彭傳林 曹惠 朱義生 劉龍 趙學(xué)軍 陳丹

(宿州市第一人民醫(yī)院 1普外科,安徽 宿州 234000;2內(nèi)鏡中心;3武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;4宣城市人民醫(yī)院老年科)

結(jié)直腸癌是我國(guó)老年人群中高發(fā)的惡性腫瘤,其患病率逐年增加,是急需重點(diǎn)防治的疾病之一〔1〕。雖然隨著近年來(lái)腫瘤治療技術(shù)的快速進(jìn)步,手術(shù)、放化療等不斷完善,但每年死于結(jié)直腸癌的患者數(shù)未出現(xiàn)明顯下降,治療方案選擇的合理性是其中主要原因之一〔2〕。準(zhǔn)確評(píng)估結(jié)直腸癌患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后是治療方案合理制定的前提。叉頭框蛋白(FOX)C2位于人類16號(hào)染色體,與對(duì)應(yīng)配體結(jié)合后能夠調(diào)控下游基因表達(dá),在食管癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài),促進(jìn)腫瘤發(fā)展〔3,4〕,但在結(jié)直腸癌中的表達(dá)特點(diǎn)及作用的研究仍十分少見(jiàn)。上皮型鈣黏蛋白存在于人體上皮細(xì)胞表面,在細(xì)胞之間及細(xì)胞與基質(zhì)之間的連接中發(fā)揮通訊作用〔5〕,其表達(dá)下降是引發(fā)上皮細(xì)胞去分化和高浸潤(rùn)性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔6〕。本研究旨在探討FOXC2與上皮型鈣黏蛋白對(duì)老年結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后及細(xì)胞活性的影響。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2018年1月至2019年3月宿州市第一人民醫(yī)院收治的老年結(jié)直腸癌患者84例。入選標(biāo)準(zhǔn):①年齡≥60歲,經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸癌;②首次確診,無(wú)放化療等抗腫瘤治療史;③接受手術(shù)治療,配合完成隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并精神性疾病者;②合并其他組織器官惡性腫瘤。其中男38例,女46例;年齡60～82歲,平均(67.58±5.61)歲;組織學(xué)分級(jí):高分化34例,中分化32例,低分化18例;腫瘤直徑:<5 cm 52例,≥5 cm 32例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期47例,Ⅲ～Ⅳ期37例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例;浸潤(rùn)深度:T1～T2 52例,T3～T4 32例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2細(xì)胞與主要試劑 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116購(gòu)于上?？道噬镉邢薰尽Ｃ庖呓M化檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京百歐泰生物有限公司;血清FOXC2檢測(cè)試劑盒和血清上皮型鈣黏蛋白檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于上海谷研實(shí)業(yè)有限公司;胎牛血清,DMEM完全培養(yǎng)基購(gòu)于上海錸博生化科技有限公司;CCK-8檢測(cè)試劑盒北京拜爾迪生物有限公司;Transwell小室購(gòu)于南京迅貝生物有限公司;鼠抗人FOXC2單克隆抗體,兔鼠抗人上皮型鈣黏蛋白單克隆抗體,鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2單克隆抗體,鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶9單克隆抗體及對(duì)應(yīng)的二抗均購(gòu)于上海恒遠(yuǎn)生物有限公司。

1.3免疫組化法檢測(cè)組織標(biāo)本中FOXC2、上皮型鈣黏蛋白表達(dá) 留取手術(shù)切除的結(jié)直腸癌病灶組織及術(shù)中留取距離腫瘤病灶邊緣5 cm以上的癌旁正常組織,石蠟包埋、切片。將石蠟切片烤片2 h,常規(guī)脫蠟,室溫下加入二甲苯中靜置10 min,無(wú)水乙醇中靜置5 min,95%乙醇中靜置5 min,雙蒸餾水洗滌后室溫下靜置。高壓修復(fù)抗原,磷酸緩沖液洗滌后滴加一抗,稀釋倍數(shù)均為1∶500,4 ℃冷藏過(guò)夜,次日滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫下靜置1 h,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,復(fù)染、脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察FOXC2、上皮型鈣黏蛋白陽(yáng)性染色均為黃色、棕黃色、棕褐色,FOXC2定位于細(xì)胞質(zhì),上皮型鈣黏蛋白定位于細(xì)胞膜,對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分,兩項(xiàng)乘積0～2分為陰性,3～9分為陽(yáng)性。

1.4資料收集和血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白濃度檢測(cè) 收集患者人口學(xué)特征及組織學(xué)分級(jí)、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、浸潤(rùn)深度,術(shù)后對(duì)患者進(jìn)行3年隨訪,收集生存情況。術(shù)前采集患者空腹外周靜脈血,離心收集血清,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白濃度。

1.5HCT116細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116使用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基,在37 ℃ 5%體積的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將HCT116細(xì)胞接種于6孔板中,顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)更換為不含血清的培養(yǎng)基。使用脂質(zhì)體2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,siRNA制備由北京靖瑞百康生物有限公司完成。使用無(wú)干擾活性的siRNA轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞為陰性對(duì)照組,有FOXC2干擾活性的siRNA轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞為FOXC2低表達(dá)組,僅加入脂質(zhì)體的HCT116細(xì)胞為空白對(duì)照組。

1.6CCK-8檢測(cè)HCT116細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)期HCT116細(xì)胞,按4×105/ml密度鋪于96孔板中,并加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基100 μl,常規(guī)培養(yǎng)24 h進(jìn)行同步化處理,根據(jù)分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞,每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24、48、72 h加入濃度10%的CCK-8試劑10 μl/孔,讀取450 nm處的吸光度(OD)值。

1.7劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCT116細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)期HCT116細(xì)胞,按6×105/ml密度鋪于6孔板中,顯微鏡下觀察HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)融合度超過(guò)90%時(shí)做垂直劃痕,根據(jù)分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞,設(shè)8個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞24 h,觀察劃痕寬度變化并拍照,測(cè)量劃痕面積,計(jì)算HCT116細(xì)胞劃痕的愈合率。

1.8HCT116細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 將基底膠∶DMEM=1∶9稀釋后加入Transwell上室,體積為50 μl,常規(guī)培養(yǎng)6 h,將HCT116細(xì)胞按6×105/ml密度加入Transwell上室;根據(jù)分組向Transwell下室加入相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,結(jié)晶紫染色,光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量。

1.9Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中FOXC2、上皮型鈣黏蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá) RIPA細(xì)胞裂解各組HCT116細(xì)胞的總蛋白,測(cè)定蛋白濃度,電泳后使用電轉(zhuǎn)法將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,室溫下封閉1 h,滴加一抗∶鼠抗人FOXC2單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶300),兔鼠抗人上皮型鈣黏蛋白單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶500),鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶100),鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶9單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶100),鼠抗人GAPDH單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶1 000),4 ℃冷藏過(guò)夜,次日滴加二抗,稀釋倍數(shù)1∶2 000,室溫下靜置1 h,電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影,讀取條帶灰度值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及受試者工作特征(ROC)曲線分析。

2 結(jié) 果

2.1不同組織中FOXC2與上皮型鈣黏蛋白表達(dá)情況比較 結(jié)直腸癌組織中FOXC2陽(yáng)性率〔58例(69.05%)〕高于癌旁正常組織〔17例(20.24%)〕,上皮型鈣黏蛋白陽(yáng)性率〔14例(16.67%)〕低于癌旁正常組織〔65例(77.38%)〕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=42.692、39.057,均P=0.000)。

2.2不同臨床病理特征患者FOXC2與上皮型鈣黏蛋白表達(dá)水平比較 TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度T3～T4的結(jié)直腸癌患者FOXC2陽(yáng)性率明顯升高,上皮型鈣黏蛋白陽(yáng)性率明顯降低(P<0.01,P<0.05);FOXC2、上皮型鈣黏蛋白陽(yáng)性率在不同性別、年齡、分化程度、腫瘤直徑的結(jié)直腸癌患者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理特征患者FOXC2與上皮型鈣黏蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較〔n(%)〕

2.3不同預(yù)后水平患者血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白濃度比較 隨訪3年期間,84例老年結(jié)直腸癌患者生存65例(77.38%)。死亡組血清FOXC2濃度〔(41.95±5.03)ng/ml〕高于生存組〔(8.29±1.51)ng/ml〕,上皮型鈣黏蛋白濃度〔(84.60±8.25)U/L〕低于生存組〔(122.42±11.67)U/L〕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=28.219、32.751,均P=0.000)。

2.4血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白檢測(cè)對(duì)患者臨床預(yù)后的評(píng)估價(jià)值分析 ROC曲線分析顯示,血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白檢測(cè)對(duì)老年結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后具有較高的評(píng)估價(jià)值(P<0.05);其中血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白聯(lián)合檢測(cè)的評(píng)估價(jià)值最高曲線下面積(AUC)=0.939〕,靈敏度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值明顯高于各指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白檢測(cè)對(duì)患者臨床預(yù)后的ROC曲線

表2 血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白檢測(cè)對(duì)患者臨床預(yù)后的評(píng)估價(jià)值分析

2.5各組結(jié)直腸癌細(xì)胞中FOXC2表達(dá)水平比較 FOXC2低表達(dá)組結(jié)直腸癌細(xì)胞中FOXC2 蛋白表達(dá)水平(1.15±0.13)低于陰性對(duì)照組(2.37±0.29)和空白對(duì)照組(2.41±0.35),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞中FOXC2蛋白表達(dá)的Western印跡

2.6各組結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力比較 FOXC2低表達(dá)組結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲水平均明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力及上皮型鈣黏蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶水平比較

2.7各組細(xì)胞上皮型鈣黏蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)水平比較 FOXC2低表達(dá)組結(jié)直腸癌細(xì)胞中上皮型鈣黏蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

3 討 論

目前臨床已有手術(shù)、放化療、免疫治療、靶向治療等多種抗結(jié)直腸癌治療手段,準(zhǔn)確評(píng)估患者病情和預(yù)后對(duì)治療方案的合理制定,改善預(yù)后具有重要意義。FOXC2可影響細(xì)胞核中DNA轉(zhuǎn)錄,參與調(diào)控下游基因表達(dá)〔7〕;研究顯示,FOXC2能夠促進(jìn)淋巴管和血管的新生,還作為上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的誘導(dǎo)因子,促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,提升細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力〔8〕。基礎(chǔ)研究顯示,FOXC2在腫瘤細(xì)胞中伴隨間質(zhì)表型蛋白高表達(dá),而上皮型鈣黏蛋白等上皮標(biāo)志物低表達(dá)〔9〕。已在食管癌、乳腺癌中發(fā)現(xiàn)FOXC2高表達(dá)參與病情的進(jìn)展,但在結(jié)直腸癌患者中表達(dá)的研究仍十分少見(jiàn)。上皮型鈣黏蛋白是一種位于細(xì)胞連接面的跨膜糖蛋白,與鈣離子形成二聚體,參與調(diào)控同型細(xì)胞的黏附過(guò)程〔10〕。人上皮細(xì)胞中上皮型鈣黏蛋白是形成正常連接復(fù)合物的主要調(diào)節(jié)因子,與細(xì)胞骨架連接,胞外信號(hào)向胞內(nèi)傳遞,細(xì)胞分化、生長(zhǎng)密切相關(guān)〔11〕。

本研究結(jié)果提示,結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中FOXC2高表達(dá),上皮型鈣黏蛋白低表達(dá),可能參與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程。本文老年結(jié)直腸癌患者生存率與相關(guān)研究報(bào)道中結(jié)直腸癌患者3年生存率75.8%、78.51%基本一致〔12,13〕,說(shuō)明本地區(qū)老年結(jié)直腸癌患者生存率處于平均水平。本文表明,血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)患者臨床預(yù)后具有較高的評(píng)估價(jià)值,聯(lián)合檢測(cè)的評(píng)估價(jià)值最高,可用于老年結(jié)直腸癌患的預(yù)后評(píng)估,指導(dǎo)治療方案的制定。

FOXC2在多種惡性腫瘤中高表達(dá),促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)與遷移;還能夠上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá),維持血管穩(wěn)定性,保證腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)〔14〕。FOXC2能夠參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞的分化方向,影響細(xì)胞增殖、遷移等過(guò)程〔15〕。本研究結(jié)果提示,下調(diào)FOXC2表達(dá)能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。細(xì)胞間的黏附作用分為細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附、細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附兩種類型;上皮型鈣黏蛋白是細(xì)胞與細(xì)胞間黏附的主要調(diào)控因子,在腫瘤組織中低表達(dá),能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲〔16〕。腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲過(guò)程需要基質(zhì)金屬蛋白酶降解相鄰胞外基質(zhì)來(lái)完成?；|(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9是與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切的基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員,參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲〔17〕。本研究中下調(diào)FOXC2表達(dá)后結(jié)直腸癌細(xì)胞中上皮型鈣黏蛋白表達(dá)升高,基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)下降,提示FOXC2可能通過(guò)作用于上皮型鈣黏蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程。