RES-LIP組細胞的細胞核變化程度高于RES組。見圖3。

圖3 RES-LIP對A549細胞核形態(tài)的影響(DAPI染色,×40)

實驗進一步采用Annexin V-FITC/PI雙染的方法,用流式細胞儀定量分析了RES-LIP誘導A549細胞凋亡的情況。結果顯示,RES組和RES-LIP組早凋亡與晚凋亡的細胞比例明顯高于對照組(P<0.05),且RES組早凋亡與晚凋亡率明顯小于RES-LIP組(P<0.05)。見圖4、表2。

表2 LIP、RES及RES-LIP對A549細胞凋亡的影響

圖4 Annexin Ⅴ-FITC/PI 染色檢測A549細胞凋亡

2.4各組MMP比較 對照組MMP(910.60±8.91)和LIP組(903.98±10.91)無統(tǒng)計學差異(P>0.05);而RES組(581.15±7.26)和RES-LIP組MMP(562.03±6.76)較對照組明顯下降(P<0.01),且RES-LIP組MMP下降水平明顯大于RES組(P<0.05)。

3 討 論

作為天然生物活性的抗腫瘤藥物,RES提取方便,生物活性強,副作用小,但其溶解度較低,且易在體內(nèi)水解,從而降低其生物效能,限制了其在醫(yī)學上的應用〔14〕。近些年出現(xiàn)的藥物載體LIP具有良好的脂溶性、穩(wěn)定性高及緩釋性等優(yōu)點,提高了藥物生物利用率〔15～17〕。本研究結果采用天然大豆卵磷脂和膽固醇制備的脂質體,生物相容性更好,無毒性;同時制備了藥物包載率高且粒徑小的新型RES-LIP。RES對A549細胞的毒性作用主要表現(xiàn)在抑制細胞增殖,促進細胞凋亡,細胞增殖受抑制與凋亡直接體現(xiàn)在細胞數(shù)量和形態(tài)的改變。MTT細胞增殖和細胞形態(tài)學觀察結果提示,RES-LIP對A549細胞增殖抑制作用比RES組更顯著;DAPI熒光檢測和流式細胞分析凋亡情況提示,RES和RES-LIP可以誘導A549細胞凋亡,且 RES-LIP組比RES組凋亡更顯著。MMP的穩(wěn)定有助于維持線粒體的功能,進而維持細胞的生物活性〔18〕。MMP下降是細胞凋亡中最先發(fā)生的生物學事件,它標志著不可逆的進行性凋亡的開始〔19〕。本研究結果表明,RES-LIP可以通過線粒體途徑促進細胞凋亡。

長期以來被用于傳遞藥物,其基礎是LIP膜與細胞膜融合或LIP被細胞內(nèi)吞,然后將其內(nèi)容物釋放到細胞質中〔20,21〕。研究發(fā)現(xiàn),RES-LIP釋放完全所需時間為等量RES的13倍,證實了納米RES-LIP的緩釋性〔22〕。相比于游離的RES,相同時間內(nèi)RES-LIP由于載體緩慢釋放藥物,避免了細胞短期內(nèi)與大量RES 接觸,從而增強了RES的生物作用〔12〕。由于RES-LIP的胞吞作用吸收速度慢于游離藥物,由載體緩慢釋放藥物引起的細胞吸收速度慢,從而避免了細胞內(nèi)瞬時產(chǎn)生大量的濃度,最終起到了延緩藥物釋放,增加藥物的作用時間。