朱永軍 張婉華 林鷙 何錫忠 彭麗英

摘 ?要：將豬細(xì)小病毒S-1A株在不同的細(xì)胞中培養(yǎng)，測(cè)定病毒含量，以確定適合豬細(xì)小病毒S-1A株增殖的細(xì)胞。結(jié)果表明：豬細(xì)小病毒S-1A株能在豬腎傳代細(xì)胞系（PK-15）、豬腎原代細(xì)胞（PK）、豬睪丸細(xì)胞（ST）和仔豬腎細(xì)胞（IBRS-2）中生長(zhǎng)增殖，不能在幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系（BHK-21）、綠猴腎細(xì)胞（Vero）和雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）中增殖；當(dāng)ST細(xì)胞生長(zhǎng)至2/3單層時(shí)，將豬細(xì)小病毒S-1A株種毒液100倍或1 000倍稀釋后接種ST細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)96～144 h，獲得的病毒載量最高。

關(guān)鍵詞：豬細(xì)小病毒S-1A株；ST細(xì)胞；培養(yǎng)條件

中圖分類號(hào)：S816.79 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2023）03-0041-04

豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一[1]。1966年，Mayr在進(jìn)行豬瘟病毒組織培養(yǎng)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)PPV，通過(guò)核酸鑒定證明為DNA病毒[2]。豬細(xì)小病毒病的主要特征是懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死產(chǎn)、胚胎死亡和胎兒木乃伊化，而母豬本身不表現(xiàn)臨床癥狀，其他豬感染后也無(wú)明顯的臨床癥狀[3-4]。

豬細(xì)小病毒能在豬的細(xì)胞（包括豬睪丸細(xì)胞、豬腎原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞系）和人的某些傳代細(xì)胞系中培養(yǎng)增殖[1]，適合在正處于有絲分裂期的細(xì)胞內(nèi)增殖。細(xì)胞感染豬細(xì)小病毒后初期呈現(xiàn)彌漫性顆粒樣病變，隨后細(xì)胞圓縮、拉網(wǎng)、脫落。1982年，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所用仔豬腎原代細(xì)胞從上海郊區(qū)某豬場(chǎng)所產(chǎn)的死胎中分離到一株P(guān)PV，將其在細(xì)胞上連續(xù)傳代、純化，獲得一株具有良好的免疫原性的PPV強(qiáng)毒株，命名為PPVS-1A株。本研究將PPVS-1A株在不同的細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)，以獲得一種適合該病毒的細(xì)胞，并優(yōu)化其培養(yǎng)條件。

1 ?試驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞與病毒

豬腎傳代細(xì)胞系（PK-l5）、豬睪丸細(xì)胞（ST）、仔豬腎細(xì)胞（IBRS-2）、綠猴腎細(xì)胞（Vero）、幼倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞系（BHK-21），均由本實(shí)驗(yàn)室保存。豬腎原代細(xì)胞（PK）、雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），均由本實(shí)驗(yàn)室按常規(guī)方法制備。

PPVS-1A株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定、傳代并保存。

1.2 培養(yǎng)基

DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清，購(gòu)自GIBCO公司；胰酶購(gòu)自Sigma公司。

細(xì)胞生長(zhǎng)液為含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞維持液為含2％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

2 ?試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞接種

按常規(guī)方法培養(yǎng)或制備PK-15、BHK-21、IBRS-2、PK、ST、Vero和CEF細(xì)胞單層。用PPVS-1A株病毒液接種細(xì)胞，置37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)并記錄。當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)達(dá)75％以上時(shí)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，并測(cè)定病毒含量；沒(méi)有細(xì)胞病變效應(yīng)的細(xì)胞均于接毒后7 d收獲，－70 ℃凍融3次后傳代，盲傳3代，每代均觀察有無(wú)細(xì)胞病變效應(yīng)。

2.2 病毒含量測(cè)定

用細(xì)胞生長(zhǎng)液將種毒液作10倍系列稀釋，4個(gè)稀釋度10－4、10－5、10－6、10－7 ，分別接種有絲分裂期的相應(yīng)細(xì)胞（96孔細(xì)胞培養(yǎng)板），每個(gè)稀釋度接種4孔，每孔0.1 mL，同時(shí)設(shè)細(xì)胞陰性對(duì)照孔，接種后，置37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，測(cè)定病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（50％ tissue culture infectious dose，TCID50）。

2.3 血凝試驗(yàn)

在96孔板的第1孔至第12孔，每孔加入磷酸鹽緩沖液（0.01 M，pH＝7.4）0.05 mL，取被檢樣品0.05 mL，從第1孔起，依次作 ? 2倍系列稀釋，至最后一個(gè)孔，每孔加入0.5％豚鼠紅細(xì)胞懸液0.05 mL，并設(shè)紅細(xì)胞對(duì)照孔，搖勻，置25～28 ℃作用35～45 min后觀察結(jié)果，并記錄。

2.4 最佳接毒劑量的確定

將PPVS-1A株種毒液分別稀釋10倍、100倍、1 000倍、10 000倍后接種ST細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)。當(dāng)75％以上的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)時(shí)收獲細(xì)胞毒液，－70 ℃反復(fù)凍融3次，分別測(cè)定TCID50。TCID50最高的接毒劑量為最佳接毒劑量，且血凝效價(jià)大于1∶1 024。

2.5 最佳接毒時(shí)間的確定

分別采用病毒與ST細(xì)胞同步接種、形成2/3細(xì)胞單層接種及形成良好單層接種這三種方法來(lái)接種PPVS-1A株病毒液，37 ℃培養(yǎng)。當(dāng)75％以上的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)時(shí)收獲細(xì)胞毒液，－70 ℃反復(fù)凍融3次，分別測(cè)定TCID50。TCID50最高的接毒時(shí)間為最佳接毒時(shí)間，且血凝效價(jià)大于1∶1 024。

2.6 最佳收毒時(shí)間的確定

將PPVS-1A株病毒液接種ST細(xì)胞，分別于37 ℃培養(yǎng)60 h、72 h、84 h、96 h、120 h、144 h后收獲細(xì)胞毒液，－70 ℃反復(fù)凍融3次后，分別測(cè)定其病毒含量（TCID50），以TCID50最高者的收毒時(shí)間為最佳收毒時(shí)間，且血凝效價(jià)大于1∶1 024。

3 ?試驗(yàn)結(jié)果

3.1 細(xì)胞適應(yīng)性結(jié)果

將PPVS-1A株病毒液接種PK-15、PK、ST、IBRS-2細(xì)胞，第1代細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、拉網(wǎng)、脫落，當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)達(dá)到75％以上時(shí)收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。接種BHK-21、Vero和CEF細(xì)胞均未出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，盲傳3代也未有細(xì)胞病變效應(yīng)。

3.2 病毒含量測(cè)定結(jié)果

取上述細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次后接種同種細(xì)胞，計(jì)算病毒含量。ST細(xì)胞增殖的病毒含量為107.50 TCID50/mL；PK-15細(xì)胞增殖的病毒含量為107.25 TCID50/mL；PK細(xì)胞增殖的病毒含量為107.00 TCID50/mL；IBRS-2細(xì)胞增殖的病毒含量為106.25 TCID50/mL；其他幾種細(xì)胞接種后均未出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，盲傳3代的原代培養(yǎng)物均未測(cè)出PPVS-1A株病毒。

3.3 最佳接毒劑量

試驗(yàn)結(jié)果顯示，種毒液稀釋10倍后接種細(xì)胞，收獲細(xì)胞時(shí)測(cè)得的病毒含量為106.00～106.25 TCID50/mL；種毒液稀釋100倍后接種細(xì)胞，收獲細(xì)胞時(shí)測(cè)得的病毒含量為107.00～107.50 TCID50/mL，且血凝效價(jià)均大于1∶1 024；種毒液稀釋1 000倍后接種細(xì)胞，收獲細(xì)胞時(shí)測(cè)得的病毒含量為107.00～ ? ?107.50 TCID50/mL，且血凝效價(jià)大于1∶1 024；種毒液稀釋10 000倍后接種細(xì)胞，收獲細(xì)胞時(shí)測(cè)得的病毒含量為106.00～106.75 TCID50/mL。試驗(yàn)表明，最佳接毒劑量為種毒液稀釋100或1 000倍。詳見(jiàn)表1。

3.4 最佳接毒時(shí)間

結(jié)果顯示，細(xì)胞形成2/3單層時(shí)接種病毒，病毒含量最高，且血凝效價(jià)大于1∶1 024。其次是同步接種，最后是形成良好單層時(shí)接種。試驗(yàn)表明，細(xì)胞形成2/3單層時(shí)接種PPVS-1A株最佳。詳見(jiàn)表2。

3.5 最佳收毒時(shí)間

結(jié)果表明，接毒后96～144 h收毒，細(xì)胞病變效應(yīng)可達(dá)75％以上，病毒含量在107.25 TCID50/mL以上，且血凝效價(jià)大于1∶ 1 024。詳見(jiàn)表3。

4 ?討論

本研究對(duì)細(xì)胞適應(yīng)性得出的結(jié)果與Bergeron等[5]、Cartwright等[6]和Wu等[7]國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果相似，結(jié)果表明，PPVS-1A株能在PK-15、PK、ST和IBRS-2等豬源細(xì)胞中增殖，不能在BHK-21、Vero和CEF細(xì)胞中增殖。PK細(xì)胞是原代細(xì)胞，制備繁瑣且原材料來(lái)源受限；IBRS-2細(xì)胞增殖的病毒含量較低；PK-15細(xì)胞增殖的病毒含量較高，但PK-15細(xì)胞易于污染豬圓環(huán)病毒；ST細(xì)胞為傳代細(xì)胞系，細(xì)胞形態(tài)好，生長(zhǎng)快，易于培養(yǎng)，增殖的病毒含量較高。因此，本研究選用ST細(xì)胞系來(lái)增殖PPVS-1A株。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，PPVS-1A株在ST細(xì)胞系上的最佳培養(yǎng)條件為：在細(xì)胞形成2/3單層時(shí)接種培養(yǎng)，種毒液稀釋100倍或1 000倍后接種，置37 ℃培養(yǎng)96～144 h。

趙潤(rùn)澤等[8]和趙文影等[9]對(duì)河南、北京、江蘇、安徽等地區(qū)PPV流行情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示2021年的PPV核酸檢出率比2020年的明顯升高，說(shuō)明目前豬細(xì)小病毒病已普遍存在于豬群中，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究對(duì)PPVS-1A株的細(xì)胞適應(yīng)性和在ST細(xì)胞系上的最佳培養(yǎng)條件的研究為豬細(xì)小病毒病疫苗的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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[9] 趙文影，張?jiān)旗o，白小飛，等．豬細(xì)小病毒BJ2株的分離鑒定及全基因組序列分析[J]．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，52（2）：136-144．