李東迅，舒高林，王維鈞，張 陽，谷 田，牛桓彩

（北京市昌平區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 102206）

副溶血性弧菌主要存在于海產(chǎn)品、鹽漬食品中，感染后會引起腹瀉、嘔吐、發(fā)燒、血便等急性胃腸炎癥狀，是引起水產(chǎn)類食物中毒的主要病原菌[1-3]。近年來，海產(chǎn)品消費大眾化，內(nèi)陸地區(qū)由副溶血性弧菌引起的食物中毒呈上升趨勢[3-4]。北京市昌平區(qū)近年的腹瀉病原菌監(jiān)測結(jié)果顯示，副溶血性弧菌腹瀉病例也呈上升趨勢[5]。本研究對2018—2019年北京市昌平區(qū)發(fā)生的6起食源性疾病聚集事件中分離到的23株副溶血性弧菌，進行脈沖場凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，F(xiàn)PGE）、耐藥和毒力基因檢測，分析菌株P(guān)FGE型別、耐藥性及毒力基因攜帶情況，為本地區(qū)副溶血性弧菌食源性疾病的預(yù)防和控制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株

2018—2019年北京市昌平區(qū)6起食源性疾病聚集事件中分離到的23株副溶血性弧菌（事件1：5株；事件2：1株；事件3：3株；事件4：9株；事件5：2株；事件6：3株），其中20株來源于患者，1株（事件4）來源于廚師（帶菌者），2株（事件4）來源于食品。藥敏質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922。

1.2 試劑及儀器

副溶血性弧菌分型血清（日本生研）；革蘭陰性需氧菌藥敏檢測A3板和A4板（上海星佰）；副溶血性弧菌tlh/tdh/trh三重實時熒光PCR檢測試劑盒（北京卓誠惠生）；Seakem Gold 瓊脂糖（瑞士LONZA）；限制性內(nèi)切酶XbaI、SfiI（美國NEB）；蛋白酶K（德國Merck）；熒光定量PCR儀（瑞士Roche LightCycler 480）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）；脈沖場凝膠電泳（美國Bio-Rad）。

1.3 方法

1.3.1 血清分型

血清分型嚴格按照副溶血性弧菌血清抗體產(chǎn)品說明書對菌株進行，K抗原不可分型計為KUT。

1.3.2 毒力基因

采用水煮法進行基因組DNA提?。禾羧∵m量新鮮培養(yǎng)的菌苔于200 μL無菌水中，渦輪振蕩混勻，100 ℃金屬浴10 min，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液待用。耐熱直接溶血毒素基因（tdh）、耐熱相關(guān)溶血毒素基因（trh）和不耐熱溶血毒素基因（tlh）3種毒力基因的檢測方法詳見試劑盒說明書。

1.3.3 藥敏實驗

選用17種抗生素進行藥敏實驗，即氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸、復方磺胺甲惡唑、四環(huán)素、氯霉素、頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢吡肟、慶大霉素、亞胺培南、阿米卡星、美羅培南、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星，17種抗生素相應(yīng)的濃度詳見說明書。藥敏實驗操作和結(jié)果判讀嚴格按照說明書進行。質(zhì)控菌株腸埃希氏菌ATCC25922。

1.3.4 PFGE分型

參照國家致病菌識別網(wǎng)的副溶血性弧菌的脈沖場凝膠電泳標準[6]，選用限制性內(nèi)切酶SfiⅠ對副溶血性弧菌進行酶切，沙門菌標準株H9812選用限制性內(nèi)切酶XbaI進行酶切。用BioNumerics軟件對PFGE圖譜進行處理分析，采用算術(shù)平均值加權(quán)配對組合法構(gòu)建聚類樹狀圖。按照Tenover原則判斷菌株間關(guān)系，即酶切后圖譜完全一致定為同一菌株型；圖譜有條帶不同者1～3條，可認為菌株間關(guān)系較密切；圖譜有3條以上條帶不同者認為菌株間關(guān)系不密切[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清分型

6起事件中有5起的副溶血性弧菌血清型為O3:K6型，事件3為O4:K8型，事件4為O3:K6、O8:K20型兩種血清型，事件1為O3:K6、O4:K8、O4:KUT 3種血清型（表1）。

表1 6起事件的副溶血性弧菌血清型及毒力基因

2.2 毒力基因檢測

6起事件中的21株人源分離株毒力基因均為tlh+、tdh+、trh-，2株食品分離株毒力基因為tlh+、tdh-、trh-（表1）。

2.3 藥敏結(jié)果

6起事件中的副溶血性弧菌對氨芐西林，除事件1中有1株菌（4.35%）中介外，其他菌株均敏感；對頭孢唑林，事件1的5株菌（21.74%）全部耐藥，6株菌（事件5、事件6中各2株，事件2、事件4中各1株；26.09%）中介，其余菌株敏感；6起事件中的副溶血性弧菌對其他15種抗生素完全敏感，實驗中未出現(xiàn)多重耐藥菌株（表2）。

表2 副溶血性弧菌的抗生素敏感性

2.4 PFGE分型

由圖1可知，事件1的5株菌分為4種PFGE帶型，即PT01～PT04；事件2、事件3、事件5和事件6的菌株只有1種PFGE帶型；事件4的人源分離株均為PT06，食品分離株均為PT08。圖中監(jiān)測來源屬于散發(fā)病例，發(fā)現(xiàn)帶型PT02、PT03、PT06和PT09在散發(fā)病例菌株中也有出現(xiàn)，PT01、PT04分別與散發(fā)病例菌株P(guān)FGE帶型PT10、PT05相差1個條帶，PT07與散發(fā)病例菌株帶型PT03相差2個條帶。

圖1 6起副溶血性弧菌聚集事件分離菌株P(guān)FGE聚類分析

3 結(jié)論與討論

食用被副溶血性弧菌污染的食物可引起副溶血性弧菌食物中毒，主要為海產(chǎn)品，多發(fā)生在沿海地區(qū)，夏秋季（6—10月）居多，具有明顯的高溫季節(jié)高發(fā)特征[7]。在食源性疾病的主動監(jiān)測中，北京地區(qū)由副溶血性弧菌引發(fā)食源性疾病事件逐年上升，以O(shè)3:K6型和O4:K8型最常見，食物中毒事件中又以O(shè)3:K6為主[4-5,8-9]。本研究中有5起事件的副溶血性弧菌血清型為O3:K6型（13株菌）。本研究還出現(xiàn)2株食品分離株為O8:K20型，該血清型比較少見，應(yīng)引起關(guān)注。

急性胃腸道癥狀主要由不耐熱溶血毒素（Thermolabile Hemomysin，TLH）、耐熱直接溶血毒素（Thermotolerant Direct Hemolysin，TDH）和耐熱相關(guān)溶血毒素（Thyrotropin-Releasing Hormone，TRH）引起，基因編碼分別為tlh、tdh、trh。毒力基因tdh和trh是副溶血性弧菌最主要的毒力基因，tlh基因則有種屬特異性[10-11]。以往研究結(jié)果顯示[10]，臨床分離株大多含有tdh基因，含trh基因菌株較少；食品分離株或環(huán)境分離株大多不含tdh和trh基因。本研究中，6起事件中的人源（病例和廚師）分離株毒力基因均為tlh+、tdh+、trh-，而食品分離株毒力基因為tlh+、tdh-、trh-。

近年來，隨著物流、快遞行業(yè)的迅速發(fā)展，海產(chǎn)品在內(nèi)陸地區(qū)銷量增加，進一步推動了海產(chǎn)品的大量養(yǎng)殖，副溶血性弧菌污染也成為海產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)的主要威脅之一。同時，抗生素的不規(guī)范使用使得副溶血性弧菌耐藥性日益嚴重。有研究顯示，北京市副溶血性弧菌人源分離株對頭孢唑啉、鏈霉素和氨芐西林的耐藥性較高[11]。本研究中的副溶血性弧菌除頭孢唑啉外，對其他抗生素都比較敏感，與本區(qū)散發(fā)病例分離株耐藥性一致[5,12]。雖然本研究的副溶血性弧菌對多數(shù)抗生素敏感且無多重耐藥菌株出現(xiàn)，也應(yīng)引起重視，臨床治療過程中應(yīng)合理用藥，減少耐藥副溶血性弧菌的產(chǎn)生[11]。

PFGE常用于病原菌的分子流行病學研究，可以從分子層面分析菌株關(guān)系，對菌株進行溯源分析[6]。本研究中，6起事件中菌株的PFGE帶型與本地區(qū)散發(fā)病例株帶型相同或相差1～2個條帶，有3起事件由食源性疾病主動監(jiān)測中的優(yōu)勢帶型（PT06）引起。根據(jù)Tenover判定原則，帶型相差1或2個條帶的菌株來源于同一克隆源，由此可推測另3起事件菌株與本地區(qū)散發(fā)病例菌株親緣關(guān)系密切。事件4的廚師分離株與病例株帶型相同，推測此次事件可能由帶菌廚師傳染引起，應(yīng)加強廚師等食品從業(yè)人員的專業(yè)培訓，對其進行食品安全知識的宣傳教育，提高此類從業(yè)人員的食品安全意識。相應(yīng)監(jiān)管部門應(yīng)加強餐館等食品行業(yè)的監(jiān)督，減少食源性疾病事件的發(fā)生。除事件4外，其余5起事件無法溯源，需要進一步提高流調(diào)人員的流行病學調(diào)查能力和實驗室的檢測水平，進而提高問題食品的溯源能力。