林海容 許永劼 陳鋼 許雯 黃昶煜東 韋思佳 楊婷婷 李興 潘衛(wèi),3

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心,貴州 貴陽 550004;2醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院;3公共衛(wèi)生學(xué)院;4貴州中醫(yī)藥大學(xué))

糖尿病腦病(DE)是糖尿病導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)功能障礙和認(rèn)知下降的一種嚴(yán)重并發(fā)癥〔1〕,臨床上主要表現(xiàn)為注意力下降、學(xué)習(xí)記憶能力減退和認(rèn)知功能障礙等〔2〕,嚴(yán)重認(rèn)知障礙的糖尿病患者將發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)癡呆〔3〕。DE的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,包括胰島素抵抗與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損、炎癥與線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等。有研究發(fā)現(xiàn),海馬神經(jīng)元凋亡會(huì)導(dǎo)致衰老大鼠的學(xué)習(xí)和記憶障礙〔4〕。此外,越來越多的證據(jù)表明,糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致記憶障礙。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)高糖能誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。

DE認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制等方面已被廣泛研究,但仍然不夠完善,防治仍有欠缺〔5,6〕,而動(dòng)物模型是DE臨床與基礎(chǔ)研究工作中必不可少的工具〔7〕。已有研究通過采用自發(fā)性Ⅱ型糖尿病小鼠建立DE模型、鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)SD大鼠建立Ⅰ型DE模型、高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)Ⅱ型DE模型等〔8～10〕,研究DE的發(fā)病機(jī)制,但是單純選用Ⅰ型或Ⅱ型DE模型進(jìn)行研究,并不能夠完全模擬人類DE發(fā)生發(fā)展過程。因此,本實(shí)驗(yàn)選用STZ誘導(dǎo)SD大鼠構(gòu)建Ⅰ型DE模型和db/db小鼠構(gòu)建Ⅱ型DE進(jìn)行聯(lián)合分析,以期了解兩種腦病模型的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)及缺點(diǎn),為今后研究DE選擇動(dòng)物模型提供參考。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供體質(zhì)量180～220 g 的健康清潔級(jí)雄性SD大鼠〔SCXK(黔)2014-0010〕用于Ⅰ型DE模型;購自南京君科生物工程有限公司,8～9周齡,體質(zhì)量38～41 g 的雄性健康清潔級(jí)db/db小鼠和體質(zhì)量18～22 g的雄性健康清潔級(jí)db/m小鼠[SCXK(蘇) 2016-0010]用于Ⅱ型DE模型。動(dòng)物被安置在溫度22～25 ℃,濕度50%～60%的房間內(nèi),12 h的光照周期中隨時(shí)使用食物和水。在實(shí)驗(yàn)期間,通過貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(IACUC-2017-006)。實(shí)驗(yàn)中,嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)愛和使用指南》給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司;0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液購自索萊寶公司;血糖儀及試紙條購自美國強(qiáng)生公司;JA2003N型電子天平購自上海菁海儀器有限公司;Morris 水迷宮購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;SMART 3.0小動(dòng)物行為學(xué)記錄分析系統(tǒng)購自西班牙Panlab;透射電子顯微鏡購自日本HITACHI HT7700;酶標(biāo)分析儀購自Rayto RT-6100;Western印跡電泳儀購自美國Bio-Rad公司;冷凍離心機(jī)購自美國Beckman公司;搖床購自江蘇其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3動(dòng)物模型

1.3.1Ⅰ型DE模型的復(fù)制 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,用Morris水迷宮檢測(cè)認(rèn)知功能,挑選10只正常的大鼠為Ⅰ型對(duì)照組、10只為Ⅰ型DE組。實(shí)驗(yàn)開始前,大鼠被禁止食物12 h,Ⅰ型DE組根據(jù)體質(zhì)量給予50 mg/kg STZ進(jìn)行腹腔注射,對(duì)照組每只大鼠給予等劑量0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行腹腔注射,并從注射后開始,于3 d、1 w、3 w三次取尾靜脈血檢測(cè)隨機(jī)血糖,隨機(jī)血糖值連續(xù)3 w均≥16.7 mmol/L,達(dá)到DE大鼠模型復(fù)制成功標(biāo)準(zhǔn),視為DE模型復(fù)制成功,后繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠模型2個(gè)月。

1.3.2Ⅱ型DE模型的建立 適應(yīng)性飼養(yǎng)小鼠7 d后,測(cè)隨機(jī)血糖,運(yùn)用Morris水迷宮檢測(cè)認(rèn)知功能,挑選10只正常db/m小鼠為Ⅱ型對(duì)照組、10只db/db小鼠為Ⅱ型DE組,繼續(xù)飼養(yǎng)16 w。

1.3.3體質(zhì)量及隨機(jī)血糖的測(cè)定 Ⅰ型DE組在實(shí)驗(yàn)開始前、造模后72 h、1、3、8、12 w時(shí)檢測(cè)體質(zhì)量,尾靜脈取血測(cè)隨機(jī)血糖;Ⅱ型DE組在實(shí)驗(yàn)開始第1、5、9、13、17周時(shí)檢測(cè)體質(zhì)量,尾靜脈取血測(cè)隨機(jī)血糖。

1.4行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮由一個(gè)恒溫水池和一個(gè)站臺(tái)組成。其中,水池形狀為圓柱形,直徑160 cm(大鼠)、80 cm(小鼠),高50 cm,內(nèi)壁涂成黑色;可移動(dòng)站臺(tái)直徑12 cm。實(shí)驗(yàn)開始前,向水池放入清水,以水位高25 cm為宜,db小鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)需加入奶粉使池水變?yōu)槿榘咨?水池水位高出站臺(tái)0.5 cm,在水池內(nèi)壁上做好標(biāo)記,即每次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的入水點(diǎn)。動(dòng)物在水迷宮中接受了為期4 d的訓(xùn)練,每天進(jìn)行4個(gè)60 s的實(shí)驗(yàn),如果60 s內(nèi)沒有找到站臺(tái),則被引導(dǎo)到站臺(tái)上,并被允許在站臺(tái)上休息15 s。每1 d的起點(diǎn)順序在不同動(dòng)物之間是一致的,但1 d之間的順序不同。在最后一次訓(xùn)練后約1 h進(jìn)行,結(jié)束后1 h,將站臺(tái)移走,將動(dòng)物從新入水點(diǎn)放入水池里,實(shí)驗(yàn)長度為60 s,測(cè)量游泳軌跡、找到站臺(tái)的時(shí)間和游泳速度,對(duì)每只動(dòng)物4個(gè)象限的日均測(cè)量值進(jìn)行平均化。

1.4.2Y迷宮實(shí)驗(yàn) Y迷宮共3個(gè)臂,各臂夾角為120 °,每一臂尺寸為300 mm×80 mm×150 mm(小鼠)、425 mm×145 mm×225 mm(大鼠),內(nèi)壁為黑色,在中央處各有一個(gè)可移動(dòng)隔板。使用SMART 3.0系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集分析。每只動(dòng)物在一個(gè)面向迷宮中心的臂末端放置,允許其在迷宮內(nèi)自由活動(dòng)5 min,記錄動(dòng)物進(jìn)入的臂總數(shù)和順序。

1.4.3曠場實(shí)驗(yàn) 大鼠曠場反應(yīng)箱高30 cm,邊長100 cm,小鼠曠場反應(yīng)箱高25 cm,邊長50 cm,內(nèi)壁涂黑,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入反應(yīng)箱中央?yún)^(qū),允許自由活動(dòng)5 min,記錄進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)、后肢站立次數(shù)和運(yùn)動(dòng)距離。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)變化 將分離后的海馬迅速置于裝有甲醛溶液的管子中固定24 h以上,進(jìn)行石蠟包埋,切片、染色、封片,然后放入切片盒內(nèi),所有染片在光鏡下觀察并拍片。

1.6透射電鏡觀察海馬組織超微結(jié)構(gòu) 將分離后的海馬組織(切片厚度70 nm)迅速在預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液中固定2 h,制作切片,用HT7700透射電鏡觀察神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.7血清白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18的含量測(cè)定 DM組動(dòng)物出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙后,心臟取血,3 000 r/min離心5 min,收集血清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中IL-1β、IL-18的含量。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.8Western印跡檢測(cè)各組動(dòng)物海馬組織B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達(dá)水平 取海馬組織,按照課題組之前的方法〔11〕提取總蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白濃度。將蛋白樣品(35 μg)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離在10%凝膠上,然后將目的蛋白轉(zhuǎn)移0.45 μm的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,脫脂牛奶封閉2 h后加入兔多抗Bcl-2(1∶2 000)、Bax(1∶2 000),在振蕩器上4 ℃孵育過夜,然后將膜在TB沖洗液中進(jìn)行3次10 min漂洗,再在羊抗兔二抗(1∶10 000)孵育2 h后,將膜在TB沖洗液中進(jìn)行3次10 min漂洗,電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色,用ImageJ軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析,得到灰度值,按照公式計(jì)算各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism8.0軟件對(duì)正態(tài)分布的計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 Ⅰ、Ⅱ型對(duì)照組飲食飲水正常,毛發(fā)光亮,動(dòng)作敏捷,精神狀態(tài)良好;Ⅰ、Ⅱ型DE組精神萎靡不振,動(dòng)作遲緩,毛發(fā)發(fā)暗且有脫毛現(xiàn)象,飲食飲水增加,尿量增加。

2.2體質(zhì)量與隨機(jī)血糖變化情況 與Ⅰ型對(duì)照組比較,Ⅰ型DE組腹腔注射STZ后72 h、2、3、7、12 w體質(zhì)量明顯下降(P<0.05)并趨于穩(wěn)定,血糖明顯升高(P<0.05)并保持在16.7 mmol/L 以上。與Ⅱ型對(duì)照組比較,Ⅱ型DE組自第9周起體質(zhì)量及血糖均明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 兩種模型動(dòng)物體質(zhì)量與隨機(jī)血糖變化

2.3Morris水迷宮 與對(duì)照組比較,Ⅰ型和Ⅱ型DE組動(dòng)物游泳速度變慢,逃避潛伏期延長,穿越平臺(tái)的次數(shù)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組Morris 水迷宮、Y迷宮及曠場實(shí)驗(yàn)

2.4Y迷宮 與對(duì)照組比較,Ⅰ型及Ⅱ型DE組動(dòng)物自發(fā)交替率明顯降低,且進(jìn)入新異臂的次數(shù)明顯減少(均P<0.05)。見表2。

2.5曠場實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組比較,Ⅰ型及Ⅱ型DE組動(dòng)物運(yùn)動(dòng)總路程明顯縮短,進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)和后肢站立次數(shù)顯著減少(均P<0.05)。見表2。

2.6HE染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)變化 對(duì)照組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,胞體豐滿,排列整齊有序,細(xì)胞核藍(lán)染,核仁明顯。Ⅰ型DE組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,排列疏散,部分神經(jīng)元壞死,細(xì)胞核淡染;Ⅱ型DE組海馬神經(jīng)元形態(tài)未觀察到明顯異常。見圖1。

圖1 各組海馬神經(jīng)元形態(tài)(HE染色,×200)

2.7海馬組織透射電鏡結(jié)果 對(duì)照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)廣泛分布內(nèi)質(zhì)網(wǎng),線粒體結(jié)構(gòu)完整,線粒體嵴明顯,細(xì)胞核大小正常,核膜清晰,染色質(zhì)分布均勻,神經(jīng)纖維區(qū)富含突觸,結(jié)構(gòu)正常;兩種DE組海馬神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體數(shù)量減少,出現(xiàn)脫粒和腫脹,細(xì)胞核明顯收縮,核膜增厚,突觸結(jié)構(gòu)被破壞,數(shù)量減少。見圖2。

圖2 透射電鏡觀察各組海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)(×10 000)

2.8血清IL-1β、IL-18水平 兩種DE組血清中促炎因子IL-1β、IL-18水平顯著高于各自對(duì)照組(均P<0.05)。見表3。

表3 各組血清IL-1β、IL-18水平比較

2.9Western印跡檢測(cè)各組海馬組織Bax、Bcl-2表達(dá)水平 與對(duì)照組比較,兩種DE組海馬組織凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)顯著增加,Bcl-2表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。見表3、圖3。

圖3 Western印跡檢測(cè)各組Bax、Bcl-2表達(dá)

3 討 論

理想的動(dòng)物模型是DE研究的基礎(chǔ),應(yīng)該能夠完全模擬人類DE發(fā)生發(fā)展過程,模型制作簡單,誘導(dǎo)因素單一,重復(fù)性好,可引起DE,并盡可能避免其他因素對(duì)認(rèn)知功能障礙指標(biāo)的干擾。臨床上最常見的糖尿病類型主要是Ⅰ型及Ⅱ型,DE是糖尿病慢性并發(fā)癥之一,是糖尿病患者葡萄糖代謝紊亂導(dǎo)致腦血管發(fā)生改變,進(jìn)而損害中樞神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)、神經(jīng)生理和神經(jīng)精神等的病理改變〔12〕。在糖尿病患者中,Ⅱ型糖尿病占90%以上〔13〕,已有大量研究采用Ⅱ型DE模型探究DE可能的發(fā)病機(jī)制及治療藥物的篩選〔14～17〕。Ⅰ型糖尿病多發(fā)于兒童、青少年,且其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì),建立臨床相關(guān)的腦病動(dòng)物模型對(duì)Ⅰ型DE研究具有重要意義。本課題組前期構(gòu)建Ⅰ型DE模型為DE研究提供參考方法,不論是Ⅰ型還是Ⅱ型DE模型都不能完整呈現(xiàn)DE的發(fā)病機(jī)制。因此,從全面性和系統(tǒng)性角度考慮,本研究在實(shí)驗(yàn)中同時(shí)選用Ⅰ型和Ⅱ型DE模型進(jìn)行研究。

動(dòng)物行為學(xué)評(píng)估在認(rèn)知功能障礙相關(guān)疾病的動(dòng)物模型評(píng)估中具有重要作用〔18～20〕。Morris水迷宮測(cè)試是目前評(píng)估動(dòng)物空間認(rèn)知功能最為常用的研究方法,這種方法利用動(dòng)物喜水的天性,強(qiáng)迫其盡快找到水下站臺(tái),來測(cè)試其記憶能力和空間學(xué)習(xí),但是這種方法是強(qiáng)迫性的,會(huì)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的情緒反應(yīng),可能會(huì)影響評(píng)估結(jié)果〔21〕。每種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的側(cè)重點(diǎn)與使用條件不一樣,在實(shí)驗(yàn)中,僅通過動(dòng)物的一種行為學(xué)測(cè)試表現(xiàn)是不可能準(zhǔn)確評(píng)估學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的信息,因?yàn)槭茉囌呖赡軙?huì)被與認(rèn)知能力無關(guān)的其他信息干擾,必要時(shí)結(jié)合多種行為學(xué)方法進(jìn)行綜合分析,為認(rèn)知功能障礙相關(guān)研究提供科學(xué)可靠的依據(jù)〔22〕。因此,本實(shí)驗(yàn)選用了Morris水迷宮、Y迷宮和曠場實(shí)驗(yàn)等多種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)綜合分析動(dòng)物的認(rèn)知功能。多種行為學(xué)測(cè)試結(jié)果明確提示,Ⅰ型DE模型組在發(fā)病8 w時(shí)和Ⅱ型DE模型組在25周齡時(shí)與對(duì)照組動(dòng)物確實(shí)存在表現(xiàn)差異。

海馬是學(xué)習(xí)和記憶的中樞,神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和損傷會(huì)引起認(rèn)知功能的障礙〔23～25〕。本實(shí)驗(yàn)顯示,Ⅰ型和Ⅱ型模型組動(dòng)物海馬組織凋亡Bax/Bcl-2蛋白水平顯著升高,且Ⅰ型模型大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列松散、空泡化明顯、細(xì)胞數(shù)量減少,這與行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符;而Ⅱ型模型小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞無明顯異常,可能由于該時(shí)期認(rèn)知功能障礙屬于早期。因此,如需觀察嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙,Ⅱ型DE模型小鼠還需繼續(xù)飼養(yǎng)一段時(shí)間。

綜上所述,兩種DE模型作為經(jīng)典模型,在一定程度上均模擬了臨床DE認(rèn)知功能障礙的病癥特點(diǎn),兩種模型之間各有優(yōu)缺點(diǎn),適合不同的實(shí)驗(yàn)需求。Ⅰ型DE模型大鼠價(jià)格低廉,成模時(shí)間短,但個(gè)體差異大,在喂養(yǎng)過程中,由于高血糖導(dǎo)致大鼠抵抗力變差,進(jìn)而出現(xiàn)較高死亡率;Ⅱ型DE模型穩(wěn)定,但價(jià)格偏貴,成模需要的時(shí)間較長,飼養(yǎng)的條件要求較嚴(yán)格、繁殖率低,且人類糖尿病患者很少發(fā)生瘦素受體基因缺失,因此db/db小鼠不能完全模擬人類DE發(fā)生過程,其用于DE病因?qū)W研究有一定的局限性,可用于DE干預(yù)治療研究的模型。若課題組經(jīng)費(fèi)充足且實(shí)驗(yàn)條件允許,建議同時(shí)選用兩種DE模型進(jìn)行研究,這樣更能完整模擬人類DE的發(fā)生發(fā)展過程。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)研究目的,結(jié)合不同模型的特點(diǎn),選擇適合的動(dòng)物模型,從而有助于課題的實(shí)施和完成。