牛荷

6月28日，基因編輯領(lǐng)域備受矚目的張鋒團(tuán)隊(duì)在《自然》雜志發(fā)文稱，在真核生物中首次發(fā)現(xiàn)了“基因剪刀”。張鋒是美國麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)博德研究所的核心成員之一，也是麻省理工學(xué)院麥戈文腦研究所的研究員?；蚓庉嬁赏ㄟ^對(duì)基因組序列的精確修飾，為疾病治療提供新的精準(zhǔn)療法。

張鋒團(tuán)隊(duì)稱，研究人員在真核生物中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)RNA引導(dǎo)的DNA切割酶——Fanzor蛋白，該蛋白質(zhì)在真核生物中普遍存在。真核生物包括真菌、植物和動(dòng)物。這也意味著，RNA引導(dǎo)的DNA切割機(jī)制存在于所有生命體中。更重要的是，這一新“剪刀”可以被優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)對(duì)人類基因組的編輯。

7月1日，美國國家科學(xué)院和工程院院士、哈佛醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系教授喬治·丘奇接受《中國新聞周刊》采訪時(shí)表示，F(xiàn)anzor很難擊敗處于最好情況下的CRISPR/Cas9，后者基因編輯效率已經(jīng)接近100％。不過，當(dāng)處于最糟糕細(xì)胞類型和基因組位點(diǎn)組合的情況下，F(xiàn)anzor存在擊敗CRISPR/Cas9的可能性。喬治·丘奇被譽(yù)為基因組學(xué)之父，獲2016年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)提名，曾是張鋒的博士后導(dǎo)師。

更多真核生物“基因剪刀”或被發(fā)現(xiàn)

如今最廣泛使用的“基因剪刀”CRISPR/Cas存在于原核生物中，原核生物主要指細(xì)菌。2012年，法國科學(xué)家埃馬紐爾·夏彭蒂耶和美國科學(xué)家詹妮弗·杜德納在《科學(xué)》雜志發(fā)文并首次指出，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體外能“定點(diǎn)”對(duì)DNA切割，CRISPR在活細(xì)胞中有修改基因的能力。此后，科學(xué)家們一直想知道真核生物中是否存在類似系統(tǒng)，這也推動(dòng)了Fanzor系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核生物的一種天然免疫系統(tǒng)。某些細(xì)菌遭到病毒入侵后，能夠把病毒基因的一小段存儲(chǔ)到自身DNA里，這一存儲(chǔ)空間被稱為CRISPR。病毒再次入侵時(shí)，細(xì)菌能根據(jù)存寫的片段識(shí)別病毒，用“基因魔剪”將病毒的DNA切斷。CRISPR，即成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列。Cas蛋白是一種核酸內(nèi)切酶，對(duì)目的基因進(jìn)行剪切，如Cas9和Cas12。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是研究最深入、技術(shù)最成熟、應(yīng)用最廣泛的類別。

2021年9月，張鋒團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)》雜志發(fā)表一項(xiàng)研究，重建了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的進(jìn)化起源。該研究在細(xì)菌中鑒定出一類新的核酸酶，屬于RNA引導(dǎo)核酸酶，經(jīng)過設(shè)計(jì)，可用于在人類細(xì)胞中編輯基因。這類新的核酸酶被命名為“OMEGA”，這其中包括一種名為TnpB的核酸酶。該研究推測TnpB或是Cas12的祖先。

張鋒團(tuán)隊(duì)6月28日最新的研究表明，TnpB也可能是真核蛋白Fanzor的祖先，推測Fanzor酶也可能具有基因編輯能力。早在2013年，發(fā)表在《移動(dòng)DNA》上的一篇研究指出，這兩種蛋白有著某些共同點(diǎn)，并推測這些共同點(diǎn)對(duì)基因表達(dá)調(diào)控和天然化合物的合成，起至關(guān)重要的作用。

張鋒團(tuán)隊(duì)的最新研究中，研究人員通過從真菌、藻類、變形蟲等不同物種中分離出Fanzor蛋白，觀察發(fā)現(xiàn)其與TnpB蛋白、Cas12有相似結(jié)構(gòu)。研究人員認(rèn)為，“緊湊的Fanzor系統(tǒng)”比CRISPR/Cas系統(tǒng)更容易用于特定細(xì)胞和組織。通過提高靶向效率，這些Fanzor系統(tǒng)可成為編輯人類基因組的工具。

上海科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授、基因編輯中心主任陳佳告訴《中國新聞周刊》，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了目前廣泛應(yīng)用的CRISPR/Cas系統(tǒng)之外的一種新基因編輯系統(tǒng)。研究主要亮點(diǎn)在于，首次在真核生物中發(fā)現(xiàn)RNA介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)，而真核細(xì)胞和人體細(xì)胞結(jié)構(gòu)更接近。在陳佳看來，后續(xù)基因編輯的研究可能也會(huì)朝著這一方向開展。Fanzor屬于真核生物中第一代“剪刀”，后續(xù)二代、三代應(yīng)該也會(huì)很快被開發(fā)出來。

“這項(xiàng)研究為基因編輯提供一種新的備選方案，是該領(lǐng)域一項(xiàng)重要進(jìn)步?！比A中農(nóng)大動(dòng)物醫(yī)學(xué)院教授張安定告訴《中國新聞周刊》，2012年在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)具有里程碑意義，相當(dāng)于找到了細(xì)菌防御系統(tǒng)和新型基因編輯工具，張鋒團(tuán)隊(duì)在其中也作出重要貢獻(xiàn)。隨后他們開始尋找防御系統(tǒng)的源頭，現(xiàn)這一防御系統(tǒng)擴(kuò)大到了真核生物，這是比較大的突破。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)起作用的部分包括Cas9和負(fù)責(zé)在基因組上精確定位的向?qū)NA。通俗講，Cas9和向?qū)NA就像一把“剪刀”和一把“尺子”，“尺子”負(fù)責(zé)在基因組上精準(zhǔn)找到需要編輯的位置，“剪刀”對(duì)基因組剪切。完成目標(biāo)基因的剪切編輯之后，“剪刀”和“尺子”都會(huì)被細(xì)胞完全清除掉。

任何一種基因編輯技術(shù)，靶位點(diǎn)的選擇都是首要問題。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，剪切點(diǎn)只有位于處于特定位置的PAM序列的上游，才能夠被準(zhǔn)確識(shí)別和切割?！癈as酶切割DNA需要找到PAM序列，F(xiàn)anzor蛋白實(shí)現(xiàn)DNA切割，也需要找到一段特定的TAM序列。從這點(diǎn)來看，兩者比較相似，因?yàn)榍懈钇玫男蛄胁煌?，也存在序列互補(bǔ)性?！标惣颜f。

能替代CRISPR/Cas“魔剪”嗎？

前述最新研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)，在所檢測的4種Fanzor蛋白中，有3種蛋白對(duì)特定DNA序列編輯的效率達(dá)到11.8％。這一水平與早期版本CRISPR系統(tǒng)相當(dāng)，但低于優(yōu)化過后的CRISPR系統(tǒng)。之后，通過工程化技術(shù)，研究人員在Fanzor蛋白中引入了特定突變，使其活性增加約10倍。

陳佳告訴《中國新聞周刊》，從2012年CRISPR系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)至今，全球很多實(shí)驗(yàn)室在CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)化和改造方面投入巨大。即便在這項(xiàng)工作中Fanzor的編輯效率較其初始狀態(tài)提高了10倍，但還是達(dá)不到CRISPR/Cas9目前的編輯效率。不過，F(xiàn)anzor有其自身優(yōu)勢(shì)，與CRISPR蛋白不同，F(xiàn)anzor本身源自真核系統(tǒng)，有可能在臨床治療中能避免非必要的免疫反應(yīng)。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)較成熟，F(xiàn)anzor未來通過優(yōu)化，也可能實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)高效的切割。

與某些CRISPR系統(tǒng)和TnpB蛋白不同，研究人員觀察到，真菌衍生的Fanzor蛋白不表現(xiàn)出“附帶活性”。附帶活性是指當(dāng)RNA引導(dǎo)的“剪刀”靶向切割DNA時(shí)，會(huì)同時(shí)降解鄰近的DNA或RNA。因此，F(xiàn)anzor蛋白被視為更具專一性。

近日，張鋒接受外媒采訪時(shí)表示，F(xiàn)anzor蛋白的尺寸較小，含有400～700個(gè)氨基酸不等。CRISPR中最常用的Cas9蛋白約含1000～1600個(gè)氨基酸?！熬庉嬈髟酱?，遞送到體內(nèi)就越困難?！彼f。據(jù)2021年9月張鋒團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)》雜志的研究，被稱為“OMEGA”的一類核酸酶很小，約為Cas9的30％，它們可能更容易被遞送到細(xì)胞中。

張鋒。圖/博德研究所

在陳佳看來，很多基因編輯系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)室水平效果不錯(cuò)，但進(jìn)展到人體臨床試驗(yàn)水平，編輯效率不一定高，出現(xiàn)這種問題的主要原因在于遞送過程。在CRISPR系統(tǒng)對(duì)基因進(jìn)行編輯時(shí)，需要通過載體將這些大蛋白遞送到體內(nèi)準(zhǔn)確位置才能發(fā)揮作用。相較Cas9，F(xiàn)anzor蛋白體積小，在遞送過程中更靈活、便利。

在張安定看來，選擇怎樣的基因編輯工具，取決于實(shí)際應(yīng)用的目的，基因編輯效率和脫靶是重要的考慮因素。雖然CRISPR/Cas系統(tǒng)已被廣泛使用，但它并非“包打天下”，其在有些細(xì)胞中的效率并不高，且存在脫靶等安全隱患。Fanzor蛋白更小，可能在一定場景下使用時(shí)更有優(yōu)勢(shì)?！把芯恐袥]有提到Fanzor蛋白是否能避免潛在的脫靶等問題，但也可能和Cas一樣，需要通過后續(xù)研究進(jìn)一步提高基因編輯活性和減少潛在脫靶等問題?！彼f。

“到目前為止，還沒有出現(xiàn)超越CRISPR的技術(shù)。Fanzor想在應(yīng)用上取代CRISPR/Cas系統(tǒng)，還有很長的路要走。”中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院教授陳其軍告訴《中國新聞周刊》，盡管Fanzor系統(tǒng)在基因治療上存在遞送藥物優(yōu)勢(shì)，但如果編輯效率不高，靶點(diǎn)受太多限制，在醫(yī)療上的應(yīng)用也很難超越CRISPR/Cas。

Fanzor蛋白冷凍電鏡結(jié)構(gòu)示意圖。圖/張鋒實(shí)驗(yàn)室

目前尚無CRISPR基因療法獲批

CRISPR基因編輯技術(shù)，無疑是目前生物技術(shù)領(lǐng)域最具革命性的突破之一。2020年，夏彭蒂耶和杜德納因發(fā)現(xiàn)“基因剪刀”CRISPR/Cas9，共同獲得當(dāng)年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，獲獎(jiǎng)時(shí)距離這項(xiàng)技術(shù)被發(fā)明還不到10年。

張鋒無緣諾獎(jiǎng)，卻贏了專利之爭。2013年年初，張鋒等人首次將CRISPR/Cas9技術(shù)成功應(yīng)用于哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞的基因編輯。同年，丘奇在《科學(xué)》雜志上發(fā)表的研究也顯示，CRISPR系統(tǒng)可用于人類細(xì)胞基因組編輯。

這些進(jìn)展極大推動(dòng)了CRISPR/Cas9技術(shù)的推廣和應(yīng)用。自2013年起，張鋒和前述兩名諾獎(jiǎng)獲得者均基于該技術(shù)創(chuàng)立了多家公司。此后，張鋒與杜德納和夏彭蒂耶等人著名的專利權(quán)之爭拉開序幕。

2022年2月，美國專利和商標(biāo)局裁定，張鋒團(tuán)隊(duì)擁有在真核細(xì)胞中使用CRISPR基因編輯技術(shù)的專利。這意味著，張鋒和他所在的博德研究所在美國擁有CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于所有真核生物的專利，包括植物、動(dòng)物和人類。這是CRISPR技術(shù)商業(yè)化最為核心的專利之一。

近年來，科學(xué)家們?cè)贑RISPR/Cas9治療疾病領(lǐng)域持續(xù)探索。2020年，四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤科盧鈾團(tuán)隊(duì)在《自然-醫(yī)學(xué)》發(fā)布Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果，表明用使用CRISPR/Cas9技術(shù)治療難治性非小細(xì)胞肺癌患者安全可行。

在陳佳看來，目前基因編輯治療在地中海貧血癥、鐮刀貧血癥等血液類遺傳病治療領(lǐng)域走得靠前，國內(nèi)外已有幾項(xiàng)關(guān)鍵性治療管線進(jìn)入臨床階段。此外，通用型CAR-T聯(lián)合基因編輯療法，目前研究進(jìn)展也比較快。

2022年3月17日，國家藥監(jiān)局藥品審評(píng)中心官網(wǎng)顯示，南京北恒生物科技有限公司自主研發(fā)的細(xì)胞注射液產(chǎn)品獲得國家藥監(jiān)局的臨床試驗(yàn)?zāi)驹S可。該產(chǎn)品屬于通用型CAR-T，用于治療成人復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病，是國內(nèi)首個(gè)基于CRISPR基因編輯技術(shù)的免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品。

丘奇告訴《中國新聞周刊》，F(xiàn)anzor的商業(yè)前景和其他數(shù)百種內(nèi)切酶相似。不過，F(xiàn)anzor距離真正商業(yè)化應(yīng)用，似乎還有很遠(yuǎn)。因?yàn)榧幢闶且延胁簧倥R床研究進(jìn)展的CRISPR/Cas技術(shù)，目前獲批的相關(guān)基因療法數(shù)目仍為0。

“迄今為止，已獲美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的基因療法共有12種，均不涉及CRISPR?！鼻鹌姹硎荆@種情況將在2023年12月8日改變，目前有一種CRISPR相關(guān)的基因療法處于生物制劑許可申請(qǐng)（BLA）階段。一般藥物的Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)束，被驗(yàn)證安全性、有效性之后，可以正式向FDA提交BLA申請(qǐng)。

6月8日，美國食品和藥物管理局（FDA）宣布，接受名為exa-cel療法的生物制品許可申請(qǐng)。該療法由美國福泰制藥與瑞士基因編輯公司CRISPR Therapeutics合作開發(fā)，用于治療嚴(yán)重鐮狀細(xì)胞病和輸血依賴性β地中海貧血，能夠幫助患者有效擺脫輸血和血管阻塞危機(jī)。美國福泰制藥當(dāng)日發(fā)表的新聞稿稱，“這種療法有望成為第一個(gè)獲得批準(zhǔn)的CRISPR基因編輯療法。”CRISPR Therapeutics的創(chuàng)始人正是2020年憑借CRISPR基因編輯獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的夏彭蒂耶。

為何真正能走向獲批的CRISPR基因療法很少？丘奇解釋，CRISPR主要用于“減法”，即對(duì)目標(biāo)基因完成剪切、編輯。他表示，一般遺傳性血管性水腫等顯性疾病可以通過減少突變等位基因來治療，但這種情況非常罕見。疾病治療時(shí)通常需要“加法”，比如，所有的衰老基因療法都是添加基因，很多情況下，疫苗制備要添加一個(gè)或多個(gè)外源基因。

“基因編輯的工具箱越大，可選方式越多，對(duì)科學(xué)研究和臨床治療的幫助就越大?！标惣驯硎?。在他看來，如果后續(xù)僅把Fanzor用作內(nèi)切酶進(jìn)行基因編輯治療，也會(huì)面臨和CRISPR/Cas9一樣的風(fēng)險(xiǎn)；如果將Fanzor作為平臺(tái)開發(fā)新型的堿基編輯器等，可能實(shí)現(xiàn)更安全的基因編輯治療。

堿基編輯系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)單核苷酸精度的DNA或RNA編輯。6月27日，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞等發(fā)表在《細(xì)胞》雜志的一項(xiàng)研究，運(yùn)用AI輔助結(jié)構(gòu)預(yù)測，開發(fā)了一系列新型堿基編輯工具，在小鼠細(xì)胞系中成功獲得高達(dá)43.1％的編輯效率，解決了常規(guī)堿基編輯器過大而無法被遞送的難題。

在丘奇看來，基于Fanzor系統(tǒng)的基因編輯療法未來也可能會(huì)獲FDA批準(zhǔn)上市。“但許多天然存在或人工合成的新RNA可編程系統(tǒng)占比不大，相對(duì)應(yīng)地，簡單的添加性基因治療方法正在迅速發(fā)展?！鼻鹌姹硎尽?/p>