余云湖 熊嚴(yán)全 周航 楊開華 王波

(遵義市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科,貴州 遵義 563000)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡稱膠質(zhì)瘤,占據(jù)顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率的40.39%,屬于常見的中樞系統(tǒng)疾病〔1〕。研究表示,本病發(fā)病主體為男性,病灶位于大腦半球,根據(jù)病理類型出現(xiàn)癥狀及病程時(shí)間也具有差異〔2〕。膠質(zhì)瘤患者由于顱內(nèi)壓力升高壓迫神經(jīng)導(dǎo)致胃腸道反應(yīng)、視力迷糊及其他精神疾病。目前,外科手術(shù)及放化療對于膠質(zhì)瘤療效有所提高,但是也存在局限性,因?yàn)槟z質(zhì)瘤細(xì)胞生物活性廣泛,具有過度繁殖強(qiáng)烈侵襲性的特點(diǎn),因此,了解膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物機(jī)制對于尋找合適的治療方式具有重要作用。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLRs)家族是存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的受體,能夠參加免疫應(yīng)答和抗炎機(jī)制〔3〕。NLRP6是NLRs家族成員之一,最早在大腸炎中被發(fā)現(xiàn)。文獻(xiàn)表示,在潰瘍性結(jié)腸炎患者中采用活血藥物能夠減少NLRP6水平,改善疾病〔4〕。但是,結(jié)腸炎大鼠體外實(shí)驗(yàn)表示,敲除NLRP6能夠增加結(jié)腸炎腫瘤易感性,提示NLRP6是預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生的關(guān)鍵因子〔5〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1生物活性廣泛,可促進(jìn)膀胱、肝臟等癌變,發(fā)揮免疫抑制作用。Smad信號是TGF-β1主要效應(yīng)因子,是其功能運(yùn)轉(zhuǎn)的主要因子〔6〕。本文通過觀察NLRP6對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物活性及對TGF-β1/Smad蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑與儀器 膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U251(中國上海通蔚生物);羊抗鼠NLRP6、鼠抗人轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、兔抗人Smad抗體(中國武漢愛博泰克);RPMI1640 培養(yǎng)基(中國北京寶日醫(yī)生物);Transwell 小室(美國BD 公司),四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO,美國Sigma公司)。

1.2U251細(xì)胞培養(yǎng) 將低溫冷藏的U251細(xì)胞,快速移入37 ℃水中溶解,離心后,離棄上清液,加入培養(yǎng)基,5%CO2常溫保存,貼壁生長,生長到90%時(shí)消化,消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng),取對數(shù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3慢病毒包裝質(zhì)粒感染U251細(xì)胞和分組 慢病毒包裝質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P公司完成,分為正常組(U251細(xì)胞)、NC組(U251細(xì)胞+NC-空轉(zhuǎn)),干預(yù)組(U251細(xì)胞+NLRP6-shRNA);取對數(shù)生長的U251細(xì)胞,接種到6個(gè)復(fù)孔,生長融合達(dá)到60%,分別加入NC-shRNA和NLRP6-shRNA,混合后繼續(xù)培養(yǎng)生長至80%時(shí),收集培養(yǎng)。

1.4MTT法檢測U251細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后將各組U251細(xì)胞,數(shù)目為5×103/ml的細(xì)胞接種到96板中,轉(zhuǎn)染24、48、72 h后,加入20 g MTT液,培養(yǎng)4 h,加入150 μl DMSO,振蕩,采用酶標(biāo)儀檢測 490 nm 波長處的吸光值(A),觀察U251細(xì)胞增殖情況,描繪生長曲線。

1.5Transwell小室法檢測U251細(xì)胞侵襲能力 采用基質(zhì)膠無血清培養(yǎng)稀釋鋪于Transwell小室上室,2 h后,取各組培養(yǎng)24 h后的U251 細(xì)胞(數(shù)目為1×106/ml)加入含有基質(zhì)膠的Transwell小室上室,下室加入完全培養(yǎng)基,孵育24 h后,保留Transwell小室液體,4%多聚甲醛固定30 min,1%結(jié)晶紫染色10～20 min,樹膠封片,顯微鏡下觀察穿過底膜的細(xì)胞數(shù)即為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.6流式細(xì)胞儀檢測OVCAR-3凋亡率 將細(xì)胞數(shù)目為5×103的細(xì)胞接種到96孔板中,培養(yǎng)24 h后,加入少量胰蛋白酶,消化4 h后,在-20 ℃冷藏條件下用醫(yī)用酒精固定,24 h后進(jìn)行離心,棄去上清液,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,每次3 min,避光染色,流式細(xì)胞儀檢測U251細(xì)胞凋亡率。

1.7Western印跡檢測TGF-β1/Smad蛋白水平 將對數(shù)生長U251細(xì)胞數(shù)目為5×103的細(xì)胞,低溫離心0.5 h。用PIERCE試劑盒檢測總蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后,用TGF-β1、Smad4抗體和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體進(jìn)行低溫24 h一抗孵育,洗滌后再用二抗孵育處理1 h,冷卻后計(jì)算Livin抗體的蛋白表達(dá),用 Nuance分析軟件,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影曝光,拍照保存。

1.8qRT-PCR檢測TGF-β1/Smad mRNA 將對數(shù)生長U251細(xì)胞數(shù)目為5×103的細(xì)胞,沖洗后放于無菌試管管中,加入TGF-β1、Smad4提取RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA,將β-ation載體為內(nèi)參進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,PCR條件:98 ℃ 6 min,98 ℃ 28 s,75 ℃ 30 s,80 ℃ 4 min,總計(jì)55個(gè)循環(huán),引物序列為:TGF-β1正向引物:5′-GAGAGCCCTGGATACCAACATCT-G-3′,反向:5′-GTGTGTCCAGGCTCCAAATGTAG-3′;Smad4正向引物:5′-CCTGATGCTTCACTGTTCTGCAA-3′,反義:5′-CACATGCACGGTTTCCGTTATTC-3′;β-actin正向引物:5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′,反向:5′-GTCACGCACGATTTCCGCT-3′。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1沉默NLRP6對U251細(xì)胞增殖的影響 正常組、NC組及干預(yù)組U251細(xì)胞增殖吸光度(OD)值在24 h時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。48、72 h干預(yù)組U251細(xì)胞增殖OD值明顯低于NC組及干預(yù)組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時(shí)間細(xì)胞活性比較

2.2沉默NLRP6對U251細(xì)胞侵襲能力的影響 與正常組比較,NC組及干預(yù)組U251細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著降低(P<0.05);與NC組比較,干預(yù)組U251細(xì)胞侵襲數(shù)目水平顯著降低(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組U251細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

表2 各組U251細(xì)胞侵襲數(shù)目、細(xì)胞凋亡率、TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白水平比較

2.3沉默NLRP6對U251細(xì)胞凋亡率影響 與正常組比較,NC組及干預(yù)組凋亡率顯著升高(均P<0.05);與NC組比較,干預(yù)組凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 各組U251細(xì)胞凋亡

2.4Western印跡檢測各組U251細(xì)胞TGF-β1/Smad蛋白水平 與正常組比較,NC組及干預(yù)組TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著降低,Smad4蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05);與NC組比較,干預(yù)組TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著降低,Smad4蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。見表2、圖3。

圖3 Western印跡檢測各組U251細(xì)胞TGF-β1/Smad4蛋白水平

2.5PCR檢測各組U251細(xì)胞TGF-β1/Smad mRNA水平 與正常組比較,NC組及干預(yù)組TGF-β1 mRNA水平顯著降低,Smad4 mRNA水平顯著升高(均P<0.05);與NC組比較,干預(yù)組TGF-β1 mRNA水平顯著降低,Smad4 mRNA水平顯著升高(均P<0.05)。見表2。

3 討 論

膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的生物活性,包含強(qiáng)侵襲和強(qiáng)增殖作用。由于特殊的生物活性,導(dǎo)致在顱內(nèi)腫瘤中有極高的發(fā)病率〔7〕。根據(jù)大數(shù)據(jù)顯示,我國每十萬顱內(nèi)腫瘤患者有七成確診為膠質(zhì)瘤,嚴(yán)重危害患者神經(jīng)功能及生存質(zhì)量〔8〕。膠質(zhì)瘤組織與旁癌組織分界不明顯,可誘導(dǎo)正常腦組織水腫,外科不能完全切除病灶。放化療及化學(xué)藥物因旁癌組織耐受性較低及疏導(dǎo)血腦屏障,具有易復(fù)發(fā)和預(yù)后差的特點(diǎn)〔9〕。因此,了解膠質(zhì)瘤細(xì)胞特性,尋找新的靶點(diǎn)來延緩病情尤為重要。

細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲是膠質(zhì)瘤細(xì)胞最顯著的生物學(xué)特征,屬于腫瘤細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展及凋亡過程中必不可少的途徑。U251細(xì)胞繁殖和侵襲能力強(qiáng),是膠質(zhì)瘤產(chǎn)生及發(fā)展的重要因素。目前,治療膠質(zhì)瘤主要方法包含免疫治療和基因治療〔10〕。免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗外來病原體的首要防線,NLR是近些年研究熱點(diǎn),其主要發(fā)揮免疫應(yīng)答作用,有多個(gè)家族成員,例如NLRP3、NLRP4等〔11〕,NLRP6作為其成員之一,收到信號刺激后,能夠與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域(PYD)相互作用,形成NLRP6炎癥體。以往研究文獻(xiàn)表示,NLRP6活性與細(xì)胞凋亡途徑密切相關(guān),能夠活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1,促進(jìn)炎性標(biāo)志物白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18水平升高及腫瘤細(xì)胞活性,加速其增殖和侵襲〔12〕。研究表明,NLR能夠調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性,NLRP6是一種天然的免疫信號通路,與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后及治療存在相關(guān)性〔13〕。樊明德等〔14〕研究表明,在膠質(zhì)瘤組織中NLRP3水平會隨著膠質(zhì)瘤惡性病變程度的升高而增加。陳良榮等〔15〕研究表示,抑制NLRP6水平有利于癌細(xì)胞生物活性降低,改善病情。但是關(guān)于NLRP6在膠質(zhì)瘤中具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。本研究說明,敲除NLRP6能夠降低癌細(xì)胞生物活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

TGF-β是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的超β家族,從細(xì)胞質(zhì)到核需要介導(dǎo)Smad信號完成,研究表明,TGF-β水平升高往往與自身免疫、癌變相關(guān)。TGF-β1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有加快增殖和繁殖作用,主要是通過增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞交互作用,減少免疫抑制,增加血管生成。董程遠(yuǎn)等〔16〕研究表明,TGF-β1具有減少機(jī)體免疫監(jiān)視,加快膠質(zhì)瘤抗原作用,促進(jìn)細(xì)胞增殖和惡性侵襲。文獻(xiàn)表明,TGF-β1在膠質(zhì)瘤研究中結(jié)果較復(fù)雜,其水平表達(dá)與膠質(zhì)瘤病情嚴(yán)重性有不同的報(bào)道〔17〕。Smad4是惡性腫瘤抑制物,通過TGF-β家族發(fā)揮不同作用。Smad4作為抑癌基因,在多種癌組織中均有表達(dá)〔18〕。陳彩霞等〔19〕研究表明,膠質(zhì)瘤組織中Smad4蛋白水平降低,在良性膠質(zhì)瘤組織中升高,隨著膠質(zhì)瘤病變程度而表達(dá)差異。文獻(xiàn)表示在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和髓母細(xì)胞瘤中Smad4表達(dá)較低,在旁癌細(xì)胞中水平升高〔20〕。NLR能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中Smad活性,NLRP5能夠減少Smad2、3水平,NLRP3能夠抑制Smad4水平,根據(jù)NLR家族下游因子不同而對Smad有不同生物作用〔21〕。本研究說明,干擾NLRP6降低U251細(xì)胞活性和侵襲,可能與抑制TGF-β1表達(dá),激活Smad4水平相關(guān)。目前,關(guān)于NLRP6對Smad作用研究機(jī)制還不明確,其具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。