楊 蕾,陳 一,張佳誼,戰(zhàn) 欣

( 海南大學(xué) 海洋學(xué)院,南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 海口 570228 )

企鵝珍珠貝(Pteriapenguin)屬軟體動(dòng)物門雙殼綱珍珠貝科珍珠貝屬,國(guó)外稱其為翼形珍珠貝。其生長(zhǎng)環(huán)境為熱帶、亞熱帶海域,在我國(guó)主要分布于廣西、廣東、海南和臺(tái)灣等地[1-2]。企鵝珍珠貝為大型珍珠貝類,生長(zhǎng)速度快、成活率高,且具有較高的食用價(jià)值,是我國(guó)海水珍珠養(yǎng)殖主要經(jīng)濟(jì)種類之一,同時(shí)也可以作為海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)的參考生物[3-4]。

足絲是一種具有獨(dú)特柔韌性、自愈合性和水下黏附性的生物材料,企鵝珍珠貝具有發(fā)達(dá)的足絲,通過足絲附著在基質(zhì)表面營(yíng)固著生活,從而適應(yīng)不同的環(huán)境[5-6]。足絲中富含各種蛋白質(zhì)成分,稱為黏附蛋白,目前自海洋貽貝鑒定出的足絲蛋白數(shù)量有限,分為4類[7]:貽貝足絲蛋白、前膠原蛋白[8-10]、足絲纖維近端基質(zhì)蛋白[11]、多酚氧化酶[12],可能還有其他蛋白參與足絲產(chǎn)生過程及其調(diào)控[13-14]。Sansoucy等[14]在紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)和加利福尼亞貽貝(M.californianus)足和足絲中鑒定出了潛在的與足絲形成相關(guān)的蛋白質(zhì),除上述已發(fā)現(xiàn)的黏附蛋白外,還從足絲中發(fā)現(xiàn)并鑒定出足絲蛋白3(BP3),該蛋白作為足絲本身的主要成分被檢測(cè)出來(lái)。同時(shí),沼蛤(Limnopernafortunei)中也檢測(cè)出BP3基因,且BP3基因在足中特異表達(dá),在足絲快速形成期高度表達(dá),說明BP3基因的表達(dá)與足絲的再生密切相關(guān),在足絲形成中起關(guān)鍵作用[15]。

目前對(duì)足絲蛋白的研究大多集中在貽貝科生物[16-22],對(duì)企鵝珍珠貝足絲蛋白進(jìn)行分析的報(bào)道則較少。因此,筆者以企鵝珍珠貝為研究對(duì)象,采用RACE技術(shù)克隆BP3基因cDNA全長(zhǎng)序列,利用生物學(xué)信息對(duì)其進(jìn)行分析,并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析BP3基因在各組織中的表達(dá)特征,為后續(xù)研究企鵝珍珠貝足絲黏附的分子機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用企鵝珍珠貝采自三亞蜈支洲島,選取 1.5 齡健康貝,用干凈的剪刀剪取3個(gè)個(gè)體的足、外套膜、閉殼肌、鰓、珍珠狀袋、唇瓣等組織,保存于RNA保存液中用于RNA提取。將剩余的貝暫養(yǎng)在海南海昌蝦苗繁育基地(海南文昌)14 d后,剪斷企鵝珍珠貝的足絲,72 h后,收集分泌足絲個(gè)體的足(3個(gè))和未分泌足絲個(gè)體的足(3個(gè)),保存于RNA保存液中備用。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

試驗(yàn)所用引物見表1。

表1 足絲蛋白3試驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in the BP3 experiments

1.2.2 BP3基因全長(zhǎng)克隆

按照Invitrogen公司Trizol試劑盒說明書提取企鵝珍珠貝足總RNA,并通過PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA第1條鏈,-20 ℃?zhèn)溆?。按?′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa,日本)說明書的3′RACE cDNA模板,SMARTer?RACE 5′/3′試劑盒(TaKaRa,日本)說明書的5′RACE cDNA模板,從企鵝珍珠貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到1條注釋名為BP3的Unigene序列,使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)企鵝珍珠貝BP3基因3′RACE和5′RACE特異性引物。以5′/3′RACE cDNA為模板,參照3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶和SMARTer?RACE 5′/3′試劑盒說明書進(jìn)行RACE-PCR擴(kuò)增。以BP3-Outer和BP3-GSP1為引物進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,5個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,5個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s,48 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,20個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。以第1輪PCR產(chǎn)物為模板,BP3-Inner和BP3-GSP2為引物進(jìn)行第2輪巢式PCR擴(kuò)增。巢式PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,20個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,將目的片段膠回收,連接到pMDTM18-T(TaKaRa,日本)載體上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α(TOLOBIO,中國(guó))中,送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將得到的核酸序列與BP3 Unigene序列拼接,根據(jù)拼接結(jié)果設(shè)計(jì)3′和5′端引物,驗(yàn)證拼接序列的正確性,從而獲得BP3的cDNA全長(zhǎng)。

1.2.3 BP3基因生物信息學(xué)分析

通過ORF Finder工具(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder),推導(dǎo)企鵝珍珠貝BP3基因編碼的氨基酸序列;采用SignalP 4.1 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和CDD工具(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)分析信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)域;用ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)對(duì)氨基酸組成、分子式、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析;利用NetNGlyc 1.0 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)、NetOGlyc 4.0 Server(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0)和NetPhos 3.1 Server (https:∥services.healthtech.dtu.dk/service. php?NetPhos-3.1)對(duì)蛋白的N-糖基化位點(diǎn)、O-糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè);采用TMHMM Server v. 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū)域;利用ProtScale(https:∥web.expasy.org/protscale/)分析蛋白親/疏水性;利用Protcomp 9.0(http:∥linux1.softb-erry.com/berry.phtml?group=programs&subgroup=proloc&topic=protcompan)對(duì)蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析;采用SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和COILS Server(https:∥embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html)對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及卷曲螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;利用BLAST(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具和Custal X軟件進(jìn)行氨基酸序列相似性比對(duì)分析。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BP3基因的表達(dá)特征

提取有足絲企鵝珍珠貝足、外套膜、閉殼肌、鰓、珍珠狀袋、唇瓣6個(gè)組織的RNA,使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,日本)反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系采用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa,日本)20 μL體系:TB Green 10 μL,上、下引物各0.8 μL,cDNA模板2 μL,加雙蒸水至20 μL。以β-actin基因作為內(nèi)參,以外套膜為對(duì)照,每組設(shè)3個(gè)平行。再分別提取有足絲企鵝珍珠貝個(gè)體足和無(wú)足絲企鵝珍珠貝足的RNA,反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA,進(jìn)行熒光定量PCR,每組設(shè)3個(gè)平行。反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平,運(yùn)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)單因素方差分析,并用圖基多重比較對(duì)平均值進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),使用Excel 2016軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 BP3基因的克隆與序列分析

2.1.1 BP3基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

使用3′RACE、5′RACE引物進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增各獲得了1條單一、明亮的條帶(圖1a、b),長(zhǎng)度分別約為240、150 bp,將條帶分別進(jìn)行回收、測(cè)序,最終拼接得601 bp的cDNA全長(zhǎng)序列。再使用全長(zhǎng)驗(yàn)證引物擴(kuò)增目的片段,觀察在500 bp處有清晰、單一的目的條帶(圖1c),與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 BP3基因克隆電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of amplified BP3 fragment from pearl oyster P. penguinM1.分子標(biāo)記600 bp; M2.分子標(biāo)記2000 bp; 1. 3′RACE擴(kuò)增產(chǎn)物; 2. 5′RACE擴(kuò)增產(chǎn)物; 3.全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物.M1.marker 600 bp; M2.marker 2000 bp; 1. 3′RACE producct; 2. 5′RACE producct; 3.full length product.

2.1.2 BP3基因序列分析

通過RACE-PCR技術(shù)獲得BP3基因的cDNA全長(zhǎng)序列(圖2)。企鵝珍珠貝的BP3基因cDNA全長(zhǎng)為601 bp,開放閱讀框長(zhǎng)453 bp,共編碼150個(gè)氨基酸,該基因5′端非編碼區(qū)為71 bp,3′端非編碼區(qū)為77 bp。在BP3基因序列3′端非編碼區(qū)含有1個(gè)Poly(a)典型信號(hào)序列(AATAAA)和終止子(TGA)。

圖2 BP3基因cDNA及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Complete cDNA and deduced amino acid sequence of BP3 gene from pearl oyster P. penguin方框表示起始密碼子和終止密碼子; ▏表示分泌信號(hào)肽裂解位點(diǎn);表示Poly(a)信號(hào).The start codon and stop codon are shown in box; ▏indicates the cleavage site of secreted signal peptide; indicates Poly (a) signal.

2.2 BP3基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白信號(hào)肽及結(jié)構(gòu)域分析

使用SignalP 4.1 Server對(duì)足絲蛋白3氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽分析(圖3a),發(fā)現(xiàn)原始剪切位點(diǎn)(C-score)和綜合剪切位點(diǎn)值(Y-score)均在Lys23處呈現(xiàn)最大值,表明足絲蛋白3含有22個(gè)氨基酸殘基(Met1～Gly22)的信號(hào)肽。而CDD工具分析(圖3b)發(fā)現(xiàn),在足絲蛋白3氨基酸序列中并不包含保守結(jié)構(gòu)域。

圖3 BP3基因所編碼蛋白質(zhì)的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)(a)、保守結(jié)構(gòu)域(b)Fig.3 The signal peptide splicing site (a) and the conserved domain (b) of BP3 from pearl oyster P.penguin

2.2.2 氨基酸理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析

ProtParam氨基酸理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,企鵝珍珠貝足絲蛋白3蛋白分子式為C725H1134N202O228S15,由150個(gè)氨基酸組成,其中甘氨酸(Gly)含量最高,為11.3%,其次是半胱氨酸(Cys),為 9.3%,甲硫氨酸(Met)含量最低,為0.7%;帶負(fù)電的氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為18個(gè),帶正電的氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為21個(gè)。相對(duì)分子質(zhì)量為16.81 ku,其蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)PI值為7.33。蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定性,不穩(wěn)定系數(shù)值為31.40。總平均親水性大小為-0.447,脂肪系數(shù)值為66.87。

2.2.3 蛋白糖基化和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析

利用NetNGlyc 1.0 Server、NetOGlyc 4.0 Server和NetPhos 3.1 Server對(duì)蛋白的N-糖基化位點(diǎn)、O-糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示(圖4),企鵝珍珠貝BP3有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(Asn112),無(wú)O-糖基化位點(diǎn);有16個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中絲氨酸9個(gè)(Ser7、Ser13、Ser30、Ser51、Ser55、Ser87、Ser101、Ser128、Ser138),蘇氨酸3個(gè)(Thr29、Thr82、Thr139),酪氨酸4個(gè)(Tyr5、Tyr24、Tyr54、Tyr110)。

圖4 BP3基因所編碼蛋白質(zhì)N-糖基化位點(diǎn)(a)、磷酸化位點(diǎn)(b)Fig.4 Predicted N-glycosylation site (a) and phosphorylation site (b) of BP3 from pearl oyster P. penguin

2.2.4 蛋白親(疏)水性、跨膜結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位分析

利用ProtScale分析蛋白生物親(疏)水性,結(jié)果顯示:企鵝珍珠貝足絲蛋白3疏水性最強(qiáng)出現(xiàn)在Ile10處,數(shù)值為2.789;親水性最強(qiáng)在Gln39,數(shù)值為-2.178;大部分氨基酸表現(xiàn)為負(fù)值,推測(cè)其可能是一種穩(wěn)定的親水性蛋白(圖5a)。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示,足絲蛋白3蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域,整條多肽鏈均處于細(xì)胞膜外(圖5b)。蛋白亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示,該蛋白分布于細(xì)胞外基質(zhì)(9.81)、質(zhì)膜(0.10)、細(xì)胞質(zhì)(0.03)、線粒體(0.02)、溶酶體(0.03)的可能性較大,分布于細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化酶體、高爾基體、液泡的可能性為0(表2)。

圖5 BP3基因所編碼蛋白質(zhì)的親(疏)水性(a)、蛋白跨膜區(qū)(b)預(yù)測(cè)Fig.5 Predicted phosphorylation site (a) and protein transmembrane (b) of BP3 from pearl oyster P. penguin

表2 企鵝珍珠貝足絲蛋白3亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Tab.2 Predicted subcellular location of BP3 from pearl oyster P. penguin

2.2.5 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及卷曲螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用SOPMA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中,α-螺旋占3.33%,β-轉(zhuǎn)角占15.33%,延伸鏈占34.00%,無(wú)規(guī)則卷曲占47.33%,該蛋白中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)較少(圖6a)。通過COILS server對(duì)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)分析,數(shù)值在3個(gè)不同窗口下均較低,說明該蛋白可能不存在螺旋卷曲結(jié)構(gòu)(圖6b)。

圖6 企鵝珍珠貝足絲蛋白3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(a)和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(b)預(yù)測(cè)Fig.6 Predicted secondary structure (a) and oiled coil structure (b) of BP3 from pearl oyster P. penguin圖a中的上圖和中圖為蛋白預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分布和比例圖,大寫字母表示氨基酸,小寫字母表示二級(jí)結(jié)構(gòu);下圖為預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)相似峰圖.藍(lán)色.α-螺旋(h);綠色.β-折疊(t);橘色.無(wú)規(guī)則卷曲(c);紅色.延伸鏈(e).The distribution and proportion of predicted secondary structures are shown in upper and middle of fig. a, and the similarity peaks of predicted secondary structures are shown in bottom of fig. a; capital letters indicate amino acids and letters indicate secondary structures. Blue. alpha helix (h); green. beta turn (t); orange. random coil (c); red. extended strand (e).

2.3 BP3基因氨基酸同源性比對(duì)分析

利用BLAST工具和Custal X軟件進(jìn)行氨基酸序列相似性比對(duì)分析,結(jié)果顯示,企鵝珍珠貝足絲蛋白3氨基酸序列與厚殼貽貝(M.coruscus,AKI87986.1)同源性最高,為30.34%(圖7)。

圖7 企鵝珍珠貝與厚殼貽貝足絲蛋白3氨基酸序列比對(duì)Fig.7 Amino acid sequence comparison of the BP3 between the pearl oyster P. penguin and mussel M. coruscus

2.4 BP3基因不同組織表達(dá)分析

有足絲企鵝珍珠貝各組織熒光定量PCR結(jié)果顯示,BP3基因在6個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá),該基因的表達(dá)量在外套膜組織中最高,其次是鰓、唇瓣、足、珍珠狀袋,在閉殼肌中表達(dá)量最低(圖8a)。

圖8 BP3基因在企鵝珍珠貝各組織中的表達(dá)量(a)和BP3基因在有(無(wú))足絲企鵝珍珠貝個(gè)體足中的表達(dá)量(b)Fig.8 The expression level of BP3 gene in different tissues of pearl oyster P. penguin (a) and the expression level of BP3 gene in the feet of P. penguin with/ without the byssus (b)同行中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05),標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05).Means with different letters are significant differences(P<0.05), and means with the same letter are not significant differences (P>0.05).

有足絲和無(wú)足絲企鵝珍珠貝個(gè)體足的qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn):在有足絲的企鵝珍珠貝足和無(wú)足絲的企鵝珍珠貝足中均可檢測(cè)到BP3基因的存在,且有足絲的足中表達(dá)量顯著高于無(wú)足絲的足中表達(dá)量(P<0.05)(圖8b)。

3 討 論

3.1 企鵝珍珠貝BP3基因結(jié)構(gòu)及氨基酸同源性比較分析

大量研究表明,不同物種的足絲蛋白存在較大差異,扇貝和貽貝雖同屬雙殼綱,但扇貝與貽貝的蛋白質(zhì)組成存在顯著差異,從櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)中鑒定出的7種足絲蛋白(Sbp1～Sbp7)及其相關(guān)蛋白與目前已知的貽貝足絲蛋白的同源性有限,僅與Mfp2具有低同源性(35%),其中Sbp1與CD109抗體同源性為29%,Sbp7與金屬蛋白酶抑制劑2同源性為28%,與已知蛋白質(zhì)序列同源性不高,表明它們可能具有不同的功能[23]。沼蛤足絲蛋白基因與其他貽貝的相似性很低,這些基因在雙殼類中具有很高的物種特異性[15]。當(dāng)前判定蛋白是否為足絲蛋白及相關(guān)蛋白主要是通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行注釋[14-15,23],筆者基于企鵝珍珠貝轉(zhuǎn)錄組序列從足中克隆得到全長(zhǎng)601 bp的BP3基因,編碼150個(gè)氨基酸殘基,雖然氨基酸序列與目前已知的厚殼貽貝足絲蛋白3同源性僅為30.34%,但是企鵝珍珠貝足絲蛋白3與厚殼貽貝足絲蛋白3理化性質(zhì)相似,分子質(zhì)量和等電點(diǎn)均接近。企鵝珍珠貝足絲蛋白3分子質(zhì)量為16.81 ku,而厚殼貽貝足絲蛋白3分子質(zhì)量為15.00 ku;企鵝珍珠貝足絲蛋白3理論等電點(diǎn)為7.33,厚殼貽貝足絲蛋白3等電點(diǎn)為7.94;兩種蛋白均為親水性蛋白,無(wú)保守結(jié)構(gòu)域,無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。這說明兩個(gè)物種的BP3氨基酸序列在空間結(jié)構(gòu)上相似。已有研究發(fā)現(xiàn),厚殼貽貝、斑馬貽貝(Dreissenapolymorpha)、翡翠貽貝(Pernaviridis)等中發(fā)現(xiàn)多種足絲蛋白在進(jìn)化水平上與紫貽貝并不相近,說明不同物種足絲蛋白的進(jìn)化是相對(duì)獨(dú)立的[23-26]。

3.2 足絲蛋白3的理化性質(zhì)分析

藤壺膠由藤壺分泌,將藤壺與底物牢固結(jié)合,成熟個(gè)體所分泌的藤壺膠蛋白中含有高水平的絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸和丙氨酸[27]。在貽貝足絲蛋白產(chǎn)生黏附的過程中,L-3,4-二羥基苯丙氨酸發(fā)揮著重要的作用[28-29],L-3,4-二羥基苯丙氨酸是由多酚氧化酶(酪氨酸酶)使酪氨酸殘基羥基化而形成的[13]。貽貝黏附蛋白的其他成分包含賴氨酸和甘氨酸。賴氨酸可能通過離子鍵與帶負(fù)電荷的表面(如膠原蛋白和酸性多糖)形成黏附和鄰醌分子間交聯(lián)[30-31]。甘氨酸可能通過其賦予蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)開放的、擴(kuò)展的構(gòu)象促進(jìn)黏附[13]。組氨酸是一種具有梯度模式的氨基酸,在足絲纖維遠(yuǎn)端高度富集,與貽貝的過渡金屬含量(鋅或銅)和附著力有關(guān)[32]。在企鵝珍珠貝足絲蛋白3中,甘氨酸、酪氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸含量都較高,這些氨基酸將使得足絲蛋白3在足絲黏附過程中發(fā)揮重要作用。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無(wú)規(guī)則卷曲。在企鵝珍珠貝足絲蛋白3的二級(jí)結(jié)構(gòu)中富含延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲,相對(duì)而言α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量較少,判定足絲蛋白3為混合型蛋白質(zhì)。由于足絲蛋白3無(wú)卷曲螺旋結(jié)構(gòu),且不具備跨膜結(jié)構(gòu),主要定位于細(xì)胞外基質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、溶酶體、線粒體中,因此判定該蛋白不具有膜蛋白結(jié)構(gòu)特征,為膜外蛋白。糖基化和磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾,在Mefp5中存在磷酸化絲氨酸,它在足絲黏附盤中的存在可能有助于貽貝與相鄰貽貝之間的黏附作用[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,足絲蛋白3中有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn),無(wú)O-糖基化位點(diǎn),有16個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)9個(gè),潛在的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)可能有助于企鵝珍珠貝足絲黏附盤與相鄰貝體的黏附。當(dāng)?shù)鞍字惺杷被岷枯^少時(shí),會(huì)產(chǎn)生較弱的疏水相互作用來(lái)促進(jìn)與底物的結(jié)合[33],與厚殼貽貝相似,企鵝珍珠貝BP3基因所編碼的氨基酸大多數(shù)均為親水性氨基酸,疏水性氨基酸含量相對(duì)較少,這有助于足絲與底物發(fā)生黏附作用。

3.3 BP3基因的表達(dá)模式分析

當(dāng)前對(duì)BP3基因的組織表達(dá)特性分析的研究相對(duì)較少,Li等[15]對(duì)沼蛤BP3基因進(jìn)行組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),BP3基因在足中特異表達(dá),且該基因的表達(dá)量與足絲的再生密切相關(guān),表明BP3基因在足絲形成過程中起著關(guān)鍵作用。本試驗(yàn)中,企鵝珍珠貝BP3基因在所檢測(cè)的6個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá),在外套膜組織中表達(dá)量最高,其次是鰓、唇瓣、足、珍珠狀袋,在閉殼肌中表達(dá)量最低。雖然該表達(dá)特征與沼蛤BP3基因在足中特異表達(dá)的結(jié)果有所不同,但是企鵝珍珠貝BP3基因在足中的表達(dá)量也不低,且BP3基因在有足絲企鵝珍珠貝個(gè)體足中的表達(dá)量顯著高于無(wú)足絲企鵝珍珠貝個(gè)體足,表明該基因與足絲形成存在相關(guān)性,但是具體的功能需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

企鵝珍珠貝BP3基因cDNA全長(zhǎng)為601 bp,編碼150個(gè)氨基酸,蛋白分子質(zhì)量為16.81 ku,等電點(diǎn)為7.33。企鵝珍珠貝足絲蛋白3無(wú)跨膜結(jié)構(gòu),是一種親水性穩(wěn)定膜外蛋白,與厚殼貽貝足絲蛋白3理化性質(zhì)相似。BP3基因在足中有表達(dá),且在有足絲個(gè)體足中表達(dá)量顯著高于無(wú)足絲個(gè)體足(P<0.05),據(jù)此推測(cè),BP3基因參與企鵝珍珠貝足絲形成過程。