萬 青，王 珺，劉銅梅

（南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046）

鹽酸法舒地爾（Fasudil Hydrochloride）是一種擁有廣泛藥理作用的新型藥物，是5-異喹啉磺酰胺的衍生物，為世界上首個(gè)Rho 激酶（Rho-associated kinases，ROCK）抑制劑，可通過增加肌球蛋白輕鏈磷酸酶的活性來擴(kuò)張血管，降低內(nèi)皮細(xì)胞的張力，改善腦組織的微循環(huán)，不會(huì)產(chǎn)生或加重腦的盜血，同時(shí)可以拮抗炎性因子，保護(hù)神經(jīng)抗凋亡，促進(jìn)神經(jīng)的再生。因此，鹽酸法舒地爾對(duì)促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，減輕臨床癥狀，減少病殘率有一定的療效[1-2]。鹽酸法舒地爾及其注射液由日本旭化成株式會(huì)社和名古屋大學(xué)聯(lián)合開發(fā)，1995 年在日本上市，2001 年在國(guó)內(nèi)上市，臨床上該藥主要用于蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣等引起的缺血性腦血管疾病的癥狀改善[3-6]。

鹽酸法舒地爾化學(xué)名稱為六氫-1-(5-磺酰基異喹啉)-1(H)-1,4-二氮雜草鹽酸鹽，結(jié)構(gòu)見圖1。以5-異喹啉磺酰氯為起始物料，與溶劑反應(yīng)后形成鹽酸鹽，再與高哌嗪（結(jié)構(gòu)式見圖2）進(jìn)行縮合反應(yīng)，制備得到法舒地爾后，再經(jīng)成鹽、精制，得到鹽酸法舒地爾。不同的反應(yīng)路線，使用的溶劑有所不同，包括二氯甲烷、三氯甲烷和四氫呋喃等[7-8]。很多文獻(xiàn)報(bào)道的鹽酸法舒地爾的測(cè)定方法，會(huì)殘留溶劑、有關(guān)物質(zhì)及注射液細(xì)菌內(nèi)毒素[9-13]。高哌嗪作為鹽酸法舒地爾的原料和降解產(chǎn)物，生產(chǎn)過程中必須對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，但其含量的測(cè)定方法鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

圖1 鹽酸法舒地爾的分子結(jié)構(gòu)圖

圖2 高哌嗪的分子結(jié)構(gòu)圖

高哌嗪在鹽酸法舒地爾原料中的含量較低，且沒有紫外吸收，極性大，在常規(guī)的反相色譜柱上保留較弱，因此無法使用常規(guī)的液相方法進(jìn)行分析。陳梅蘭等人[14]公開了一種高哌嗪的檢測(cè)方法，采用離子色譜法進(jìn)行測(cè)定，缺點(diǎn)是操作繁瑣，樣品需要通過固相萃取的小柱。氣相色譜法（GC）具有靈敏度和選擇性高、樣品用量少、定量精度高、定性重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，近年來也被應(yīng)用于藥物及合成中間體的分析。本文采用氣相色譜法，建立了快速檢測(cè)鹽酸法舒地爾中高哌嗪含量的方法。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法的靈敏度、精密度及回收率均較好，可以為鹽酸法舒地爾原料藥的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與藥品

1.1 儀器

天美7890F 氣相色譜儀，浙大N2000 數(shù)據(jù)工作站。XP205DR 型10 萬分之一電子天平。

1.2 藥品

鹽酸法舒地爾供試品（南京正大天晴制藥有限公司，批號(hào)110805），鹽酸法舒地爾工作對(duì)照品（安徽省新星藥物開發(fā)有限責(zé)任公司，批號(hào)20110405），高哌嗪（南京正大天晴制藥有限公司，批號(hào)20110405），純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：以(5%-苯基)-甲基聚硅氧烷為固定相，Agilent CP-Sil 8 CB，30m×0.32mm×1.0μm 的毛細(xì)管柱。進(jìn)樣口溫度為200℃，檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為250℃，載氣為氮?dú)?，柱流?.0mL·min-1，柱溫為100℃，流量5mL·min-1，進(jìn)樣量1.0μL。

2.2 溶液的制備

空白溶劑：純化水。

高哌嗪貯備液的制備：精密稱取高哌嗪對(duì)照品99.30mg，置于10mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，備用。

高哌嗪對(duì)照品溶液的制備：精密量取高哌嗪貯備液適量，加水溶解并稀釋成高哌嗪含量為0.5mg·mL-1的溶液，搖勻，備用。

鹽酸法舒地爾溶液的配制：精密稱取鹽酸法舒地爾適量，加水溶解并稀釋成濃度為500.0mg·mL-1的溶液，搖勻，備用。

加標(biāo)供試品溶液的配制：精密稱取鹽酸法舒地爾適量，加入高哌嗪貯備液適量，加水溶解并稀釋至刻度，配制成鹽酸法舒地爾含量為500.0mg·mL-1、高哌嗪含量為0.5mg 的混合溶液。

2.3 檢測(cè)限和定量限

量取高哌嗪貯備液適量，按信噪比10∶1 進(jìn)行逐級(jí)稀釋，配置定量限溶液。按信噪比3∶1 逐級(jí)稀釋，配置檢測(cè)限溶液。精密量取各溶液1.0μL，注入色譜儀，進(jìn)樣分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。從表1 可知，高哌嗪的檢測(cè)限為1ng，相當(dāng)于供試品濃度0.01%，定量限為2ng，相當(dāng)于供試品濃度0.02%，表明該方法的靈敏度較好。

表1 檢測(cè)限與定量限的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 線性實(shí)驗(yàn)

分別精密量取高哌嗪貯備液0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL，置于5 個(gè)10mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，制得濃度依次為0.099、0.248、0.497、0.993、1.986mg·mL-1的一系列溶液，相當(dāng)于限度濃度的10%、25%、50%、100%、200%。

按照選定的色譜條件，精密量取各溶液1.0μL注入氣相色譜儀，每份線性溶液進(jìn)樣2 針，記錄色譜圖。以溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸方程并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。在0.099～1.986mg·mL-1范圍內(nèi)，高哌嗪的進(jìn)樣濃度與峰響應(yīng)值呈顯著的線性關(guān)系，高哌嗪的線性方程為：y=381884x+3117.7，相關(guān)系數(shù)r為0.9999。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、圖3。

表2 高哌嗪的線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 高哌嗪的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度

2.5.1 中間精密度

量取加標(biāo)供試品溶液，按照設(shè)定的色譜條件，采用不同的人員、不同的時(shí)間以及不同的設(shè)備，連續(xù)進(jìn)樣，根據(jù)6 份重復(fù)性結(jié)果，計(jì)算12 份加標(biāo)供試品溶液中高哌嗪的含量，結(jié)果顯示，RSD為0.82%（n=12)，表明該方法的中間精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性

按照2.2 的方式配制6 份加標(biāo)供試品溶液，注入氣相色譜儀，按照擬定的色譜條件，記錄色譜圖，按照外標(biāo)法計(jì)算6 份溶液中高哌嗪的含量，檢出量的平均值為0.96%，RSD 為0.96%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.3 進(jìn)樣精密度

精密量取2.4 中線性濃度為0.497mg·mL-1的溶液1.0μL，注入氣相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次，考察儀器的進(jìn)樣精密度，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，連續(xù)進(jìn)樣6 次，高哌嗪的峰面積RSD 為0.82%，表明該方法的進(jìn)樣精密度良好。

表3 高哌嗪進(jìn)樣精密度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

稱取適量鹽酸法舒地爾9 份，平均分為3 組，加入高哌嗪對(duì)照品適量，使得供試品溶液中高哌嗪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為限度的50%、100%、150%，按照設(shè)定的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，測(cè)定各濃度水平下的回收率，結(jié)果見表4。按外標(biāo)法計(jì)算高哌嗪的含量和回收率，高哌嗪的總平均準(zhǔn)確度為99.48%，RSD 為0.63%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表4 高哌嗪回收率的測(cè)定結(jié)果

2.7 溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在室溫條件下，將高哌嗪對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別放置0、1、2、4、6、8h 后進(jìn)樣分析，考察8h內(nèi)，高哌嗪與鹽酸法舒地爾的峰面積、保留時(shí)間和含量的變化情況，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)下，高哌嗪對(duì)照品的保留時(shí)間、峰面積無明顯變化，RSD 為0.95%，表明高哌嗪對(duì)照品溶液在室溫條件下8h 內(nèi)穩(wěn)定。供試品溶液在室溫條件下放置8h，不同時(shí)間點(diǎn)下均未檢出高哌嗪，供試品溶液在室溫下8h 內(nèi)穩(wěn)定。因此，高哌嗪與鹽酸法舒地爾在室溫下放置8h，能保持穩(wěn)定。

表5 高哌嗪溶液穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 耐用性

適當(dāng)調(diào)整色譜條件的參數(shù)[柱溫(100±5)℃、進(jìn)樣口溫度(200±5)℃、檢測(cè)器溫度(200±5)℃、柱流速(4.0±0.2)mL·min-1]，取加標(biāo)供試品溶液1.0μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。不同的色譜條件下，供試品中高哌嗪的含量基本一致，檢出量的極差均小于0.01%，說明該方法的耐用性良好。

2.9 樣品的測(cè)定

高哌嗪是合成鹽酸法舒地爾的一種起始物料，也是反應(yīng)過程中的降解雜質(zhì)。根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局相關(guān)文件的要求，原料藥中高哌嗪的含量不得超過0.1%[15]。取某公司生產(chǎn)的3 批鹽酸法舒地爾原料藥，按方法學(xué)驗(yàn)證后的高哌嗪檢測(cè)方法（氣相色譜法）對(duì)樣品中的高哌嗪進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表6。結(jié)果表明，3 批次的鹽酸法舒地爾原料中均未檢出高哌嗪，結(jié)果符合限度（不超過0.1%）要求。

表6 3批樣品中高哌嗪的檢測(cè)結(jié)果

2.10 色譜柱的篩選

根據(jù)高哌嗪的芳香族結(jié)構(gòu)極性特點(diǎn)，本文分別選擇了通用固定相的DB-5、HP-5、CP-Sil 5 CB、CP-Sil 8 CB 等毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行測(cè)定。在高哌嗪的檢測(cè)過程中，除CP-Sil 8 CB 毛細(xì)管色譜柱外，其它3 款色譜柱均因高哌嗪的靈敏度低而無法達(dá)到檢測(cè)要求。CP-Sil 8 CB 毛細(xì)管色譜柱表現(xiàn)出較高的靈敏度和重現(xiàn)性，具有非常高的柱效，能滿足檢測(cè)的定量需求，故選用該毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié)論

本文采用氣相色譜法測(cè)定鹽酸法舒地爾中的高哌嗪，定量檢測(cè)的結(jié)果理想，具有分析速度快、準(zhǔn)確度高、靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)，可為鹽酸法舒地爾的生產(chǎn)提供有效的質(zhì)控方法。