陳雪紅 吳子?xùn)| 莊海容 陳圣文

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院眼科,海南 ?？?570000)

糖尿病是一種慢性全身性疾病,其眼部并發(fā)癥,如白內(nèi)障,可導(dǎo)致嚴(yán)重的視力障礙〔1〕。在全球人群中,白內(nèi)障是導(dǎo)致失明的主要原因,與其他人群相比,糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)病率更高〔2〕。預(yù)計到2040年將有超過6億人患有糖尿病,并且由于糖尿病患者的壽命越來越長,患有糖尿病視網(wǎng)膜病變和視力障礙的人數(shù)預(yù)計將迅速增加〔3〕。糖尿病性白內(nèi)障(DC)是糖尿病最重要的并發(fā)癥之一,會導(dǎo)致嚴(yán)重的視力喪失;晶狀體上皮細胞(LEC)的病理改變是糖尿病患者發(fā)生DC的直接原因,當(dāng)人LEC暴露于高糖(HG)條件下,會發(fā)生凋亡和氧化應(yīng)激,參與DC的形成〔4〕;但具體機制尚不十分清楚。

非編碼RNA(ncRNA)在DC的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,ncRNA的異常表達可導(dǎo)致LEC發(fā)生細胞凋亡、焦亡及自噬異常,使晶狀體透明度下降,從而導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生〔5,6〕。共價閉合單鏈環(huán)狀RNA(circRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性RNA,通過海綿吸附微小RNA(miRNA)參與各類疾病的病理過程。KMT2E,又稱MLL5,是影響糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)血管單元損傷的調(diào)節(jié)基因之一〔7〕。研究顯示,環(huán)狀RNA KMT2E(circ KMT2E)在DC晶狀體中上調(diào),miR-204-5p在DC中呈低表達,circ KMT2E可能作為miR-204-5p的海綿分子參與DC的發(fā)病,為DC的非手術(shù)治療提供新的靶點〔8〕。但是,circ KMT2E對DC發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機制尚有待闡明,其是否參與LEC的凋亡仍不清楚?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9在DC的LEC中表達增加,并在DC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔9〕;而且MMP9和miR-204-5p之間存在結(jié)合位點,miR-204-5p可直接靶向MMP9基因,調(diào)節(jié)人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的增殖和侵襲〔10,11〕。本研究探討HG條件下人LEC中circ KMT2E和miR-204-5p的表達及其對LEC凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人晶狀體上皮細胞系(HLE-B3)購自美國ATCC,細胞在含有10%胎牛血清和1%抗生素(青霉素G 100 U/ml,鏈霉素100 μg/ml)的低葡萄糖DMEM培養(yǎng)基中在37 ℃,5% CO2的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)的HLE-B3細胞在達到80%～90%匯合時進行傳代。使用2～5代的細胞進行實驗。

胎牛血清、低糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gbico公司;葡萄糖粉(G8150)購自北京Solarbio公司;Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑(L3037)購自Sigma-Aldrich;用于KMT2E敲低的siRNA(si-KMT2E)及其陰性對照、circ KMT2E過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-KMT2E)及其陰性對照、miR-204-5p mimic及其陰性對照(miR-NC)、實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)引物均由RiboBio(中國廣州)合成;TRIzol試劑(RR420A)、逆轉(zhuǎn)錄(PrimeScript RT)試劑盒(RR037A)、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(RR390A)購自日本TaKaRa公司;RIPA裂解液(P0013B)、CCK-8(C0038)和二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(P0010)購自碧云天生物科技公司;兔源一抗MMP9(ab283575)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2(ab194583)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax,ab32503)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase)-3(ab2302)、GAPDH(ab128915)、山羊抗兔IgG H&L辣根過氧化物酶(HRP,ab205718)購自英國abcam公司。

細胞培養(yǎng)箱、NanoDrop ND-2000分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司);iMark680多功能酶標(biāo)儀、FACSCanto Ⅱ流式細胞儀(美國Bio-Rad公司);ABI Prism?7300型熒光定量PCR系統(tǒng)(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);BX61電動顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2實驗方法

1.2.1臨床樣本采集 收集自2018年12月至2020年11月在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院眼科中心進行白內(nèi)障手術(shù)的33例非DC患者(男18例,女15例;年齡52～60歲)和33例DC患者(男16例,女17例;年齡45～56歲)的晶狀體前囊膜。本研究遵循修訂后的赫爾辛基宣言原則,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。在獲得患者知情同意的情況下收集所有樣品。患者都接受了完整的術(shù)前眼科檢查,晶狀體前囊膜樣本通過完整的連續(xù)曲線撕囊術(shù)獲得,沒有血管接觸或虹膜或其他眼內(nèi)結(jié)構(gòu)的損傷。非DC患者作為對照組,有糖尿病但無增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者作為DC組。DC組均為2型糖尿病,根據(jù)晶狀體混濁分類系統(tǒng)Ⅲ,患者均Ⅲ級皮質(zhì)性白內(nèi)障。接受眼科手術(shù)或非糖尿病性視網(wǎng)膜病變的眼部疾病患者被排除在研究之外。

1.2.2LEC凋亡檢測 將部分晶狀體前囊膜置于4 ℃、4%多聚甲醛溶液中固定12 h,常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切片備用。然后按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作,光學(xué)顯微鏡下觀察LEC凋亡情況(凋亡細胞呈棕黃色)并拍照。

1.2.3RT-qPCR檢測晶狀體前囊膜中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表達水平 取部分晶狀體前囊膜,使用TRIzol試劑提取總RNA,分光光度計檢查RNA濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行RT-qPCR。RT-qPCR使用以下熱循環(huán)條件:95 ℃初始變性3 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s和72 ℃ 1 min的40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達水平,用內(nèi)部參考基因GAPDH或U6進行標(biāo)準(zhǔn)化。引物序列:circ KMT2E正向:5′-TCAGAGGAGCAGATTGCAGA-3′,反向:5′-CGCATAGG-GCAAACCAAT-3′;miR-204-5p正向:5′-ACACTCCAGCTGGGTTCCCTTGTCATCCTAT-3′,反向:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;MMP-9正向:5′-AGACCTGGGGCAGATTCCAAAC-3′,反向:5′-CGGCAAG-TCTTCCGAGTAGT-3′;U6正向:5′-GCTTC-GGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反向:5′-CGCTTCACGAA-TTTGCGTGTCAT-3′;GAPDH正向:5′-CTTTGGTAT-CGTGGAAGGACTC-3′,反向:5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′。

1.2.4高糖濃度及作用時間的篩選 取生長狀態(tài)良好的HLE-B3細胞,棄去培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后,胰酶消化離心,用含10%胎牛血清的低糖培養(yǎng)基(5 mmol/L)重懸,然后進行細胞計數(shù)。以1×103個細胞/孔的密度接種于96孔板中,放入37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),24 h后,加入不同葡萄糖濃度(終濃度為25、50、100、200 mmol/L)的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48 h后,每孔加入10 μl CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測各孔光密度(OD)值。OD值越大,表示細胞活力越強。

1.2.5細胞分組與轉(zhuǎn)染 取生長狀態(tài)良好的HLE-B3細胞,接種于24孔板中(2×106個細胞/孔),培養(yǎng)24 h待細胞融合到80%時,進行轉(zhuǎn)染。實驗分為8組:對照組(正常葡萄糖5 mmol/L處理24 h,不進行轉(zhuǎn)染)、HG組(高濃度葡萄糖200 mmol/L處理24 h,不進行轉(zhuǎn)染)、沉默對照組(轉(zhuǎn)染si-KMT2E陰性對照)、KMT2E沉默組(轉(zhuǎn)染si-KMT2E)、過表達對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KMT2E陰性對照空載體質(zhì)粒)、KMT2E過表達組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KMT2E質(zhì)粒)、KMT2E過表達+miR-NC組(pcDNA3.1-KMT2E質(zhì)粒和miR-204-5p mimic陰性對照miR-NC共轉(zhuǎn)染HLE-B3細胞)、KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組(pcDNA3.1-KMT2E質(zhì)粒和miR-204-5p mimic共轉(zhuǎn)染HLE-B3細胞),轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine3000試劑說明進行。轉(zhuǎn)染后將HLE-B3細胞用含高濃度葡萄糖200 mmol/L的培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞,RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表達水平,驗證轉(zhuǎn)染效果,檢測步驟同1.2.3。

1.2.6CCK-8法檢測細胞活力 HLE-B3細胞按照1.2.5中步驟處理,高濃度葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μl CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測各孔OD值。

1.2.7流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 HLE-B3細胞按照1.2.5中步驟處理,高濃度葡萄糖培養(yǎng)基處理24 h后,胰蛋白酶收集細胞,PBS洗滌后懸浮在結(jié)合緩沖液中。然后,將細胞(5×105個細胞)與5 μl 膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μl碘化丙啶(PI)一起在室溫下避光孵育15 min。使用流式細胞儀鑒定和分析凋亡細胞的百分比(凋亡率)。

1.2.8Western印跡檢測細胞中MMP9、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達 HLE-B3細胞按照1.2.5中步驟處理后,使用RIPA緩沖液提取細胞蛋白質(zhì)。BCA試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度,取等量的蛋白質(zhì)進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。隨后,將PVDF膜在室溫下用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,與MMP9、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、GAPDH一抗(1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。然后,將PVDF膜在TBST中洗滌并與HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h。增強型化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)顯色,觀察這些膜中的蛋白質(zhì)。蛋白條帶的灰度值由ImageJ軟件確定,以GAPDH為內(nèi)參,通過與內(nèi)參的灰度比,得出目的條帶的相對表達水平。

1.2.9雙熒光素酶報告基因檢測 Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)預(yù)測miR-204-5p和circ KMT2E的潛在靶序列。將KMT2E的野生型(WT)或突變型(MUT)3′-非翻譯區(qū)插入包含海腎熒光素酶的pmirGLO載體中以構(gòu)建KMT2E-WT或KMT2E-MUT質(zhì)粒。然后將HLE-B3細胞(1×105個細胞/孔)接種到24孔板中,分為miR-NC組和miR-204-5p mimic組,使用Lipofectamine3000將KMT2E-WT、KMT2E-MUT分別與miR-NC、miR-204-5p mimic共轉(zhuǎn)染到HLE-B3細胞,在37 ℃下孵育48 h后,使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性;海腎熒光素酶活性用作標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗進行3次。采用SPSS20.0和GraphPad Prism8.0軟件進行t檢驗,方差分析,組間有差異進一步采用SNK-q檢驗進行兩兩比較。采用Pearson法分析DC患者晶狀體前囊膜中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9表達水平的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1晶狀體前囊膜中LEC凋亡率 與對照組〔(21.40±2.73)%〕相比,DC組晶狀體前囊膜中LEC凋亡率〔(35.02±3.68)%〕顯著升高(t=17.076,P<0.01),見圖1。

圖1 兩組晶狀體前囊膜(TUNEL染色,×200)

2.2晶狀體前囊膜中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表達水平 與對照組相比,DC組晶狀體前囊膜中circ KMT2E、MMP9 mRNA表達水平顯著升高,miR-204-5p水平顯著降低(均P<0.01),見表1。

表1 兩組晶狀體前囊膜中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表達

2.3DC組晶狀體前囊膜中circ KMT2E與miR-204-5p、MMP9 mRNA表達量的相關(guān)性 DC組晶狀體前囊膜中circ KMT2E與miR-204-5p表達呈負相關(guān)(r=-0.874,P<0.01),miR-204-5p與MMP9 mRNA呈負相關(guān)(r=-0.963,P<0.01),circ KMT2E與MMP9 mRNA表達呈正相關(guān)(r=0.842,P<0.01)。

2.4最佳高糖濃度及作用時間 與低糖組相比,25、50、100、200 mmol/L濃度的葡萄糖作用于HLE-B3細胞后,在200 mmol/L作用24、48 h可顯著抑制HLE-B3細胞活力(P<0.05),見表2;因此,選擇200 mmol/L葡萄糖作用24 h為造模條件進行后續(xù)實驗。

表2 不同濃度葡萄糖對HLE-B3細胞活力的影響

2.5轉(zhuǎn)染后各組細胞中circ KMT2E、miR-204-5p、MMP9 mRNA和蛋白表達水平 與對照組相比,HG組circ KMT2E、MMP9 mRNA和蛋白表達水平顯著升高,miR-204-5p水平顯著降低(P<0.05);與HG組相比,KMT2E沉默組circ KMT2E、MMP9 mRNA和蛋白表達水平顯著降低,miR-204-5p水平顯著升高(P<0.05),KMT2E過表達組、KMT2E過表達+miR-NC組、KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組circ KMT2E、MMP9 mRNA和蛋白表達水平顯著升高,miR-204-5p水平顯著降低(P<0.05);與KMT2E過表達組相比,KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組MMP9 mRNA和蛋白表達水平顯著降低,miR-204-5p水平顯著升高(P<0.05),見圖2、表3。

表3 各組HLE-B3細胞中circ KMT2E、miR-204-5p、MMP9 mRNA和蛋白表達比較

1～8:對照組、HG組、沉默對照組、KMT2E沉默組、過表達對照組、KMT2E過表達組、KMT2E過表達+miR-NC組、KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組;圖4同圖2 各組HLE-B3細胞中MMP9蛋白表達

2.6各組細胞活力與凋亡率 與對照組相比,HG組細胞活力顯著降低,細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與HG組相比,KMT2E沉默組細胞活力顯著升高,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),KMT2E過表達組、KMT2E過表達+miR-NC組、KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組細胞活力顯著降低,細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與KMT2E過表達組相比,KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組細胞活力顯著升高,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見圖3、表4。

表4 各組HLE-B3細胞活力、凋亡率、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達比較

圖3 各組HLE-B3細胞凋亡率

2.7各組細胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達 與對照組相比,HG組Bcl-2表達顯著降低,Bax、Cleaved Caspase-3表達顯著升高(P<0.05);與HG組相比,KMT2E沉默組Bcl-2表達顯著升高,Bax、Cleaved Caspase-3表達顯著降低(P<0.05),KMT2E過表達組、KMT2E過表達+miR-NC組、KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組Bcl-2表達顯著降低,Bax、Cleaved Caspase-3表達顯著升高(P<0.05);與KMT2E過表達組相比,KMT2E過表達+miR-204-5p模擬物組Bcl-2表達顯著升高,Bax、Cleaved Caspase-3表達顯著降低(P<0.05),見表4、圖4。

圖4 各組Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達

2.8雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果 Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析結(jié)果顯示miR-204-5p包含circ KMT2E的結(jié)合序列,見圖5。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后,與miR-NC組相比,miR-204-5p mimic組KMT2E-WT細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01),KMT2E-MUT細胞的熒光素酶活性未受影響(P>0.05),見表5。

表5 兩組細胞中熒光素酶活性

圖5 miR-204-5p與circ KMT2E的結(jié)合序列預(yù)測

3 討 論

白內(nèi)障或晶狀體混濁是世界上導(dǎo)致失明的主要原因。年齡和糖尿病是主要的危險因素,隨著老齡化和糖尿病人口的增加,白內(nèi)障的負擔(dān)將會增加。白內(nèi)障手術(shù)是恢復(fù)視力的有效方法;然而,相比于非DC患者,DC患者術(shù)后視力改善效果較差,術(shù)后滲漏發(fā)生率及黃斑中心厚度增加更明顯〔12〕。因此,需要探索創(chuàng)新的治療靶點。

近年來,ncRNA在DC形成機制中的研究越來越受到關(guān)注。miRNA是小的ncRNA,它通過轉(zhuǎn)錄后抑制翻譯來調(diào)節(jié)目標(biāo)mRNA的表達。研究表明,miRNA可能通過調(diào)節(jié)眾多基因的表達而直接或間接參與多種疾病。已知LEC凋亡是DC的主要發(fā)病因素,MMP是一種分解LEC細胞外基質(zhì)的酶。MMP-9的高表達與DC相關(guān),并且抑制LEC中的MMP-9是預(yù)防白內(nèi)障的潛在治療策略〔9,13,14〕。據(jù)報道,miR-204-5p與白內(nèi)障的發(fā)病機制有關(guān),可調(diào)節(jié)白內(nèi)障氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達〔15〕;也有報道稱miR-204-5p與糖尿病性角膜病變有關(guān)〔16〕;更重要的是,miR-204-5p可靶向調(diào)節(jié)MMP9的表達〔10,11〕。Fan等〔8〕對人DC晶狀體組織中miRNA的表達譜進行了研究,發(fā)現(xiàn)miR-204-5p是前五位下調(diào)的miRNA之一。本研究結(jié)果表明,miR-204-5p低表達可能與LEC凋亡相關(guān)。

circRNA 3′端和5′端共價連接成環(huán)狀,形成了一類最近被鑒定為在生物系統(tǒng)中廣泛且豐富的RNA。circRNA可以作為miRNA的海綿來減輕miRNA對其靶mRNA的抑制,從而參與各種疾病的病因和進展。據(jù)報道,在人類晶狀體組織中,circHIPK3沉默可上調(diào)miR-193a的表達,然后通過circHIPK3/miR-193a/CRYAA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)增加人LEC的凋亡〔17〕。KMT2E是編碼賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(KMT)2家族的一個成員,該酶家族在調(diào)節(jié)組蛋白3賴氨酸(H3K)4翻譯后的甲基化中起著至關(guān)重要的作用〔18〕,而H3K4甲基化程度與白內(nèi)障〔19〕和糖尿病〔20〕的發(fā)生發(fā)展均顯著相關(guān)。有研究對人DC晶狀體組織中與miR-204-5p相關(guān)的差異表達circRNA進行篩選,發(fā)現(xiàn)來源于親本轉(zhuǎn)錄本KMT2E〔染色體7(q22.3)〕外顯子4～15的circ KMT2E在DC組織中顯著上調(diào),表現(xiàn)出與miR-204-5p相反的表達趨勢。此外,生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)circ KMT2E含有四個匹配序列以結(jié)合miR-204-5p〔8〕。表明circ KMT2E可能是DC的潛在調(diào)節(jié)因子,且miR-204-5p結(jié)合circ KMT2E的改變可能與DC的發(fā)病機制密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示,circ KMT2E的沉默可抑制LEC凋亡,并且circ KMT2E可能與MMP9存在某種關(guān)聯(lián)。

本研究中雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-204-5p mimic進入HLE-B3細胞時,KMT2E-WT的熒光素酶活性被顯著抑制。本研究結(jié)果表明,circ KMT2E可靶向調(diào)控miR-204-5p表達?；谏鲜鲎C據(jù),可以得出結(jié)論,沉默circ KMT2E可通過上調(diào)miR-204-5p,抑制MMP9的表達來減少LEC的凋亡。

綜上,沉默circ KMT2E可能通過靶向上調(diào)miR-204-5p,進而抑制MMP9表達,減少HG誘導(dǎo)的人LEC凋亡。本研究存在一定不足,首先,未對miR-204-5p/MMP9軸進行干預(yù)來進一步驗證circ KMT2E的作用機制;其次,circ KMT2E是否能調(diào)控其他miRNA、基因或通路參與DC中的LEC凋亡,有待進一步研究;最后,circ KMT2E在體內(nèi)是否能發(fā)揮相同作用需要使用動物模型來證實。