韓 苗,曹明磊,2,段文增,龔樹文

(1. 聊城大學 化學化工學院 聊城 252059; 2. 山東信發(fā)瑞捷新材料科技有限公司 聊城 252000)

1 引言

氨基酸是自然界中普遍存在的重要有機分子,在化學、生物工業(yè)和實驗室中也隨處可見[1,2]。其兩種構型中L-氨基酸是構成生物體蛋白質的基本單位,與生物體的生命活動有著密切關系;非天然的D-氨基酸雖然不是構成蛋白質的基本結構單元,但廣泛存在于真核肽、細菌和動物(包括人類)中[3-5]。游離氨基酸不僅可用于營養(yǎng)補充和食品加工,在生物系統(tǒng)中發(fā)揮多種功能,它們還是制備結構多樣的有機化合物的起始材料。如在不對稱合成中,光學活性氨基酸通常被用作手性源。因此,由于氨基酸的重要作用,許多分析工具被開發(fā)用來研究氨基酸,特別是對其對映體的鑒別[6,7]。

近幾年,利用分子探針對手性氨基酸的對映選擇性熒光識別已經(jīng)成為化學家們研究的熱點,很多探針被設計合成出來并展現(xiàn)出優(yōu)異的不對稱識別效果[8-17]。這些探針可以用于快速分析不對稱反應或生物過程產(chǎn)生的氨基酸的對映體組成。與用熒光分子探針分析非手性底物不同,熒光分子探針分析非手性底物通常只需要獲得一個參數(shù),即底物的濃度,而手性氨基酸的分析需要確定兩個參數(shù),包括濃度和對映體組成。因為濃度和對映體組成都會影響熒光響應,所以通常需要有兩種獨立的方法來確定這兩個參數(shù)。如果在不分離氨基酸對映體的情況下只使用一個熒光探針同時獲得氨基酸的濃度和對映體組成,這將是一個重大的挑戰(zhàn)。使用一種熒光分子探針同時進行濃度和對映體組成測定,這種“一石二鳥”的策略存在很多優(yōu)點:(1) 檢測方法簡單,成本較低;(2) 不需要分離手性底物;(3) 高靈敏度、高選擇性;(4) 具有安全性和很強的復用能力。因此,本文在前期研究的基礎上[18],結合近幾年手性熒光分子探針手性識別氨基酸進展,重點綜述了四種可同時檢測氨基酸的濃度和對映體的組成的熒光化合物,并對其設計合成理念和雙響應識別機制進行了詳細研究。第一種雙響應熒光分子探針(R)-4,當(R)-4在Zn(OAc)2的存在下被各種手性胺處理時,會與2-萘胺發(fā)生換位反應,由于2-萘胺恢復發(fā)射,其在λ3=427 nm(I3)處顯示出較大的熒光增強。剩余的手性二萘基單元與手性底物結合,在λ4>500 nm(I4)處產(chǎn)生高度對映選擇性的熒光增強。由于I3只依賴于濃度,不依賴于手性構型,因此它可以測定底物濃度。而I4依賴于手性構型,所以它可以測定對映體的組成。因此,可以使用一個熒光探針和一次熒光測量,同時確定底物濃度和對映體組成[19]。第二種雙響應熒光分子探針(R)-9,它是一種由1,1′-聯(lián)二萘酚(BINOL)和香豆素制成的新型熒光探針,其在中性緩沖溶液中,以λ5=365 nm激發(fā)時,與氨基酸作用,在465 nm處顯示熒光增強,但兩種對映體之間的差異非常小。當在λ6=467 nm激發(fā)時,在534 nm處表現(xiàn)出高度的對映選擇性熒光增強。這樣通過調整不同的激發(fā)波長就可以同時測定氨基酸的濃度和對映體組成[20]。第三種雙響應熒光分子探針(S)-12,當(S)-12被組氨酸和Zn2+處理時,可以產(chǎn)生一種六配位的Zn(II)配合物,限制BINOL單元的旋轉,從而顯示熒光增強。同時由于組氨酸的L-和D-對映體可能導致六配位的Zn(II)配合物的穩(wěn)定性或結構剛性不同,從而進行不同的對映體選擇性反應。其他氨基酸沒有組氨酸的咪唑取代基,不能產(chǎn)生六配位的配體結構,從而在不同激發(fā)波長下,組氨酸的濃度和對映選擇性可以被(S)-12同時檢測到[21]。第四種雙響應分子探針(S)-17是一種具有多個活性檢測位點的BINOL熒光探針。當(S)-17被精氨酸處理時,兩個醛基與精氨酸的氨基進行縮合,丙烯酸酯提供一個額外的反應位點,只與特定的精氨酸對映體進行Michael加成形成環(huán)狀化合物,雖然未反應完全,但經(jīng)歷了強烈的ICT(分子內(nèi)電荷轉移)發(fā)出強烈的熒光,從而可以同時檢測精氨酸濃度和對映體組成[22]。

2 第一個雙響應熒光探針的發(fā)現(xiàn)

2012年有文章報道了1,1′-聯(lián)二萘酚(BINOL)基三氟甲基酮(S)-1(表1)在手性二胺的熒光識別中的應用[23]。發(fā)現(xiàn)非熒光化合物(S)-1在與反式-1,2-環(huán)己二胺的兩個對映體相互作用時,在λ1=370 nm和λ2=438 nm處顯示雙重熒光增強,在λ1處,(S)-1對兩種對映體都有較大的熒光增強作用,但對映選擇性很小;在λ2處,(R,R)-反式-1,2-環(huán)己二胺對熒光的增強作用遠大于(S,S)對映體。因此,在λ1處的熒光響應可測定環(huán)己二胺的濃度,而在λ2處的熒光響應可測定手性二胺的對映體組成。自此,可同時測定濃度和對映體組成的單分子熒光傳感器開始迅速發(fā)展。

表1 文中化合物名稱縮寫及結構

盡管(S)-1可用于手性二胺的濃度和對映選擇性識別,但其不適用于檢測手性氨基酸,不過其雙重響應檢測機制是相通的。這一發(fā)現(xiàn)促使Pu實驗室提出了一種潛在的通用策略,將對映選擇性熒光傳感器轉化為同時測定手性化合物濃度和對映體組成的雙響應熒光傳感器[19]。如圖1所示,將發(fā)射波長為λ1的非手性熒光團A連接到對映選擇性熒光傳感器B上。選擇B的標準是該傳感器與手性底物在不同波長λ2的相互作用下顯示對映選擇性熒光增強。將A和B之間引入適當?shù)逆I,以使A的熒光在[A +B]雙單元中猝滅。再結合一種連鎖裂解機制,以允許添加手性底物時釋放出A在λ1處恢復其發(fā)射。因此,在λ1處的熒光增強與底物濃度密切相關,其受對映體組成的影響可以忽略。鍵斷裂后,得到的B與底物的對映體結合后,在λ2處應表現(xiàn)出對映選擇性熒光增強。因此,[A + B]雙單元可用于測定λ1處的底物濃度和λ2處的對映體組成,即一次熒光測量可以給出兩個參數(shù)結果。

圖1 將對映選擇性熒光傳感器轉換為雙重響應傳感器的擬議一般策略[19]

圖2 雙響應熒光分子探針(R)-4的合成路線

3 雙響應熒光分子探針(R)-4研究進展

3.1 雙響應熒光分子探針(R)-4的設計與合成

圖3 在(S, S)-5和(R, R)-5存在的條件下,(R)-4 + ZnII的熒光光譜[18]

2014年研究報道了(R)-2與Zn2+結合得到的對映選擇性熒光傳感器[24],其可廣泛應用于二胺、氨基醇和氨基酸等手性功能胺的識別研究。在Zn2+存在下,(R)-2與手性功能胺反應,在λ>500 nm(λ4)處表現(xiàn)出高度的對映選擇性熒光增強。根據(jù)圖1中提出的同時測定濃度和對映體組成的策略可將該化合物設計為雙響應熒光傳感器。將(R)-2與化合物3縮合生成相應的席夫堿(R)-4(圖2)[19],產(chǎn)率為33%。該反應為親核加成反應,由于(R)-2有兩個醛基,會與3形成單取代的席夫堿,所以產(chǎn)率不高,但是該反應產(chǎn)物易分離提純,實驗操作較簡單。在(R)-4生成過程中,化合物3在427 nm(λ3)處的強發(fā)射被猝滅,這可能是由于該化合物中雙酚羥基氫與亞胺氮之間的分子內(nèi)氫鍵作用,這表明化合物(R)-4可作為圖1中所示的雙單元[A + B]傳感器。同時,在Zn2+存在下用氨基酸處理時,(R)-4的2-萘胺單元可被更堿性的脂肪胺取代恢復427 nm(λ3)的發(fā)射,由此形成的新的亞胺-鋅配合物在λ>500 nm(λ4)時應顯示對映選擇性熒光增強峰,可直接用于(R)-4 + ZnII對氨基酸的對映選擇性熒光識別。

3.2 雙響應熒光分子探針(R)-4的響應機制

Pu等人首先研究了在Zn2+的存在下,(R)-4對反式-1,2-環(huán)己二胺(S,S)-5和(R,R)-5對映體的熒光響應[19]。當(R)-4(在CH3OH / 2 % CH2Cl2中2.0 × 10-5mol·L-1)用Zn(OAc)2(4.0 × 10-5mol·L-1)處理時,由于Zn2+與亞胺單元的相互作用,它在555 nm處發(fā)出一個微弱的發(fā)射信號。當用(S,S)-5(1.5 × 10-2mol·L-1)處理(R)-4 + Zn(II)溶液時,在λ3=427 nm和λ4=525 nm的雙發(fā)射下觀察到較大的熒光增強。當使用對映體(R,R)-5與(R)-4相互作用時,在λ3=427 nm處觀察到相同的熒光增強,但在λ4處的熒光增強峰要小得多。因此,在λ3處的發(fā)射與手性構型無關,而λ4處的發(fā)射具有高度的對映選擇性識別(圖3),這樣就得到了一種用于識別手性胺的雙響應熒光傳感器。

圖4解釋了觀察到的雙響應熒光識別的機制。(R)-4 + Zn(II)配合物與手性胺的亞胺發(fā)生換位反應釋放化合物3,以恢復其在λ3=427 nm處的發(fā)射,而且Zn2+的存在并沒有改變化合物3的熒光。與手性胺反應形成的新的BINOL-亞胺-ZnII配合物(R)-6在λ>500 nm處產(chǎn)生對映選擇性發(fā)射,該發(fā)射與之前報道的在Zn2+存在下直接使用(R)-2熒光識別的情況幾乎一致,但是引入2-萘胺基后,可以產(chǎn)生雙重響應熒光測試。

圖4 (R)-4 + ZnII與手性胺的亞胺換位反應

在Zn2+存在下,(R)-4還可以對手性氨基酸進行雙熒光響應識別,這些氨基醇包括丙氨酸、谷氨酸、組氨酸、絲氨酸和苯丙氨酸。以(R)-4對苯丙氨酸的手性識別為例,如圖5a, b所示,在(R)-4(2.0 × 10-5mol·L-1/2 % CH2Cl2)的混合溶液中加入L-苯丙氨酸和四丁基銨后,在λ1=427 nm和λ2=509 nm下均產(chǎn)生熒光增強,但是短波長下熒光增強的幅度小于長波長熒光增強。圖5c繪制了(R)-4 + ZnII在λ=427 nm下對不同濃度的L-和D-苯丙氨酸的熒光強度I427。結果表明,氨基酸的手性構型對I427幾乎沒有影響,可用于檢測氨基酸濃度。圖5d繪制了I509與L-和D-苯丙氨濃度的對比圖,該圖說明在波長為509 nm下,(R)-4對苯丙氨酸顯示了優(yōu)異的對映選擇性識別效果。

同時,該文章還研究了(R)-4(2.0 × 10-5mol·L-1在CH3OH / 2 %二氯甲烷)+ZnII(2當量)傳感溶液與苯丙氨酸和氫氧化四丁基銨在不同濃度和對映體組成下的熒光響應?？紤]到僅氨基酸的濃度影響I427,作者得到了I427、I509和L-苯丙氨酸的三維圖(圖6),其中I509與底物的手性構型有很強的相關性。因此,通過對映體組成的可以確定苯丙氨酸的不同對映體組成和濃度。因此,三維圖一次熒光測試同時得到氨基酸濃度和對映體組成。

圖6 (R)-4 +ZnII對不同濃度和不同對映體組成的苯丙氨酸在I427和I527處的熒光響應[19]。

4 雙響應熒光分子探針(R)-9研究進展

4.1 雙響應熒光分子探針(R)-9的設計與合成

由BINOL衍生的手性醛與Zn2+結合,對手性氨基酸具有對映選擇性熒光增強[24,25]。據(jù)報道,一種非手性香豆素醛在氨基酸中不需要添加Zn2+即可增強熒光,但沒有對映選擇性[26]。因此,Pu課題組將BINOL的手性結構與香豆素醛結構[27-29]結合,在沒有Zn2+的情況下對手性氨基酸進行對映選擇性熒光識別。9含有兩個親電位點,分別可以與氨基酸的氨基進行1,2-親核加成[14]和1,4-親核加成[30,31]。這兩種反應途徑產(chǎn)生不同的熒光。其中手性聯(lián)二萘結構可以為親核加成提供立體控制,與聯(lián)二萘基連接的吡啶基可為氨基酸提供額外的結合位點,以增強手性偏倚。

將香豆素氯化物(8)[32,33]與(R)-聯(lián)二萘酚和2-溴甲基吡啶的氫溴酸鹽(7)在乙腈中,K2CO3的存在下混合反應,回流,制備得到(R)-9(圖7)

圖7 雙響應熒光分子探針(R)-9的合成路線

4.2 雙響應熒光分子探針(R)-9的響應機制

以(R)-9在HEPES緩沖溶液(pH=7.4)中對D/L-纈氨酸的熒光響應為例(圖8)。在HEPES溶液中,(R)-9在λ5=365 nm處激發(fā)后在λ=554 nm處顯示出一個寬發(fā)射,表明由于λ<500 nm的發(fā)射減少,聯(lián)二萘單元對萘酚-香豆素偶聯(lián)物的有效能量轉移減少。當用纈氨酸(50.0當量)處理,在365 nm處激發(fā)時,在λ=465 nm處出現(xiàn)較大的熒光增強。結果發(fā)現(xiàn),D-纈氨酸和L-纈氨酸在這種激發(fā)下都引起了類似的熒光增強。長波長(λ=554 nm)的發(fā)射減少,而短波長(λ=465 nm)的發(fā)射大大增強,表明1,4-加成會破壞萘酚單元與香豆素環(huán)的結合[30,31]。

圖8 (R)-9與D/L-Val作用的熒光譜圖[20]

當(S)-9的HEPES緩沖溶液在λ6=467 nm處被激發(fā)時,在λ=558 nm處出現(xiàn)了寬發(fā)射。結果表明,該發(fā)射帶在與纈氨酸反應時表現(xiàn)出高度的對映選擇性響應。如圖9(a,b)所示,L-Val的加入增強了(S)-9的熒光,而D-Val的加入則導致了558 nm處的熒光猝滅,而且在氨基酸存在的情況下,發(fā)射峰最大值出現(xiàn)了輕微的藍移。圖9(c)比較了(S)-9與100當量D-Val和L-Val反應后的熒光光譜,得到了在λ=534 nm時的熒光比IL/ID為12.5。從圖9d可以看出,IL/ID所代表的對映選擇性隨著氨基酸濃度的增加而增加,在氨基酸為100當量時達到最大值。具體反應過程是:(S)-9(1.0 mmol/L在DMSO中,1.0當量)與L-Val和D-Val(5.0～100.0當量)在HEPES緩沖液中反應2 h,然后用HEPES稀釋至1.0 × 10-5mol·L-1。將得到的溶液放置1小時后,觀察并記錄了相對穩(wěn)定的熒光響應。這種增強的長波長發(fā)射[λ=467(激發(fā)) / 534(發(fā)射) nm]與短波長的熒光響應[λ=365(激發(fā))/465(發(fā)射) nm]對比表明,這兩種熒光響應于(S)-9與氨基酸的不同反應。也就是說,在萘酚單位和香豆素環(huán)之間的結合保留過程中,加入的氨基酸促進了在探針上的1,2-加成反應形成了亞胺。

圖9 (S)-9與(a)L-Val,(b)D-Val,(c)L-和D-Val及(d)534 nm時的熒光強度比IL/ID與纈氨酸濃度的熒光譜圖[20]

圖10 (R)-9和(S)-9在534 nm處的熒光強度與纈氨酸對映體組成的對應關系[20]

圖10研究了在不同對映體組成下(S)-9和(R)-9對纈氨酸的熒光響應。圖中繪制了該對映體探針在534 nm處的熒光強度與纈氨酸的對映體過量值[ee=([L]-[D])/([L]+[D])]的關系,結果顯示了該對映體探針與對映體過量值間的鏡像關系,可用于確定氨基酸的對映體組成。

當激發(fā)波長為365 nm時,氨基酸的兩個對映體與探針作用;然而,當激發(fā)波長為467 nm時,氨基酸的一個對映體增強了探針的熒光,而另一個對映體則。因此,對于該熒光探針,當在365 nm處激發(fā)時可以測定氨基酸的濃度,在467 nm處激發(fā)可以測定對映體的組成。

5 雙響應熒光分子探(S)-12研究進展

5.1 雙響應熒光分子探針(S)-12的設計與合成

此前,研究發(fā)現(xiàn)當BINOL的二醛(R)-2與Zn(II)結合后通過胺-醛縮合反應,Zn(II)離子配位和分子間結合,產(chǎn)生了像配合物13這樣的二聚體配合物產(chǎn)生了對映選擇性熒光增強[23]。針對這一過程,作者提出了一種兩步驟的熒光增強機制:(1) Zn(II)與亞胺的配位限制了激發(fā)態(tài)C=N鍵的異構化;(2) 大環(huán)二聚體產(chǎn)物13的形成使結構僵化,并限制了BINOL單元圍繞其1,1-鍵的旋轉[22,32]。(R)-2可以對幾種氨基酸表現(xiàn)出對映選擇性的熒光識別,但它對特定的氨基酸底物卻不能進行化學選擇性識別。為了對組氨酸等特定氨基酸進行同時具有化學選擇性和對映選擇性的熒光識別,該文章對BINOL-醛基探針的結構進行了系統(tǒng)的修飾(圖11)。

圖11 熒光探針(R)-2與氨基酸和Zn(II)的反應

該文章設計制備了單醛探針(S)-12,用于在Zn(II)存在下對組氨酸進行選擇性識別。當(S)-12與組氨酸和Zn2+反應后,可以產(chǎn)生一個像13這樣的六配位的Zn(II)配合物14,以限制BINOL單元的旋轉,從而增強熒光信號。同時因為組氨酸的L-和D-對映體會導致14的穩(wěn)定性或結構剛性不同,從而產(chǎn)生不同的對映體選擇性響應。其他的氨基酸因為沒有組氨酸的咪唑取代基不能產(chǎn)生類似配合物14的結構,從而使得組氨酸可以被(S)-12化學選擇性地檢測。因此,(S)-12和Zn(II)可以作為一種高化學選擇性和高對映選擇性識別組氨酸的熒光探針(圖12)。

圖12 (S)-12與組氨酸和Zn(II)反應形成(S)-14的反應。

探針(S)-12是在80 ℃堿存在條件下,由(S)-10[25]與11[35]反應先得到MOM保護的中間體,再用無水乙醚的氯化氫溶液去除該MOM保護基團得到的(圖13)

圖13 雙響應熒光分子探針(S)-12的合成路線

5.2 雙響應熒光分子探針(S)-12的響應機制

化合物(S)-12在378 nm激發(fā)時在470 nm處顯示發(fā)射峰〔圖14(a)〕。對于該發(fā)射峰,Zn(II)離子的加入對熒光強度沒有顯著影響。但是,當D-或L-組氨酸逐漸加入后均降低了(S)-12 + Zn(II)溶液在λ7=470 nm處的熒光強度〔圖14(a～d)〕。也就是說,在這個波長下的熒光猝滅過程與氨基酸的手性結構無關,可用于檢測不同組氨酸的濃度變化。

同時,當(S)-12 + Zn2+被組氨酸處理時,在λ8=560 nm(λexc=450 nm)處出現(xiàn)了一個新的發(fā)射峰。如圖15所示,加入D-組氨酸后該波長下熒光急劇增強,但加入L-組氨酸后熒光變化不大。因此,熒光探針(S)-12 + Zn(II)在λ8波長對組氨酸表現(xiàn)出較高的對映選擇性識別。當加入10當量組氨酸后,對映選擇性熒光增強比值[ef=(ID-I0) /(IL-I0),I0:未加D-和L-組氨酸的的熒光強度]為24.3〔圖15(a)〕0 。

圖14 (S)-12 + Zn(OAc)2與(a)D-和L-組氨酸,(b)不同濃度的D-組氨酸,(c)不同濃度的L-組氨酸的熒光譜圖,(d)在470 nm處的熒光強度與逐漸加入的D-和L-組氨酸當量之比[21]

圖15 (S)-12 + Zn(OAc)2與(a)D-和L-組氨酸,(b)不同當量的D-組氨酸,(c)不同當量的L-組氨酸的熒光譜圖,(d)在560 nm處的熒光強度與D-和L-組氨酸的當量之比[21]

當(S)-12 + Zn(II)對17對常見氨基酸(包括組氨酸)的進行熒光響應研究時,在相同的條件下,所有17個氨基酸都降低了探針在λ7=470 nm(λexc=378 nm)處的熒光強度,沒有對映選擇性響應。然而,在λ8=560 nm(λexc=450 nm)時,只有L-組氨酸顯示出顯著熒光增強(圖16)。因此,該探針(S)-12 + Zn(II)對組氨酸的熒光識別具有高度的化學選擇性。

圖16 (S)-12 + Zn(OAc)2對17種氨基酸的熒光響應[21]

6 雙響應熒光分子探(S)-17研究進展

6.1 雙響應熒光分子探針(S)-17的設計與合成

2022年,研究報道了一種基于雙BINOL的熒光傳感器,它可以化學選擇性地識別精氨酸(Arg),但它沒有表現(xiàn)出良好的對映選擇性識別效果。作者推測當加入一個活性更高的反應位點時,可以獲得一種新的、更簡化的熒光識別機制。作為候選基團,丙烯酸酯因在邁克爾加成反應中作為良好的親電試劑,廣泛應用于聚合物合成中[37,38],因此其也可用作熒光識別基團。

圖17 雙響應熒光分子探針(S)-17的合成路線

圖17提出了一種基于BINOL的熒光探針(S)-17的高效合成方法。該方法為先在氫化鈉存在的情況下,用過量的MOMBr處理(S)-BINOL,得到了雙MOM保護的BINOL(S)-15。隨后用過量的正丁基鋰脫質子化和DMF甲?；?得到中間體(S)-16。后在酸性條件下去除MOM保護基團,得到(S)-2,最后在弱有機堿二異丙基乙胺的存在下,(S)-2與丙烯酰氯反應,在BINOL環(huán)的一側得到一個丙烯酸酯,反應產(chǎn)率為39%。

圖18 (S)-17對20種氨基酸對映體的熒光響應[21]

6.2 雙響應熒光分子探針(S)-17的響應機制

在圖18中,發(fā)射波長為525 nm時,(S)-17與大多數(shù)常見氨基酸的D-或L-對映體作用時,只產(chǎn)生了非常小的熒光增強。然而,D-Arg在λ=525 nm處的熒光卻顯著增強,其強度比L-Arg高出528%。對映體選擇性比值為487。除此之外,(S)-17還具有化學選擇性,其對D-Arg的熒光響應遠遠高于其他任何一種氨基酸。因此,(S)-17僅對Arg不僅有對映選擇性識別還有化學選擇性識別。

圖19 傳感器的手性導致對精氨酸對映體的不同熒光響應[22]

圖20 手性傳感器對精氨酸對映體的對映選擇性熒光增強圖[22]

當用已知濃度的(S)-17溶液測定其對L-和D-Arg的響應,如圖19(a)所示,熒光強度隨著Arg濃度的增加而增加,當加入到5當量D-Arg,此時熒光增強峰值達到飽和。在對映體0～5當量范圍內(nèi),線性回歸系數(shù)R2>0.99。因此,確定D-Arg的檢測限(LOD)為50 nmol/L(LOD=3×SD/k,其中SD為空白標準偏差,k為校準曲線的斜率)。在相同的條件下使用(R)-17進行類似的實驗,如圖19(b)和圖19(d)所示,與L-Arg作用時下熒光顯著增強。這證實了所觀察到的對精氨酸對映體的差異熒光響應來源于手性識別過程。

同時,如圖20所示,還研究了精氨酸溶液在不同對映體過量值情況下的熒光響應(ee=[D-L]/[D+L])。不同對映體過量值下的(S)-17和(R)-17的熒光響應呈現(xiàn)出近似鏡像的關系。因此,與圖19中所示的結果一致,不同ee的熒光響應研究進一步證實了所觀察到的對映體選擇性識別來源于手性匹配關系。

令人驚奇的是該Arg的對映選擇性識別可以通過肉眼來區(qū)分。當加入D-Arg后,探針溶液呈現(xiàn)深棕色(圖21),而L-Arg的加入使溶液變?yōu)闇\棕色,其他氨基酸都沒有顯著地顏色變化。這一現(xiàn)象表明,探針(S)-17與Arg的反應機理是完全不同的。

圖21 (S)-17的比色檢測實驗[22]

圖21 傳感反應可能的產(chǎn)物[22]

認為形成了圖21所示的產(chǎn)物,并通過量化計算研究了其發(fā)光機制,認為是傳感反應產(chǎn)物中的分子內(nèi)電子轉移(ICT)導致了熒光增強現(xiàn)象。

7 結論與展望

(R)-4的設計合成及手性熒光識別應用證實了對映選擇性熒光傳感器可以作為雙響應熒光傳感器,同時確定手性底物的濃度和對映體組成,極大地促進手性氨基酸化合物的快速測定。該探針的設計原理逐漸成為開發(fā)雙響應熒光傳感器的一種通用策略。該策略為:化合物(R)-4在Zn2+存在下識別手性功能胺,如二胺、氨基醇和氨基酸時,(R)-4中的2-萘胺單元可以與各種手性胺底物進行換位反應,從而呈現(xiàn)兩個波長的熒光增強效應,一個波長可用于底物濃度識別,另一個波長用于底物對映體選擇性識別。因此,在這兩個發(fā)射波長上的熒光響應的一次測量可以測定濃度和對映體組成。

表2 四類不同探針分子應用特點總結

但該傳感器的應用也存在一些問題,該傳感器可以對種氨基酸產(chǎn)生雙重熒光響應,化學選擇性效果差。而且其與苯丙氨酸相互作用時,對映選擇性比值ef高達13,但對其他氨基酸的對映選擇性比值要低得多(ef=1～4),針對這一現(xiàn)象的機理解釋有待進一步研究。此外,由于該探針水溶性差,且與氨基酸形成的席夫堿配合物在水溶液中不穩(wěn)定,測量主要在甲醇溶液中進行,不利于后期生物應用研究。熒光探針(R)-9的雙波長識別機制為與氨基酸的氨基親核反應通過兩種途徑進行,一種是通過1,4-加成反應脫掉香豆素單元8,8再與氨基酸反應;另一種是與氨基酸的氨基進行1,2-親核加成反應形成亞胺。兩種不同的途徑產(chǎn)生不同的中間體和產(chǎn)物,從而產(chǎn)生不同的熒光。與之前報道的基于BINOL的氨基酸熒光探針需要添加Zn2+配位產(chǎn)生對映選擇性熒光增強相比,該探針不需要添加金屬陽離子,而且該探針識別氨基酸主要在水溶液中進行,這使得它更便于實際應用。對于探針(S)-12,其與組氨酸和Zn2+反應,形成了一個六配位的Zn(II)配合物,限制了BINOL單元的旋轉,從而顯示熒光增強。同時因組氨酸的L-和D-對映體可能導致14的穩(wěn)定性和/或結構剛性不同,從而給出對映體選擇性響應。該熒光分子探針僅對組氨酸有較高的對映選擇性識別,對其他D-和L-氨基酸均沒有熒光響應,原因是其他氨基酸沒有組氨酸的咪唑取代基不能產(chǎn)生配合物14這樣的結構,使得僅組氨酸可以被(S)-12選擇性地檢測到。但是探針(S)-12對組氨酸的檢測是在DMF溶劑中進行的,這導致在生物細胞領域當中的應用受到限制。探針(S)-17具有多個反應位點,可以特異性識別常見20種氨基酸中的精氨酸,具有化學選擇性識別;同時其對精氨酸的對映選擇性識別效果也很好,ef值可達到487。該熒光探針對手性精氨酸的特異性識別來源于探針結構引入的丙烯酸酯基團,該基團產(chǎn)生了一個額外的反應位點,只與某種精氨酸對映體形成環(huán)狀化合物。量化計算研究支持了這樣的假設,因形成的邁克爾加成產(chǎn)物,具有強烈的分子內(nèi)電子轉移,從而發(fā)出強烈的熒光,產(chǎn)生了化學選擇性和對映選擇性識別。與其他用于檢測手性氨基酸的熒光探針相比,該探針具有特異性檢測精氨酸,無金屬離子添加,快速響應和比色檢測等優(yōu)點。

目前,很多儀器識別方法發(fā)展起來用于識別氨基酸的對映異構體,這些光學純度分析方法有CD[39]、HPLC[40]和電化學方法[41]等,但是這些分析方法需要較高的儀器成本,精密和仔細的操作,費時費力,無法適用于痕量氨基酸分析,特別是對一些先導藥物篩選及細胞內(nèi)涉及手性物質代謝的原位分析等方面難以達到預期效果。而通過對細胞代謝的一些重要產(chǎn)物或中間體氨基酸進行細胞內(nèi)原位分析,可闡明此類化合物的代謝過程,手性藥物的作用機制等。在諸多對手性氨基酸的檢測方法中,熒光檢測借助其高靈敏度、高選擇性、響應時間短、可原位檢測、多種檢測模式、高吞吐量分析潛能和無創(chuàng)性實時成像等優(yōu)點在手性識別分析中備受關注。特別是用單一熒光探針雙波長同時測定手性底物濃度和對映體組成,可以極大地促進手性化合物的快速分析。因此對近幾年所發(fā)表的在手性識別氨基酸方面的雙響應熒光傳感器進行總結整理,窺一斑而知全豹,以此為起點,知曉這一測定思路,可以指導并開發(fā)其他類手性雙響應熒光傳感器。同時,該領域仍有一些問題存在,需要在未來加以解決。第一,由于特定氨基酸的結構相似,對其單個對映體的特異性檢測仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。第二,熒光分子探針對氨基酸檢測由于金屬的加入以及反應條件的影響,在細胞領域應用受限。第三,熒光分子探針識別氨基酸,為什么對某一種氨基酸存在熒光響應,而對其他結構相似的氨基酸沒有熒光響應或熒光響應較弱,其中的機制仍需進一步研究。相信在未來的諸多學者的不懈努力下,一定會有更多簡單而又高效的雙響應傳感器產(chǎn)生,并在生物細胞領域得到廣泛的應用。