高亞麗 吳坤英

鄭州市婦幼保健院婦科，鄭州 450000

宮頸癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能涉及性生活開(kāi)始過(guò)早、多個(gè)性伴侶、抽樣、免疫功能缺陷性疾病、多孕多產(chǎn)等，其中人乳頭瘤病毒（HPV）感染是其發(fā)生的主要因素，若不及時(shí)治療，隨著腫瘤不斷增大可侵犯或壓迫鄰近器官組織而出現(xiàn)相應(yīng)癥狀，甚至威脅患者生命安全［1］。宮頸癌癌前病變持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，若能早期篩查并發(fā)現(xiàn)早期浸潤(rùn)癌和癌前病變，可起到減少或預(yù)防宮頸癌發(fā)生的目的。液基細(xì)胞學(xué)（TCT）檢查、高危人乳頭瘤病毒（HR-HPV）檢測(cè)是宮頸癌篩查的常用手段，但前者檢查無(wú)法在體外培養(yǎng)，且重現(xiàn)性欠佳、檢測(cè)步驟過(guò)于繁瑣、難以將一過(guò)性感染的影響排除，存在較高的假陰性，后者檢查會(huì)受到細(xì)胞學(xué)診斷醫(yī)師業(yè)務(wù)水平限制，漏診率較高，同時(shí)價(jià)格昂貴、易出現(xiàn)假陽(yáng)性、不適合大規(guī)模宮頸癌篩查等，故無(wú)法作為最終的臨床診斷方式［2-3］。抑制基因蛋白16（P16）屬于細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，P16-Cyclin D1CDK-Rb 組成的調(diào)控途徑與宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)，而原癌基因細(xì)胞增殖核抗原（Ki-67）屬于核蛋白，在G0 期缺失，在G1、G2、S、M 期均有表達(dá)，正常情況下兩者表達(dá)為互斥的，若檢測(cè)細(xì)胞中兩者同時(shí)表達(dá)提示細(xì)胞周期失調(diào)且存在宮頸高級(jí)病變可能［4-5］。本研究分析P16/Ki-67 雙染在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值，以為臨床診斷提供新的思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

1.研究對(duì)象

回顧性分析2020 年10 月至2022 年5 月就診于鄭州市婦幼保健院的100 例宮頸病變患者的臨床資料，年齡（55.65±2.14）歲（25～72 歲）；首次性生活年齡（23.65±2.14）歲（18～28歲）；性伴侶數(shù)（1.22±10）個(gè)（1～3個(gè)）；婚姻狀況：已婚93 例，未婚7 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：宮頸完整，既往未接受物理或?qū)m頸手術(shù)治療者；年齡＞21 歲；檢查前3 d 無(wú)性生活、無(wú)陰道用藥、無(wú)外陰清洗；患者或家屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往接受盆底放射治療者；既往有宮頸手術(shù)史或子宮切除術(shù)治療者；妊娠期或哺乳期孕婦者。

本研究經(jīng)鄭州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：ZZFY-LL-2021017。

2.方法

2.1.P16/Ki-67 雙染檢測(cè) 檢查時(shí)取膀胱截石位，用一次性窺陰器將宮頸充分暴露，用宮頸細(xì)胞取樣刷在宮頸管內(nèi)及宮頸表面順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5～10 圈，刷取宮頸脫落細(xì)胞，使用ThinPrep2000 系統(tǒng)處理標(biāo)本，制作細(xì)胞涂片。晾干后，用無(wú)水乙醇固定10 min，室溫下晾干，使用疏水筆于載玻片上畫(huà)出疏水圈。應(yīng)用抗原清除及修復(fù)內(nèi)源酶：按照19∶1 的比例配比蒸餾水及抗原修復(fù)液，配置完成后將其置于染色缸內(nèi)后放入玻片，明確抗原修復(fù)液超過(guò)書(shū)寫(xiě)區(qū)之上。隨后將染色缸置入高壓鍋內(nèi)，于氣壓閥開(kāi)始均勻噴氣時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，控制修復(fù)時(shí)間為5 min，待完成自然冷卻至室溫后使用清洗液漂洗3 min，重復(fù)清洗3 次，依據(jù)具體情況補(bǔ)全疏水圈，載玻片上會(huì)均勻滴入3%H2O2溶液，確保書(shū)寫(xiě)區(qū)被充分覆蓋，室溫下孵育10 min，清洗液漂洗3 min，重復(fù)3次。完成后實(shí)施染色，即將1 滴DS-A 染液滴于書(shū)寫(xiě)區(qū)，并于37 ℃環(huán)境中孵育30 min，漂洗30 min，重復(fù)3 次，隨后滴加1 滴DS-V 染液，恒溫箱（37 ℃）內(nèi)孵育30 min，清洗液漂洗3 min，重復(fù)3 次。將DS-C 和DS-D 以1∶33 制作成50 μl DAB 顯色液，并將其覆蓋于載玻片書(shū)寫(xiě)區(qū)，于室溫下顯色10 min，隨后采用流水沖洗3 min，清洗液漂洗3 min，向其內(nèi)滴入50 μl Fast Red 顯色液，按照DS-C 和DS-D 以1∶75 的比例配制，于室溫下顯色15 min，后流水沖洗3 min，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，復(fù)染10 s。流水沖洗5 min，于清洗液中行10 min 反藍(lán)，流水漂洗1 min。將2 滴隨心封片劑滴于載玻片中央，晾干后用樹(shù)脂滴膠封片。隨后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，P16定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)上，呈淺棕色、棕黃色和棕色即為陽(yáng)性；Ki-67定位于細(xì)胞核上，顯淺紅色、玫紅色即為陽(yáng)性。

2.2.TCT 檢查 用棉拭子擦除宮頸口分泌物，用特制的宮頸刷在宮頸管內(nèi)順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)5 圈，動(dòng)作輕柔，采集宮頸口和頸管脫落的上皮細(xì)胞，用毛刷將收集的標(biāo)本置于Thin Prep 保存液的小瓶?jī)?nèi)漂洗，收集細(xì)胞，用新柏氏2000 全自動(dòng)制片機(jī)制片。將細(xì)胞混勻，制作成直徑2 cm 左右的薄層細(xì)胞涂片，用95%乙醇固定，巴氏染色，封固制片，透明，樹(shù)膠封片放入烘箱烘干，由專(zhuān)業(yè)人員閱片。參照TBS 分級(jí)系統(tǒng)（2006）對(duì)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)分類(lèi)。不典型腺上皮細(xì)胞（AGC）和腺癌、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）、宮頸鱗狀細(xì)胞癌（SCC）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、不能排除高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的宮頸不典型鱗狀細(xì)胞（ASC-H）、未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞或惡性細(xì)胞（NILM）、細(xì)胞學(xué)異常診斷包括意義不明確的宮頸不典型鱗狀細(xì)胞（ASC-US）。TCT 檢查結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：NILM判定為陰性結(jié)果，其余均判定為陽(yáng)性結(jié)果。

2.3.HR-HPV 檢測(cè) 以窺陰器暴露宮頸，用棉拭子擦去宮頸過(guò)多的分泌物，將蘸取少許無(wú)菌生理鹽水的標(biāo)準(zhǔn)宮頸刷插入宮頸口，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)約5 圈，慢慢取出宮頸刷，放置在裝有專(zhuān)用保存液的小瓶?jī)?nèi)，多余的刷柄在管口處折斷，將刷頭留在樣本管內(nèi)，管蓋旋緊，做好樣品標(biāo)識(shí)并保持洗脫管直立放置，4 ℃保存待檢。用高危型人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)23 種HPV 基因型，包含HPV6、HPV11、HPV42 等在內(nèi)的9 種HPV 低危型和HPV18 型、HPV16 型，HPV31、HPV33、HPV35 等在內(nèi)的12 種高危型HPV。檢測(cè)出HR-HPV亞型則檢查結(jié)果評(píng)定為陽(yáng)性。

2.4.陰道鏡檢查 由陰道鏡醫(yī)師實(shí)施陰道鏡檢查及活檢術(shù)。使用陰道窺器充分暴露宮頸，使用棉球擦拭宮頸表面，攝片、保存。使用碘棉球及3%醋酸棉球均勻涂抹于陰道穹隆、宮頸及陰道壁處，仔細(xì)觀察各部位變化情況，保存圖像。在陰道鏡輔助下選擇異常處3～4 塊病理送檢。所有操作均由本院兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科主任醫(yī)生進(jìn)行診斷，病理診斷＜LSIL（即CINI 及以下診斷）為陰性；≥HSIL（即CINⅡ+）為陽(yáng)性。

3.觀察指標(biāo)

（1）記錄陰道鏡檢查結(jié)果；（2）以陰道鏡下活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析HR-HPV、TCT、P16/Ki-67 雙染診斷宮頸病變靈敏度、準(zhǔn)確度和特異度。準(zhǔn)確度=（真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/總例數(shù)×100%；靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)）×100%。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 軟件分析數(shù)據(jù)，用（±s）表示符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；以例（%）表示計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)，通過(guò)繪制受試者工作特征曲線（ROC），計(jì)算曲線下面積（AUC），其中AUC 越接近于1，說(shuō)明診斷準(zhǔn)確性越高，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.陰道鏡下活檢結(jié)果

100 例宮頸病變患者，經(jīng)陰道鏡檢查發(fā)現(xiàn)14 例（14.00%）為炎癥病變，宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ26 例（26.00%），CIN Ⅱ 26 例（26.00%），CIN Ⅲ28 例（28.00%），SCC 6例（6.00%）。

2.HR-HPV、TCT、P16/Ki-67雙染診斷宮頸病變的價(jià)值

HR-HPV、TCT、P16/Ki-67雙染對(duì)宮頸病變?cè)\斷的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見(jiàn)表1～4。

表1 100例宮頸病變患者的HR-HPV診斷結(jié)果（例）

表2 100例宮頸病變患者的TCT診斷結(jié)果（例）

表3 100例宮頸病變患者的P16/Ki-67雙染診斷結(jié)果（例）

表4 100例宮頸病變患者的HR-HPV、TCT、P16/Ki-67雙染診斷宮頸病變（%）

3.多種篩查方法效果評(píng)價(jià)

繪制ROC，HR-HPV、TCT、P16/Ki-67 雙染診斷宮頸病變的AUC 分別為0.917、0.835、0.888，P16/Ki-67 雙染檢測(cè)分別與TCT、HR-HPV 檢查相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.720，P=0.086；Z=1.171，P=0.243）。見(jiàn)圖1。

圖1 100例宮頸病變患者的HR-HPV、TCT、P16/Ki-67雙染診斷的ROC

討論

宮頸癌早期無(wú)典型性臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者被確診時(shí)已進(jìn)展為中晚期，錯(cuò)失手術(shù)治療最佳時(shí)機(jī)，預(yù)后較差［6］。因?qū)m頸癌發(fā)病緩慢，癌前病變不會(huì)出現(xiàn)跨階式變化，而是呈階梯式進(jìn)展，加上子宮頸獨(dú)特的可暴露性質(zhì)，其可經(jīng)早期篩查被發(fā)現(xiàn)并實(shí)施干預(yù)，有助于改善患者預(yù)后。HR-HPV 病毒持續(xù)感染與宮頸癌發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)，其是HPV可侵入至宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)表面致癌蛋白，能夠產(chǎn)生多種HPV蛋白，而高危型HPV感染能夠經(jīng)干擾INF產(chǎn)生或抑制癌基因P53、滅活CDK 抑制物、影響細(xì)胞周期素CyclinA/E、激活端粒酶等，擾亂細(xì)胞的正常增殖與凋亡機(jī)制，最終誘發(fā)子宮頸癌變［7-9］。HR-HPV 檢測(cè)可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒實(shí)施檢測(cè)，判斷患者是否存在高危型HPV感染，能避免人為主觀因素的不利影響，且檢查具有高陰性預(yù)測(cè)值、高靈敏度等特點(diǎn)，可濃縮高風(fēng)險(xiǎn)人群，常被應(yīng)用于宮頸癌篩查［10-11］。但HR-HPV 難以排除一過(guò)性感染的影響且檢測(cè)步驟過(guò)于繁瑣，不利于臨床推廣。TCT 為細(xì)胞學(xué)檢測(cè)新技術(shù)，結(jié)合物理技術(shù)與現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)，能使制成的薄層圖片背景更干凈、細(xì)胞成分更為齊全、結(jié)構(gòu)更加清晰，利于早期發(fā)現(xiàn)、診斷宮頸疾?。?2-13］。TCT 具有操作簡(jiǎn)單、涂片采集率高等優(yōu)點(diǎn)，但因病理細(xì)胞學(xué)醫(yī)生缺乏、質(zhì)量控制不足且觀察者間重復(fù)性差等影響，使得TCT 檢查也難以推廣。

P16 屬于腫瘤抑制基因，在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠與Cyclin D競(jìng)爭(zhēng)相結(jié)合為CDK4/CDK6，有助于抑制CDK4、CDK6 的活性，促使Rb 蛋白失活，在細(xì)胞增殖時(shí)無(wú)法經(jīng)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)R點(diǎn)，進(jìn)一步阻礙細(xì)胞周期從G1至S期的整個(gè)過(guò)程，有助于抑制宿主細(xì)胞的增殖［14-15］。HR-HPV 持續(xù)感染時(shí)宮頸上皮細(xì)胞基因組與病毒基因組會(huì)發(fā)生整合，其產(chǎn)生的E7 蛋白，可較好地與Rb 蛋白進(jìn)一步結(jié)合后轉(zhuǎn)化為pRb，導(dǎo)致Rb-E2F 復(fù)合體發(fā)生解離，產(chǎn)生大量的核轉(zhuǎn)錄因子E2F，促使基因P16 表現(xiàn)出異常高表達(dá)。Ki-67 是一種貫穿表達(dá)于增殖期細(xì)胞中的核蛋白，該指標(biāo)從G1 后期開(kāi)始表達(dá)，其水平越來(lái)越高，至M 期達(dá)到頂峰，在有絲分裂后水平快速下降［16-18］。Ki-67被異常激活表示細(xì)胞喪失正常成熟功能，可造成分化異常、增殖亢進(jìn)，而Ki-67 過(guò)表達(dá)表示細(xì)胞增殖活躍［19］。一般情況下，同一個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)P16、Ki-67 不可能同時(shí)表達(dá)，兩者作用相互拮抗，但兩者同時(shí)表達(dá)時(shí)即表示細(xì)胞周期失調(diào)，表示患者存在高級(jí)病變風(fēng)險(xiǎn)［20-21］。本研究中，HR-HPV、TCT、P16/Ki-67 雙染對(duì)宮頸病變?cè)\斷的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HR-HPV、TCT、P16/Ki-67 雙染診斷宮頸病變的曲線下面積（AUC）分別為0.917、0.835、0.888，P16/Ki-67 雙染檢測(cè)AUC 分別與TCT、HR-HPV 檢查相比也差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示P16/Ki-67雙染診斷準(zhǔn)確性與TCT、HR-HPV 檢查相似。P16/Ki-67 雙染以免疫組化為原理，檢測(cè)子宮頸脫落細(xì)胞涂片，其結(jié)果判讀依賴(lài)于光學(xué)顯微鏡下同一細(xì)胞內(nèi)的染色結(jié)果，具有良好的重現(xiàn)性，不依賴(lài)于細(xì)胞學(xué)形態(tài)檢測(cè)，能夠檢出真正的病變細(xì)胞，且無(wú)須太過(guò)專(zhuān)業(yè)的讀片技術(shù)，細(xì)胞學(xué)醫(yī)師經(jīng)短期培訓(xùn)即可掌握。

綜上所述，P16/Ki-67 雙染篩查宮頸癌及癌前病變效果與TCT、HR-HPV 相似，其具有高效、客觀、簡(jiǎn)便、易重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，可作為宮頸癌及癌前病變初篩的新選擇［22］。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突