穆雪峰 李振宇 黃書琦 康文全 尹小菲 穆桂芳

(1華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院消化科,廣東 深圳 518052;2深圳微辰生命科技有限公司;3威海市立二院消化科)

胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤第5位,死亡率居第4位,總體死亡率為7.7/10萬(wàn)。近5年全球胃癌平均年發(fā)病例數(shù)為180.6萬(wàn)例,其中亞洲139.7萬(wàn)例(77.4%),中國(guó)68.9 萬(wàn)例(38.2%)。我國(guó) 2020 年胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤第 3 位,死亡率居第 3 位,死亡37.4萬(wàn)例,死亡率15.9/10萬(wàn)〔1〕。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,胃癌在老年人群中高發(fā),發(fā)病高峰為65～80歲,80歲以上胃癌患者死亡率最高。幽門螺旋桿菌通常被認(rèn)為是導(dǎo)致胃癌的重要因素〔1〕。研究表明,除幽門螺旋桿菌,其他微生物也可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用〔2,3〕,同時(shí)血液中相關(guān)代謝物也和胃癌發(fā)病及進(jìn)展存在密切關(guān)系〔4～6〕。本文收集糞便、唾液和血液樣本進(jìn)行研究,以期得到和胃癌相關(guān)的潛在生物標(biāo)志。

1 材料與方法

1.1對(duì)象 納入華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院胃癌患者5例為研究組,選取同期正常且無(wú)其他病史的人群5例作為對(duì)照組。性別、年齡和胃癌患者盡量匹配。對(duì)所有招募者進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查,主要包括年齡、民族、性別、吸煙和飲酒史、既往慢性基礎(chǔ)病病史及相關(guān)輔助檢查等特征資料。同時(shí)檢測(cè)胃癌相關(guān)臨床指標(biāo),建立臨床信息數(shù)據(jù)庫(kù),如血常規(guī),胃癌的腫瘤標(biāo)記物癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA)19-9、CA125等。采集樣本包括血液、糞便、唾液。納入標(biāo)準(zhǔn):研究組采用病理活檢、胃鏡等診斷,確診疾病;資料齊全;認(rèn)知正常;熟知本研究,自愿參加。排除標(biāo)準(zhǔn):精神異常;其他惡性腫瘤;胃大部切除術(shù);依從性差。兩組年齡等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2樣本采集 糞便和唾液樣本均在未接受任何治療的情況下采集。糞便樣本采集:采集前受試者需先排尿,然后將糞便排于無(wú)菌采集袋中,排便結(jié)束后用一次性采樣勺采集中間未接觸空氣部分0.5～0.8 g樣本,將樣本置于凍存管中擰緊后-80 ℃凍存。唾液樣本采集:采集前30 min受試者需先用清水漱口,用帶有漏斗的采集管收集唾液約2 ml,取下采集漏斗并擰緊采集管后-80 ℃凍存。

1.3基因組DNA提取和建庫(kù)測(cè)序 使用Omega E.Z.N.A.Stool DNA Kit (Bio-tek,Inc.,USA) 提取糞便和唾液的微生物基因組DNA。提取完成的DNA用Covaris E220超聲打斷儀打斷成約300 bp的小片段后,使用NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit 定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后,在Illumina Novaseq6000平臺(tái)進(jìn)行PE150的文庫(kù)測(cè)序,并保證每個(gè)樣本下機(jī)數(shù)據(jù)量不低于5G。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 測(cè)序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)的處理步驟:(1)過(guò)濾低質(zhì)量的數(shù)據(jù);(2)使用SOAP2比對(duì)到基因集;(3)根據(jù)基因集和微生物分類及KO的對(duì)應(yīng)關(guān)系,計(jì)算門(phylum)、屬(genus)、種(species)和KO的相對(duì)豐度〔7〕。樣本內(nèi)的物種多樣性(Alpha多樣性)使用shannon index表示。樣本間的物種多樣性(Beta多樣性)使用bray-curtis距離表示。主坐標(biāo)分析(PCoA)用來(lái)展示樣本間的bray-curtis距離。相似性分析(ANOSIM,置換次數(shù)為999)用來(lái)評(píng)估不同組的樣本的分布差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用R(版本3.5.1)中的wilcox秩和檢驗(yàn)用于對(duì)不同組之間的微生物的相對(duì)豐度進(jìn)行差異分析。腸型分析:(1)基于樣本在屬水平的相對(duì)豐度計(jì)算樣本間JSD;(2)基于JSD進(jìn)行圍繞中心點(diǎn)劃分算法(PAM)聚類;(3)使用CH指數(shù)評(píng)估最優(yōu)聚類數(shù)量;(4)使用PCoA展示聚類效果〔8〕。線性判別分析(LEfSe)用于對(duì)不同組樣本的微生物相對(duì)豐度進(jìn)行比較,以獲得可能和胃癌相關(guān)的微生物〔9〕。LDA分值的閾值設(shè)定為3。使用R(版本3.5.1)中的cor.test在屬水平對(duì)微生物的相關(guān)性進(jìn)行分析。選擇相關(guān)系數(shù)<-0.6或>0.6,P值<0.05,且在不同組的樣本中的相對(duì)豐度之和>0.1%的微生物使用cytoscape進(jìn)行繪圖展示。隨機(jī)森林模型用于對(duì)不同組的樣本進(jìn)行分類,最終的曲線下面積(AUC)為5折交叉驗(yàn)證的均值。基于樣本的KO相對(duì)豐度,使用reporter score算法計(jì)算KEGG模塊和通路的z-score〔10〕。z-score的絕對(duì)值>1.96(正態(tài)分布的97.5%置信度)時(shí),認(rèn)為結(jié)果在不同組之間有顯著差異。使用R(版本3.5.1)psych包中的corr.test對(duì)臨床指標(biāo)和LEfSe找到的差異微生物進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。檢驗(yàn)方法為spearman。

2 結(jié) 果

2.1Alpha和Beta多樣性 研究組和對(duì)照組腸道微生物和口腔微生物在屬和種水平的Alpha多樣性shannon差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但研究組腸道微生物和口腔微生物的Alpha多樣性的中位數(shù)均低于對(duì)照組。見(jiàn)圖1。研究組和對(duì)照組在PCoA1和PCoA2維度的分布無(wú)法明顯區(qū)分。ANOSIM分析的結(jié)果表明研究組和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。口腔微生物的結(jié)果也同樣如此(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

A:腸道微生物,屬水平;B:腸道微生物,種水平;C:口腔微生物:屬水平;D:口腔微生物,種水平;圖2同圖1 兩組腸道和口腔微生物的Alpha多樣性

圖2 兩組腸道和口腔微生物的Beta多樣性

2.2微生物構(gòu)成和腸型 在門水平,相對(duì)豐度較高的微生物包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)等。在屬水平,相對(duì)豐度較高的微生物包括擬桿菌屬(Bacterodie)、經(jīng)黏液真桿菌屬(Blautia)、普雷沃菌屬(Prevotella)、普拉梭菌(Bifidobacterium)、大腸桿菌(Escherichia)等。其中,研究組和對(duì)照組中至少有一組的相對(duì)豐度中位數(shù)大于0.1%,兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,乳桿菌屬內(nèi)(Lactobacillus)(研究組1.282 6%,對(duì)照組0.001 6%,P=0.016)。在種水平,相對(duì)豐度較高的微生物包括Bacteroides dorei、Bacteroides uniformis、Bacteroides ovatus等。其中,兩組中至少有一組的相對(duì)豐度的中位數(shù)大于0.01%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;咽頰炎鏈球菌(Streptococcus anginosus)(研究組0.047%,對(duì)照組0.001%,P=0.008)、糞球菌屬(Coprococcus comes)(研究組0.078%,對(duì)照組=0.010%,P=0.016)、克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)(研究組0.154%,對(duì)照組0.02%,P=0.016)、Lactobacillus salivarius(研究組0.017%,對(duì)照組0.000%,P=0.016)、Dorea longicatena(研究組0.054%,對(duì)照組0.006%,P=0.032)、布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)(研究組0.325%,對(duì)照組0.003%,P=0.032)。

研究組和對(duì)照組中豐度較高的口腔微生物,在門水平,相對(duì)豐度較高的微生物包括Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、梭桿菌門(Fusobacteria)、Actinobacteria等。在屬水平,相對(duì)豐度較高的微生物包括嗜血桿菌屬(Haemophilus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、韋榮球菌屬(Veillonella)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、Fusobacterium等。研究組和對(duì)照組中至少有一組相對(duì)豐度的中位數(shù)大于0.1%,且在兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,包括Actinobacillus(GCmedian=0.007%,Control median=0.106 %,P=0.032)。在種水平,相對(duì)豐度較高的微生物包括副流感嗜血桿菌(Haemophilus para influenzae)、炎鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei)、未分類的乳桿菌(unclassified Fusobacterium)、彎曲桿菌(Campylobacter concisus)等。兩組中至少有一組的相對(duì)豐度的中位數(shù)大于0.01%,且在兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,包括Actinobacillus minor(研究組0.00%,對(duì)照組0.01%,P=0.011)、Actinobacillus pleuropneumoniae(研究組0.000%,對(duì)照組0.016%,P=0.025)、Kingella denitrificans(研究組0.003%,對(duì)照組0.018%,P=0.032)、Neisseria mucosa(研究組0.025%,對(duì)照組0.164%,P=0.032)、Streptococcus mutans(研究組0.005%,對(duì)照組=0.016%,P=0.032)。見(jiàn)圖3。

A:腸道微生物,門水平;B:腸道微生物,屬水平;C:腸道微生物,種水平;D:口腔微生物,門水平;E:口腔微生物,屬水平;F:口腔微生物:種水平圖3 兩組相對(duì)豐度較高的腸道微生物和口腔微生物

研究組和對(duì)照組的所有腸道樣本可以聚為2類,分別對(duì)應(yīng)腸型1和腸型2。見(jiàn)圖4。研究組均屬于腸型1。對(duì)照組中4例腸型1,1例腸型2。兩組在不同腸型中的人數(shù)分布的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(fisher檢驗(yàn),P=1)。

圖4 兩組糞便樣本的腸型分析結(jié)果

2.3與胃癌相關(guān)的微生物及分類模型 在門、屬和種水平進(jìn)行了LEfSe來(lái)尋找可能和胃癌相關(guān)的微生物。在腸道微生物中共找到7種分類,包括1種門水平的分類,2種屬水平的分類、4種種水平的分類見(jiàn)圖5A。在門水平,Firmicutes在研究組中的相對(duì)豐度較高。在屬水平,在研究組中的相對(duì)豐度較高的Lactobacillus屬于Firmicutes門,Thauera屬于Proteobacteria;和相關(guān)研究一致〔11～14〕。在種水平,研究組中的相對(duì)豐度較高的4種分類中,Lactobacillus reuteri屬于Firmicutes門下Lactobacillus屬。

A:可能和胃癌相關(guān)的腸道微生物;B:可能和胃癌相關(guān)的口腔微生物;C:腸道微生物之間相關(guān)性網(wǎng)絡(luò);D:口腔微生物之間相關(guān)性網(wǎng)絡(luò);相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)中,節(jié)點(diǎn)大小正比于研究組和對(duì)照組之間微生物的相對(duì)豐度中位數(shù)之比;邊的粗細(xì)正比于相關(guān)系數(shù)的大小的絕對(duì)值,藍(lán)色邊表示負(fù)相關(guān),紅色邊表示正相關(guān)圖5 LEfSe分析獲得的可能和胃癌相關(guān)的微生物及微生物之間的相關(guān)性

在口腔微生物中共找到6種分類和胃癌相關(guān),包括3種屬水平的分類、3種種水平的分類見(jiàn)圖5B。在屬水平,2種在研究組中的相對(duì)豐度較高的屬中,Campylobacter屬于Proteobacteria門;Gemella屬于Firmicutes門。在對(duì)照組中的相對(duì)豐度較高的Neisseria屬于Proteobacteria門;和之前報(bào)道一致〔15～17〕。在種水平,對(duì)照組中的相對(duì)豐度較高的3種分類中,Campylobacter concisus 屬于Proteobacteria門的Campylobacter屬; Jonquetella anthropi屬于Synergistetes門的Jonquetella屬;Gemella sanguinis屬于Firmicutes門的Gemella屬。

基于微生物之間的相關(guān)性分析,獲得部分相關(guān)性較高且具有一定相對(duì)豐度的微生物。腸道微生物中,和Lactobacillus正相關(guān)的屬包括Citrobacter (r=0.85,P=0.003)、Oscillibacter(r=0.79,P=0.01)等。在對(duì)照組中相對(duì)豐度更高的分類包括Bifidobacterium、Eubacterium、Faecalibacterium、Subdoligranulum等有益菌。這些有益菌能夠生成丁酸鹽、丙酸鹽、醋酸鹽等對(duì)人體健康有益的代謝物〔18～21〕。見(jiàn)圖5C。

口腔微生物中,Campylobacter和Gemella之間的相關(guān)性較高(r=0.83,P=0.006)。和Campylobacter相關(guān)性較高的其他屬包括Atopobium (r=0.93,P=0.000 1)、Megasphaera(r=0.89,P=0.001)、Solobacterium(r=0.88,P=0.002)等。和Gemella相關(guān)性較高的其他屬包括Atopobium(r=0.88,P=0.002)、Corynebacterium(r=0.82,P=0.007)等。和Neisseria相關(guān)性較高的其他屬包括Kingella(r=0.88,P=0.002)、Actinobacillus(r=0.79,P=0.01)等,見(jiàn)圖5D。

在腸道微生物和口腔微生物中,研究組Lactobacillus、Enterococcus、Veillonella、Dialister、Odoribacter相對(duì)豐度均大于對(duì)照組;Bacteroides相對(duì)豐度均小于對(duì)照組。

基于LEfSe找到的胃癌相關(guān)的微生物,使用隨機(jī)森林模型構(gòu)建分類模型 。在腸道微生物中,分別使用屬水平的Lactobacillus和陶厄菌屬(Thauera)中的一種作為特征時(shí),AUC分別為0.9、0.7;當(dāng)同時(shí)使用這些屬作為特征時(shí),AUC為0.9。在口腔微生物中,分別使用屬水平的Campylobacter、Gemella和Neisseria中的一種作為特征時(shí),AUC分別為0.7、0.9、0.8;當(dāng)同時(shí)使用這些屬作為特征時(shí),AUC為0.8。見(jiàn)圖6。

A:腸道微生物;B:口腔微生物;圖7、8同圖6 基于可能和胃癌相關(guān)的微生物構(gòu)建的分類模型的受試者工作特征(ROC)曲線

2.4和胃癌相關(guān)的臨床指標(biāo)及微生物關(guān)聯(lián)分析 對(duì)檢測(cè)的10個(gè)臨床指標(biāo)進(jìn)行差異分析。其中CEA和鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(SCCa)在兩組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(wilcox秩和檢驗(yàn),CEA:研究組8.66,對(duì)照組2.10,P=0.06;SCCa:研究組0.27,對(duì)照組0.71,P=0.06)。

計(jì)算臨床指標(biāo)的檢測(cè)值和LEfSe找到的和胃癌相關(guān)的微生物分類之間的相關(guān)性。在糞便樣本中,CEA的檢測(cè)值和屬水平的Thauera的相對(duì)豐度呈正相關(guān)(r=0.76,P=0.01)。SCCa的檢測(cè)值和屬水平的Lactobacillus、種水平的Lactobacillus reuteri、Alistipes putredinis、Streptococcus_anginosus的豐度呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.85、-0.79、-0.87、-0.68,P分別為0.001、0.006、0.001、0.030)。見(jiàn)圖7。

圖7 臨床指標(biāo)和微生物之間的關(guān)聯(lián)性

在唾液樣本中,SCCa和屬水平的Neisseria的豐度呈正相關(guān)(r=0.72,P=0.02)。CA242、CA199和Neisseria的豐度呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.77、-0.84,P分別為0.009、0.002)。見(jiàn)圖7。

2.5功能分析 基于reporter score算法的富集分析,獲得在分別研究組和對(duì)照組中富集的KEGG通路。腸道微生物中,兩組之間顯著富集的通路明顯不同。 研究組顯著富集的通路主要和遺傳信息處理、脂質(zhì)代謝等相關(guān)。而在對(duì)照組中顯著富集的通路主要和氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝等相關(guān)。研究組顯著富集的通路主要和遺傳信息處理、脂質(zhì)代謝等相關(guān)。見(jiàn)圖8。

--:reporter score<-2.3,-:reporter score<-1.96,++:reporter score>2.3,+:reporter score>1.96圖8 兩組富集的KEGG通路

3 討 論

從物種構(gòu)成來(lái)看,腸道微生物和口腔微生物的相對(duì)豐度最高的3種門都是Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria。但是腸道微生物中相對(duì)豐度最高的Bacteroidetes在口腔微生物中的相對(duì)豐度較低。而腸道微生物中相對(duì)豐度較低的Proteobacteria在口腔微生物中的相對(duì)豐度則最高。

LEfSe發(fā)現(xiàn)一些和胃癌相關(guān)的微生物。盡管在屬水平,不同樣本類型(糞便、唾液)發(fā)現(xiàn)的相關(guān)微生物不一樣,但在門的層級(jí)存在共性。例如在研究組中相對(duì)豐度更高的腸道微生物中的Lactobacillus和口腔微生物中的Gemella都屬于Firmicutes門。當(dāng)使用和胃癌相關(guān)的微生物構(gòu)建分類模型時(shí),腸道微生物中發(fā)現(xiàn)的Lactobacillus和口腔微生物中發(fā)現(xiàn)的Gemella的分類效果相當(dāng)。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),腸道微生物中的Enterococcus、Dorea和Streptococcus等在研究組的相對(duì)豐度大于對(duì)照組,而這些微生物也曾在之前的研究中被認(rèn)為和胃癌相關(guān)。說(shuō)明不同的樣本情況(包括數(shù)量、臨床特征等)、檢測(cè)方法(16S、宏基因組測(cè)序等)及分析方法等均可能影響結(jié)果。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)明腸道微生物和口腔微生物之間存在一定一致性。

腸道微生物中,翻譯(RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、核糖體)、轉(zhuǎn)錄(RNA聚合酶)通路在研究組中顯著富集,這些通路和癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔22,23〕。磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)和ABC運(yùn)送等膜轉(zhuǎn)運(yùn)通路也在對(duì)照組中顯著富集。Firmicutes門是對(duì)這些通路做出貢獻(xiàn)的主要微生物之一〔24〕。脂質(zhì)代謝(甘油脂代謝、甘油磷脂代謝、酮體合成和降解)、異物生物降解與代謝(苯酸鹽降解、氟苯甲酸酯降解、多環(huán)芳烴降解)。Liao等〔25〕研究發(fā)現(xiàn)多環(huán)芳烴的一種代謝產(chǎn)物1-羥基芘葡萄糖醛酸苷在胃癌患者中的濃度要比健康對(duì)照的高。與此相反,氨基酸代謝(丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代謝、纈氨酸-亮氨酸和異亮氨酸生物合成、苯丙氨酸-酪氨酸和色氨酸生物合成、組氨酸代謝)、能量代謝(氧化磷酸化、原核生物中的碳固定通路)、輔助因子和維生素代謝(卟啉和葉綠素代謝、生物素代謝、葉酸合成、維生素B6代謝)等通路則在對(duì)照組中顯著富集。維生素對(duì)于維持健康狀態(tài)發(fā)揮著重要的作用〔26〕。和維生素B6合成呈負(fù)相關(guān)的Blautia、Roseburia在健康對(duì)照中的相對(duì)豐度更低,和生物素合成相關(guān)的Bacteroides則在對(duì)照組的豐度更高〔8,27〕。口腔微生物中,異物生物降解和代謝(苯酸鹽降解、氯環(huán)己烷和氯苯降解、多環(huán)芳烴降解)、神經(jīng)退行性疾病(阿爾茨海默病、帕金森病)等通路在胃癌患者中顯著富集。

綜上,胃癌患者組和健康人無(wú)論在腸道微生物還是口腔微生物方面都存在差異。這些差異既存在共性,也存在特性。腸道微生物中的Lactobacillus可以作為一種潛在的和胃癌相關(guān)的生物標(biāo)記。由于本研究中樣本數(shù)量的限制,分析存在一定局限性,后續(xù)使用更大樣本量進(jìn)行分析可以進(jìn)一步完善現(xiàn)有結(jié)果。