王介華，睢金凱，崔令軍，石開明

（1.湖北民族大學(xué) 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實驗室，湖北 恩施 445000；2.河北科技師范學(xué)院 海洋資源與環(huán)境學(xué)院，河北 秦皇島 066000）

鹽脅迫是自然界主要的非生物脅迫之一，鹽脅迫對植物的影響主要包括植物生長、礦質(zhì)元素吸收和代謝生理等方面。研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下植株體內(nèi)礦質(zhì)元素含量減少，生物量降低，導(dǎo)致植株減產(chǎn)和質(zhì)量下降[1]。目前應(yīng)用接種叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）來提高植物對鹽堿耐受性的方法日益受到農(nóng)林學(xué)家廣泛關(guān)注，AMF 可以與地球上約80%的植物根系建立共生關(guān)系并形成叢枝菌根[2]，能夠促進(jìn)宿主植物對土壤中大量元素磷、鉀和微量元素鋅、銅等的吸收[3]，從而增加生物量；同時AMF 可以促進(jìn)植株體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)，提高可溶性蛋白、可溶性糖和Pro 的含量，增加超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶的活性[4-5]，從而能夠減輕植物受到外界環(huán)境脅迫時的不利影響，提高植物的抗逆能力。

楨楠（PhoebezhennanS.Lee & F.N.Wei）為樟科Rosaceae 楠屬PhoebeNees常綠大喬木，是亞熱帶常綠落葉闊葉林的重要組成樹種，由于氣候變化和自然災(zāi)害等因素的影響，目前楠木資源較為缺乏，現(xiàn)存林分主要生長在我國的四川、貴州、湖北、湖南和浙江等省份[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)AMF在高鹽濃度下（300 mmol·L-1）對楨楠根系具有較高的侵染率（41.25%），且AMF 能夠顯著地促進(jìn)楨楠根系生長[7]。因此，本試驗以楨楠為材料，探討叢枝菌根真菌在改善楨楠耐鹽性方面的作用，旨在促進(jìn)楨楠在鹽堿環(huán)境中的生長，提高楨楠的抗鹽能力，為拓寬楠木的種植范圍和鹽堿地區(qū)發(fā)展楠木產(chǎn)業(yè)及其他樹種造林提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以楨楠為試驗材料，2017 年11 月上旬于湖北省恩施土家族苗族自治州林業(yè)科學(xué)研究院（109°29＇58″E，30°17’51″N）采集種子，室溫下陰干后調(diào)制，置于冰箱中4 ℃下保存。所用AMF 菌種為Funneliformismosseae，購于中國叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫，并以三葉草Trifoliumrepens為寄主植株進(jìn)行擴(kuò)繁；接種菌劑包含AMF 侵染的三葉草根段及真菌孢子，每個真菌接種處理接種120 g菌劑（約1 500 個孢子）。

1.2 試驗設(shè)計

2018 年3 月，將種子取出后用10%的碳酸氫鈉溶液浸泡48 h，然后搓洗去除種子表面包被的油脂，經(jīng)70%的酒精消毒后用蒸餾水清洗干凈，置于滅菌（0.11 MPa，121 ℃，1 h）的河沙中催芽。將催芽的種子置于人工氣候箱內(nèi)，晝夜溫度分別設(shè)置為25 ℃和18 ℃，相對濕度80%，光照時間16 h，黑暗時間8 h。選取高度一致、具有4 片真葉的無菌楨楠幼苗移栽到塑料盆中（苗高20 cm左右），加入1.5 kg 消毒（0.11 MPa，121 ℃，1 h）基質(zhì)（土壤∶沙=1∶1，V/V）。試驗于8 月中旬進(jìn)行，設(shè)AMF 接種（+AMF）處理和未接種（-AMF）2組處理，每個處理種植10 盆，每盆3 株幼苗。接種菌劑包含AMF 真菌侵染的三葉草根段及AMF真菌孢子，未接種處理在塑料盆中填充相同質(zhì)量的滅菌物質(zhì)以保持微生物區(qū)系一致。NaCl 處理為100、200 和300 mmol·L-1，以蒸餾水為對照（CK），隔3 d 澆1 次鹽水，每次各澆100 mL，缽下放盤，為保持盆內(nèi)鹽濃度，如有滲漏，將滲出液反倒回去，鹽脅迫30 d 后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 生長指標(biāo)測定

植株高度和地徑用游標(biāo)卡尺測量。采集正常生長的完整植株，然后分離每株的地下部分（根）和地上部分（莖葉）并用去離子水清洗，用吸水紙吸干表面水分，記錄鮮質(zhì)量，然后將植株的根、莖、葉放置在烘箱中70 ℃下烘干至恒質(zhì)量后測定干物質(zhì)質(zhì)量，每個處理測定5 次。

1.3.2 礦質(zhì)元素含量測定

N 元素含量采用AA3 連續(xù)流動分析儀測定；P 元素含量采用鉬銻抗比色法測定；Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn、K 和Na 元素含量采用Optimal 2100 DV 電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（美國Pekin-Elmer 公司）測定[8]，每個處理測定5 次。

1.3.3 生理指標(biāo)測定

采用考馬斯亮藍(lán)G—250 法測定可溶性蛋白含量，蒽酮比色法測定可溶性糖含量，酸性茚三酮比色法測定脯氨酸（Pro）含量，硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量，氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性，分光光度計法測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性[8]，每個處理測定5 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003 和SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，用Two-way ANOVA 與S-N-K 檢驗分析各處理間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下AMF 對楨楠生長的影響

由表1 可以看出，在不同濃度NaCl 脅迫下，AMF 顯著提高了楨楠的株高、基徑、地上部干物質(zhì)質(zhì)量和根系干物質(zhì)質(zhì)量，AMF 接種與未接種楨楠的株高、基徑和根系干物質(zhì)質(zhì)量均呈顯著差異（P＜0.05）。在NaCl 濃度為100 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種楨楠的株高增加了20.26%，基徑增加了24.12%，地上部干物質(zhì)質(zhì)量增加了10.11%，根系干物質(zhì)質(zhì)量增加28.81%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，AMF 對株高、基徑和根干物質(zhì)質(zhì)量有顯著影響，鹽脅迫對地上部干物質(zhì)質(zhì)量有顯著影響。

表1 鹽脅迫和AMF 處理對楨楠生長指標(biāo)的影響?Table 1 Combinative effects of AMF and salt stress on the plant growth index of P. zhennan

2.2 鹽脅迫下AMF 對楨楠大量元素含量的影響

由圖1 可以看出，在NaCl 濃度為100、200 和300 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種楨楠的N 含量分別減少了4.89%、2.34%和7.34%，但差異均不顯著。在NaCl 濃度為100 mmol·L-1時，AMF接種比未接種楨楠的P 含量增加了2.85%，Mg 含量增加了16.24%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，AMF、鹽脅迫對Ca 含量影響顯著，AMF 與鹽脅迫的交互作用對Mg 含量的影響均為顯著。

2.3 鹽脅迫下AMF 對楨楠微量元素含量的影響

由圖2 可以看出，在NaCl 濃度為300 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種楨楠的Fe 含量增加了3.60%，Mn 含量增加了16.39%；在NaCl 濃度為100 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種楨楠的Cu 含量增加了8.12%，Zn 含量增加了19.40%。雙因素方差分析結(jié)果表明，AMF 對Zn 含量的影響均為顯著，AMF 與鹽脅迫的交互作用對Cu 和Zn 含量的影響均為顯著。

圖2 鹽脅迫和AMF 處理對楨楠微量元素含量的影響Fig.2 Combinative effects of AMF and salt stress on the micronutrient concentrations of P. zhennan

2.4 鹽脅迫下AMF 對楨楠K、Na 含量及K/Na的影響

由圖3 可以看出，在NaCl 濃度為100、200 和300 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種楨楠的K 含量分別增加了22.11%、11.36%和7.19%，Na 含量減少了28.38%、25.13%和49.68%，K/Na 增加了64.82%、41.17%和61.28%，且均呈顯著性差異（P＜0.05）。雙因素方差分析結(jié)果顯示，鹽脅迫對K 含量的影響顯著，AMF 對K/Na 的影響顯著，AMF與鹽脅迫的交互作用對Na 含量的影響顯著。

圖3 鹽脅迫和AMF 處理對楨楠K、Na 元素含量及K/Na 的影響Fig.3 Combinative effects of AMF and salt stress on the concentrations of K and Na as well as K/Na ratios of P. zhennan

2.5 鹽脅迫下AMF 對楨楠滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖4A 可以看出，在NaCl 濃度為100、200和300 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種楨楠的Pro 含量分別增加了28.34%、39.37%和57.82%。雙因素方差分析結(jié)果表明AMF 對Pro 含量有顯著影響，鹽脅迫對Pro 含量無顯著影響（表2）。

圖4 鹽脅迫和AMF 處理對楨楠滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響Fig.4 Combinative effects of AMF and salt stress on osmotic adjustment substances of P. zhennan

表2 接種AMF、鹽脅迫和二者交互作用對楨楠生長及生理指標(biāo)的影響?Table 2 ANOVA for the combinative effects of AMF and salt stress on the growth and physiological indicators of P. zhennan

由圖4B 可以看出，在NaCl 濃度為100、200 和300 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種楨楠的可溶性糖含量分別增加了21.32%、48.82%和55.13%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，AMF 和鹽脅迫對可溶性糖含量有顯著影響（表2）。

由圖4C 可以看出，在NaCl 濃度為100、200和300 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種楨楠的可溶性蛋白含量分別增加了12.02%、16.07%和20.74%。雙因素方差分析結(jié)果表明，AMF 對可溶性蛋白含量有極顯著影響，鹽脅迫對可溶性蛋白有顯著影響（表2）。

由圖4D 可以看出，在NaCl 濃度為100、200和300 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種楨楠的MDA 含量分別降低了12.43%、20.23%和3.54%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，AMF 對MDA 含量有極顯著影響，鹽脅迫及對MDA含量無顯著影響（表2）。

2.6 鹽脅迫下AMF 對楨楠抗氧化酶活性的影響

由圖5A 可以看出，在NaCl 濃度為100、200和300 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種楨楠的SOD 活性分別增加了16.03%、16.74%和10.59%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，AMF 對SOD 活性有顯著影響，鹽脅迫SOD 活性無顯著影響（表2）。

圖5 鹽脅迫和AMF 處理對楨楠抗氧化酶活性的影響Fig.5 Combinative effects of AMF and salt stress on the antioxidant enzyme activity of P. zhennan

由圖5B 可以看出，在NaCl 濃度為100、200和300 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種楨楠的POD 活性分別增加了44.16%、37.88%和34.41%。雙因素方差分析結(jié)果表明，AMF 對POD 活性有顯著影響，鹽脅迫對POD 活性無顯著影響（表2）。

由圖5C 可以看出，在NaCl 濃度為100、200 和300 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種楨楠的CAT 活性分別增加了40.82%、42.11% 和30.25%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，AMF、鹽脅迫對CAT 活性無顯著影響（表2）。

由圖5D 可以看出，在NaCl 濃度為100、200和300 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種楨楠的APX 活性分別增加了26.37%、24.11%和1.45%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，鹽脅迫對APX 活性有顯著影響，AMF 對APX 活性無顯著影響（表2）。

3 結(jié)論與討論

鹽害對植物最直接的影響就是降低生物量的積累，因此生長量是植物耐鹽性評價的直接指標(biāo)[9-10]。土壤中高濃度的NaCl 不僅會引起植物體內(nèi)Na 和Cl 元素的過量積累，還會影響土壤中其他營養(yǎng)元素的活性，導(dǎo)致植物細(xì)胞處于營養(yǎng)虧缺的狀態(tài)中。對小麥和大麥[10]耐鹽性和柱子草[12]耐鹽生理的研究表明，鹽脅迫可導(dǎo)致葉片變小、干質(zhì)量降低和生長量減弱等不良影響；而接種菌根真菌可以緩解鹽害對植物的危害，促進(jìn)鹽脅迫下生物量的積累[13]。本試驗結(jié)果表明，在同等鹽濃度脅迫下，接種AMF 的生長與生物量均顯著高于未接種，表明AMF 能夠顯著減緩鹽脅迫對楨楠生長的影響，這與對紅花[14]、核桃[15]、黑松[16]的研究結(jié)果一致。

土壤鹽漬化導(dǎo)致植株細(xì)胞內(nèi)積累了大量的Na+，使植株產(chǎn)生離子毒害并降低對礦質(zhì)元素的吸收。對藍(lán)莓[17]、沙棗[18]和西伯利亞白刺[19]耐鹽性的研究結(jié)果表明，鹽脅迫不僅使大量元素的吸收減少，同時也削弱了對微量元素的吸收，導(dǎo)致植物體內(nèi)營養(yǎng)元素缺乏和細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂。本試驗結(jié)果表明，在同等鹽濃度脅迫下，AMF 接種的Cu 和Zn 含量顯著高于未接種，這與對刺槐[20]的研究結(jié)果一致，鹽脅迫下接種AMF 后礦質(zhì)元素含量升高主要是由于鹽脅迫使生物量下降較多，其余元素含量在較少的生物量中積累升高所導(dǎo)致。鹽脅迫下，植物通過調(diào)節(jié)有機(jī)物質(zhì)如Pro、可溶性糖等的含量來提高其耐鹽性[21]，這些物質(zhì)的積累有利于植物在高鹽脅迫下對水分的吸收，保證細(xì)胞的正常生理功能[22-23]；其中，Pro 能夠降低細(xì)胞的水勢，調(diào)節(jié)滲透平衡，AMF 可以通過增加Pro的積累來提高植物的耐鹽性。本試驗中，NaCl 濃度為100、200 和300 mmol·L-1時，AMF 接種比未接種的楨楠Pro 含量分別增加了28.34%、39.37%和57.82%，表明AMF 接種能夠增加Pro 含量，但隨著鹽濃度增加，AMF 接種的楨楠Pro 含量呈先升后降的趨勢，當(dāng)鹽濃度超出一定范圍（在本試驗中為200 mmol·L-1）時Pro 含量便下降。這與沙棗、小麥[24]、麻黃[25]等在鹽脅迫下接種AMF 后Pro 含量的變化規(guī)律一致。

對鹽脅迫下大麥和小麥[26]等葉片脂質(zhì)過氧化的研究發(fā)現(xiàn)，鹽分可以增加膜的透性，增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化作用。SOD、POD、CAT 及APX 是植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，通過相互協(xié)調(diào)來清除活性氧和丙二醛[27]。本研究中，AMF 接種比未接種的楨楠SOD、POD、CAT 和APX 活性均增加，表明AMF 能夠提高楨楠的抗氧化酶活性；本試驗中，NaCl 濃度為200 mmol·L-1時，SOD、POD、CAT和APX 活性均下降，這與張勇等[28]的研究結(jié)果一致，紅芪在低鹽脅迫下通過提高SOD、POD 活性來加強(qiáng)自身的耐鹽性，但當(dāng)鹽濃度超出一定范圍時，SOD、POD 活性便開始下降，這說明雖然植物在受到鹽脅迫時能夠通過提高自身酶活性來清除有害離子，但一旦超過一定濃度范圍便會導(dǎo)致保護(hù)酶活性下降，其保護(hù)作用大大降低。