季文靜，謝 暉，吳靳榮，倪梁紅*，趙志禮*

基于UPLC-LTQ-Orbitrap MS/MS法對粗莖秦艽藥材不同初加工品化學成分的分析

季文靜1，謝 暉2，吳靳榮1，倪梁紅1*，趙志禮1*

1. 上海中醫(yī)藥大學，上海 201203 2. 復(fù)旦大學，上海 200433

基于代謝組學方法研究不同加工方法下粗莖秦艽藥材次生代謝化合物的差異，為優(yōu)化粗莖秦艽藥材的加工及干燥方法提供科學依據(jù)。收集云南麗江產(chǎn)粗莖秦艽藥材，分別進行產(chǎn)地和藥廠加工，加工方式包括切片、原個子（不切片），干燥方式包括烘干、曬干和“發(fā)汗”。采用超高效液相色譜-離子阱-靜電場軌道阱質(zhì)譜（UPLC-LTQ-Orbitrap-MS）技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法，對各樣品的次生代謝產(chǎn)物進行分析，篩查其差異性的特征化合物。共鑒定出44個化學成分。主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果表明，根與蘆頭（根莖）的化學成分存在較大的差異，根的切片組、原個子組有明顯區(qū)分。正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）表明，三年生藥材質(zhì)量優(yōu)于二年生藥材，根的質(zhì)量優(yōu)于蘆頭，切片組優(yōu)于原個子組，不同干燥方法中曬干組藥材的質(zhì)量較優(yōu)，藥廠加工藥材質(zhì)量均優(yōu)于產(chǎn)地加工藥材，并分析得到各組間主要差異化合物。粗莖秦艽藥材加工時，建議選用三年生藥材，去除蘆頭部位，并進行趁鮮切片及曬干處理。可為粗莖秦艽藥材初加工工藝、質(zhì)量控制與合理應(yīng)用提供科學資料。

粗莖秦艽；UPLC-LTQ-Orbitrap-MS；代謝組學；加工方法；干燥方式；龍膽苦苷；馬錢苷酸；獐牙菜苷；獐牙菜苦苷；6′--β-葡萄糖基龍膽苦苷

粗莖秦艽Duthie ex Burk.為龍膽科龍膽屬(Tourn.) L.秦艽組Sect.Gaudin植物，是《中國藥典》2020年版收載的秦艽基原植物之一，根入藥，具有祛風濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱的功效[1]。粗莖秦艽主要含有環(huán)烯醚萜類、黃酮類、三萜類藥效成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等藥理作用[2]。

中藥的質(zhì)量受生長環(huán)境、栽培條件、采收加工等多種因素的影響[3-4]。中藥材經(jīng)過加工炮制以后，會發(fā)生復(fù)雜的化學變化，將中藥“質(zhì)量標志物”的研究與加工炮制相結(jié)合，闡明中藥加工過程中化學成分發(fā)生的變化，對中藥質(zhì)量控制具有指導(dǎo)意義[5]。切片和干燥是中藥材初加工過程中不可或缺的關(guān)鍵操作。在干燥過程中，常涉及溫度變化，易引起藥材中有效成分和生物活性的變化，進而影響到中藥材的藥用價值和經(jīng)濟價值。如有研究趁鮮切制干燥對三七藥材外觀品質(zhì)和內(nèi)在成分的影響[6]，以及考察干燥溫度對黨參藥材品質(zhì)的影響，優(yōu)化產(chǎn)地加工工藝[7]?！吨袊幍洹?020年版對粗莖秦艽的加工炮制方法較為籠統(tǒng)：“鮮原藥材-去泥沙-發(fā)汗或否-曬干；干燥原藥材洗凈-潤透-切厚片-干燥[1]”。有研究表明，不同干燥方式對秦艽藥材中主要有效成分的含量有一定影響[8-9]，但目前對秦艽初加工方法的系統(tǒng)性研究還較少。云南麗江為粗莖秦艽的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，其加工炮制工藝具有代表性。課題組前期應(yīng)用HPLC含量測定、指紋圖譜分析方法對該地區(qū)不同加工方式的粗莖秦艽栽培藥材進行化學成分比較分析，得出不同初加工方法對藥材品質(zhì)具有較為明顯的影響[10]。

超高效液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜（UPLC-LTQ-Orbitrap-MS）是基于LTQ的多級質(zhì)譜功能及Orbitrap高分辨能力的一種分析方法。前者（LTQ）富集樣品離子并產(chǎn)生碎片，通過C-Trap注射入后者（Orbitrap）進行高分辨掃描。LTQ-Orbitrap質(zhì)譜靈敏度不受分辨率影響，低分子量不影響分析時質(zhì)量準確度，能夠承載高濃度樣品，動態(tài)范圍大。這些特點使LTQ-Orbitrap質(zhì)譜適合復(fù)雜混合物體系和較寬的濃度范圍樣品分析[11-12]，已廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)雜化學成分的分析[13-15]。

本研究采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式，結(jié)合代謝組學多元統(tǒng)計技術(shù)，在前期工作的基礎(chǔ)上，進一步對麗江產(chǎn)粗莖秦艽進行初加工方法評價，識別并區(qū)分不同工藝、干燥方式處理后的差異性成分，以期為優(yōu)化粗莖秦艽藥材初加工方法提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：Ultimate 3000超高液相色譜儀、LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BSA124S-CW型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Milli-Q型超純水機（美國Millipore公司）；5810R型臺式離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

龍膽苦苷（批號Y30J9Q66926）、馬錢苷酸（批號J22S6J3607）、獐牙菜苷（批號Y09J8C28349）、獐牙菜苦苷（批號Z05M10X87215）、6′--β-葡萄糖基龍膽苦苷（批號X25F10X81442）購自上海研謹生物科技有限公司；槲皮素（批號100081-201610）、阿魏酸（批號110773-201915）購自中國食品藥品檢定研究所；山柰酚（批號C26J8Y38642，上海源葉生物科技有限公司）；木犀草素（批號111520-200201，中國藥品生物制品檢定所）；蘆丁（批號MUST-20011302，成都曼思特生物科技有限公司）；對照品質(zhì)量分數(shù)均大于98.0%。乙腈、甲醇（美國Supelco公司），甲酸（上海安譜實驗科技股份有限公司），均為色譜級。

1.3 材料

2020年12月3日，于云南省麗江市魯?shù)猷l(xiāng)試驗樣地（E 99° 29' 12.8''，N 27° 9' 24''）采挖三年生粗莖秦艽的根，同時取適量二年生粗莖秦艽的根。憑證標本均經(jīng)上海中醫(yī)藥大學趙志禮教授鑒定為粗莖秦艽Duthie ex Burk.，存放于上海中醫(yī)藥大學中藥學院藥用植物標本室。

藥材分別于產(chǎn)地、藥廠進行加工處理。產(chǎn)地加工時，不除去蘆頭（根莖）；藥廠加工時，除去蘆頭，將蘆頭單獨設(shè)為一實驗組。炮制加工方法：①切片，或不切片（原個子）；②干燥方式：產(chǎn)地分為曬干、烘干；藥廠分為曬干、烘干、“發(fā)汗”處理。實驗樣品共分為12組，編號A～L。詳見表1。

表1 粗莖秦艽藥材不同加工樣品

Table 1 Information of sample processing

加工地點干燥方法加工方法編號 產(chǎn)地加工烘干組（三年生）原個子A 切片B 曬干組（三年生）原個子C 切片D 烘干組（二年生）原個子E 藥廠加工烘干組（三年生）原個子F 切片G “發(fā)汗”組（三年生）原個子H 切片I 曬干組（三年生）原個子J 切片K 蘆頭（三年生）不加工L

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

藥材粉碎過三號篩，分別取樣品粉末0.5 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，精密加入色譜級甲醇溶液20 mL。在35 ℃條件下，超聲提取30 min（400 W、40 kHz），取出，冷卻至室溫，補足減失的質(zhì)量。5000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，即得。

2.2 對照品溶液的制備

分別取馬錢苷酸、龍膽苦苷、6′--β-葡萄糖基龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷5種對照品適量，置10 mL量瓶中，加入甲醇定容，分別制成質(zhì)量濃度為1.142、1.606、0.618、0.456、0.200 4 mg/mL的混合對照品溶液A；分別取山柰酚、槲皮素、阿魏酸對照品適量，置10 mL量瓶中，加入甲醇定容，分別制成質(zhì)量濃度為0.097 60、0.236 00、0.010 63 mg/mL的混合對照品溶液B；分別取木犀草素、蘆丁對照品適量，置10 mL量瓶中，加入甲醇定容，分別制成質(zhì)量濃度為0.010 68、0.003 60 mg/mL的混合對照品溶液C。置于4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?，進樣前用0.22 μm微孔濾膜濾過。

2.3 分析方法

2.3.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流動相由0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）組成。梯度洗脫：0～2 min，5% B；2～5 min，5%～12% B；5～15 min，12%～40% B；15～18 min，40% B；18～25 min，40%～95% B；25～35 min，95% B；35～40 min，95%～5% B。體積流量為0.3 mL/min，自動進樣器溫度為4 ℃，柱溫箱溫度為40 ℃，進樣量為2 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 正負離子模式下噴霧電壓分別為3.8 kV和?4.0 kV；離子源溫度和毛細管溫度分別為350 ℃和350 ℃。鞘氣和輔助氣的流量分別為40 arb和20 arb。離子傳輸透鏡S-RFlens為30%。MS1以fullMS掃描模式檢測成分，檢測范圍為/50～1200，分辨率為60 000。多級質(zhì)譜（MS2、MS3）均采用數(shù)據(jù)依賴性掃描模式（data-dependentscanmode）進行分析，分辨率為30 000 Hz。在質(zhì)譜掃描事件中，選擇響應(yīng)最高的離子為母離子進行裂解。裂解方式選擇碰撞誘導(dǎo)離解（collisioninduced- dissociation），歸一化碰撞能量設(shè)置為35%，間隔寬度為2.0/。激活Q（activation Q）為0.250，激活時間為10 ms。

2.3.3 進樣規(guī)則 按“2.1”項所述方法，每組粗莖秦艽樣品分別平行制備3份供試液，共得36份供試液，按照生成的隨機數(shù)亂序放置進樣室內(nèi)，同時每隔6份樣品溶液插入1份QC樣品，共計進樣42份。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Thermo Xcalibur Qual Browser 2.2軟件進行數(shù)據(jù)分析和處理。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca-p14.1軟件進行無監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，），初步觀察12批樣品的聚集情況，再結(jié)合正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis）模型的Loading plot圖、S-plot圖與VIP值尋找不同比較組間的差異成分，從整體到部分全面分析粗莖秦艽不同加工方式（切片與不切片）、不同干燥方法的組份差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 質(zhì)譜成分指認

正、負離子模式下混合樣品的總離子流圖見圖1。將11個對照品圖譜的保留時間和碎片離子信息比對，檢索Compound Discovery軟件數(shù)據(jù)庫和相應(yīng)的文獻，結(jié)合Massfrontier7.0軟件比較分析化合物的質(zhì)譜信息，對其主要成分組成峰進行鑒定。共推測鑒定出44個化合物。其中環(huán)烯醚萜類14個、黃酮類12個、三萜類6個、糖類3個、有機酸類3個、苯丙素類1個、香豆素類1個、其他類4個；另有1個未知化合物。各化合物的保留時間、精確相對分子質(zhì)量、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)等見表2。

圖1 粗莖秦艽UPLC-LTQ-Orbitrap-MS的負離子(A) 和正離子(B) 總離子流圖

表2 粗莖秦艽化學成分保留時間及質(zhì)譜參數(shù)

Table 2 Retention time and mass parameters of compounds of G. crassicaulis

編號tR/min分子式實測值(m/z)碎片離子(m/z)化合物偏差/(×10?6) 10.80C12H22O11341.107 57 [M－H]?179.056 2、161.045 8、119.035 2、89.024 6蔗糖?2.657 20.82C13H24O13387.112 64 [M－H]?341.107 5、179.055 8、119.036 0、89.024 5未知?3.166 30.86C18H32O16503.160 03 [M－H]?503.160 0、341.108 6、179.056 0棉籽糖?5.510 41.11C6H8O7191.019 24 [M－H]?191.019 4、129.019 4、111.008 8、87.008 8檸檬酸0.275 51.59C16H24O11391.122 59 [M－H]?391.122 8、229.071 2、185.081 5山梔苷?2.854 62.26C9H14O3169.086 70 [M－H]?125.097 4、123.061 3、121.031 4isoboonein?2.854 72.96C13H16O9315.070 62 [M－H]?216.928 4、153.019 3、109.029 35-(β-D-glucopyranosyl)-2-hydroxybenzoicacid?2.180 84.04C17H26O11405.138 34 [M－H]?179.056 0、161.045 3、119.035 1、89.024 5山梔苷甲酯?3.323 94.41C17H26O11405.138 43 [M－H]?179.056 2、119.035 3、89.025 6莫諾苷?3.175 10*5.41C16H24O10375.128 02 [M－H]?213.076 4、169.087 0、113.024 6、89.024 5馬錢苷酸?2.697 115.60C22H34O15537.179 69 [M－H]?375.128 7、357.117 2、213.076 4、169.086 8loganicacid11-O-β-glucopyranosylester?3.974 126.42C16H22O11389.107 15 [M－H]?389.107 5、345.118 2、183.066 1、121.066 0四乙酰開聯(lián)番木鱉苷?3.254 136.44C15H22O9345.117 71 [M－H]?213.076 4、183.066 1、165.055 6、89.024 6swertiajaposide B?2.280 146.51C17H24O10387.128 05 [M－H]?225.076 4、179.056 0、89.024 5馬鞭草苷?1.584 15*6.58C22H30O14517.154 17 [M－H]?179.056 0、149.060 9、119.035 1、89.024 56′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷?3.249 16*6.60C16H22O10419.117 03 [M－H]?373.110 7、179.055 9、141.019 4、89.024 5獐牙菜苦苷?2.148 176.63C9H8O4179.034 62 [M－H]?179.034 6、135.045 25-乙?；畻钏?0.420 186.87C22H32O14519.169 25 [M－H]?519.169 8、195.065 9、125.024 5紫藥苦苷?3.757 19*6.88C27H30O16609.142 40 [M－H]?609.143 6、447.091 8、357.060 8、327.050 2蘆丁?5.920 206.99C10H8O5209.044 65 [M＋H]+191.034 1、163.039 3、135.044 2秦皮素2.090 217.01C27H30O15593.148 32 [M－H]?575.138 4、503.118 0、473.107 6、311.052 6皂草黃苷?5.560 22*7.30C16H20O9355.102 26 [M－H]?355.112 9、149.056 6、119.035 2、89.024 6龍膽苦苷?1.906 237.35C26H28O12531.147 16 [M－H]?235.060 6、193.050 3、149.060 8gentimacroside?3.410 24*7.63C16H22O9403.122 50 [M＋HCOOH－H]?357.118 3、195.066 1、179.056 0、125.024 6獐牙菜苷?2.288 258.43C21H20O11447.090 82 [M－H]?429.080 9、357.060 5、327.050 1異葒草素?4.650 268.90C21H20O10431.096 31 [M－H]?413.086 7、341.065 6、311.055 0、牡荊素?4.624 27*8.91C10H10O4193.048 69 [M－H]?178.026 8、149.060 8、134.037 5阿魏酸?1.426

續(xù)表2

編號tR/min分子式實測值(m/z)碎片離子(m/z)化合物偏差/% 289.31C17H24O11431.096 19 [M－H]?413.086 7、341.065 6、311.055 6異牡荊素?4.850 2910.26C27H32O14579.167 72 [M－H]?459.112 8、313.070 6、271.060 2、151.003 6柚皮苷?5.470 3010.38C15H10O7519.184 69 [M－H]?357.133 1、342.107 5、151.040 06′-O-β-D-葡萄糖基獐牙菜苷?2.096 3110.51C28H34O15609.179 14 [M－H]?609.179 4、325.070 7、301.070 6橙皮苷?5.400 3211.46C25H34O14557.184 63 [M－H]?323.097 9、233.081 5、189.092 0、119.035 2大葉苷D?2.767 3312.81C24H28O11491.154 21 [M－H]?191.055 7、149.045 5、89.024 4大葉苷A?1.177 34*12.91C15H10O6285.038 76 [M－H]?257.044 5、241.049 7、177.019 0、木犀草素?3.970 35*12.93C15H10O7301.033 87 [M－H]?301.034 3、193.013 8、151.003 7、槲皮素?1.957 3613.94C15H10O5269.044 46 [M－H]?269.044 7、247.437 0、117.029 0芹菜素?3.650 37*14.24C15H10O6285.039 22 [M－H]?285.093 4、257.044 5、151.003 6山柰酚0.335 3814.50C14H10O6273.039 28 [M－H]?273.039 4、229.049 8、137.024 4當藥寧?4.140 3920.49C30H48O6503.335 50 [M－H]?503.335 6、326.540 1、125.954 7arjungenin?5.040 4023.86C30H48O4471.345 67 [M－H]?471.346 1、430.897 6、314.059 2科羅索酸?2.581 4125.71C30H48O3455.350 80 [M+H]+455.351 3、142.306 7、136.725 8熊果酸?4.680 4226.82C16H32O2255.232 18 [M－H]?255.232 3、114.934 2棕櫚酸?3.470 4327.36C29H44O2423.324 83 [M－H]?423.324 7、394.900 1、205.159 4vaticinone?4.720 4429.16C30H48O3455.351 07 [M＋H]+455.350 8、397.309 5、95.834 4齊墩果酸?4.260 4530.97C29H50O457.366 97[M＋HCOOH－H]?457.366 7、441.330 5β-谷甾醇?2.278

*通過對照品對比確認

*identified by comparing with reference standards

3.2 粗莖秦艽化學成分的主成分分析

利用Simca14.1軟件對在負離子模式下采集的所有樣本數(shù)據(jù)進行PCA，其中9個主成分的特征值＞1，占總方差的74%。6份QC樣品在PCA分析圖中分布集中，表明方法穩(wěn)定性高，數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。粗莖秦艽所有加工組成分的PCA得分圖見圖2，根聚為一簇，根莖（蘆頭）為單獨一類，表明不同部位間差異明顯。同時，根的切片組樣品、原個子組樣品也分別各自聚在一起，表明藥材切片與否對樣品化學成分的變化存在一定影響。

3.3 不同年限與不同部位的粗莖秦艽化學成分的主成分分析

OPLS-DA是一種有監(jiān)督的分析方法，可用于確定2組間的代謝差異物[16]。對不同年限（二年生、三年生）粗莖秦艽藥材的化學成分進行OPLS-DA分析，交叉驗證參數(shù)2X、2、2分別為0.901、1.000、0.992，均遠大于0.5，提示模型具有很好的穩(wěn)定性和預(yù)測能力。以VIP＞3、檢驗的＜0.05，同時存在于各樣品中并且含量具有明顯差異為標準（下同），共鑒定出6個差異明顯的化合物（圖3），分別為龍膽苦苷、馬錢苷酸、6′-β-葡萄糖基龍膽苦苷、檸檬酸、十四烷基硫酸酯和十八烷基-3-[(2, 6-二異丙基苯)氨基酯]-3-氧代丙酸乙酯。差異化合物含量由利用Compound Discovery軟件匹配得到的數(shù)據(jù)矩陣中的化合物的峰面積表示。根據(jù)差異化合物含量高低，得出三年生藥材質(zhì)量優(yōu)于二年生藥材。

圖2 粗莖秦艽樣品PCA得分圖

對不同部位（根、蘆頭）粗莖秦艽藥材的化學成分進行OPLS-DA分析，交叉驗證參數(shù)2、2、2分別為0.634、0.992、0.958。共鑒定出3個差異明顯的化合物（圖4），分別為龍膽苦苷、6′-β-葡萄糖基龍膽苦苷、4-十一烷基苯磺酸。根據(jù)差異化合物含量高低，得出根的質(zhì)量明顯優(yōu)于蘆頭。

3.4 不同干燥方法下粗莖秦艽的差異化合物篩查

為進一步明確不同干燥方法下粗莖秦艽藥材的組間差異性，尋找樣品間化學成分變化的特征性指標，采用OPLS-DA分別對產(chǎn)地、藥廠不同干燥方法的數(shù)據(jù)作進一步分析（均用三年生根平行比較）。表3為不同干燥方法下樣品的OPLS-DA分析結(jié)果。

各組別的交叉驗證參數(shù)2、2、2均大于0.5。不同組別的干燥方法間共鑒定出11種差異化合物，其中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和檸檬酸為各組別間共有的差異化合物。根據(jù)差異化合物含量高低，可以得出產(chǎn)地加工藥材中，曬干組優(yōu)于烘干組；藥廠加工藥材中，曬干組質(zhì)量最優(yōu)，其次為“發(fā)汗”組，最后為烘干組。

圖3 二年生和三年生樣品的OPLS-DAS-plot圖

圖4 蘆頭和根的OPLS-DAS-plot圖

表3 不同干燥方法組OPLS-DA結(jié)果

Table 3 OPLS-DA results of different drying groups

比較組別R2XR2YQ2差異化合物 烘干vs曬干（產(chǎn)地加工）0.7980.9990.5862-羥基苯乙酸、龍膽苦苷、馬錢苷酸、檸檬酸、葡萄糖酸、十八烷基-3-[(2,6-二異丙基苯)氨基]酯]-3-氧代丙酸乙酯、十四烷基硫酸酯、獐牙菜苦苷 烘干vs曬干（藥廠加工）0.7390.9970.6864-十一烷基苯磺酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、檸檬酸、十八烷基-3-[(2,6-二異丙基苯)氨基酯]-3-氧代丙酸乙酯、十四烷基硫酸酯、獐牙菜苦苷 烘干vs發(fā)汗（藥廠加工）0.7060.9970.8886′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、馬錢苷酸、檸檬酸、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷 曬干vs發(fā)汗（藥廠加工）0.8371.0000.8704-十一烷基苯磺酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、檸檬酸、葡萄糖酸、十八烷基-3-[(2, 6-二異丙基苯)氨基酯]-3-氧代丙酸乙酯、十四烷基硫酸酯、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷

產(chǎn)地加工條件下，曬干組中龍膽苦苷、馬錢苷酸、檸檬酸和葡萄糖酸含量遠高于烘干組。藥廠加工條件下，曬干組中6′-β-葡萄糖基龍膽苦苷、檸檬酸、4-十一烷基苯磺酸、葡萄糖酸和十四烷基硫酸酯的含量較“發(fā)汗”組高，獐牙菜苦苷、檸檬酸、4-十一烷基苯磺酸以及十四烷基硫酸酯高于烘干組；“發(fā)汗”組中，龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷的含量較烘干組、曬干組高。

3.5 不同加工方法粗莖秦艽的差異化合物篩查

為了明確切片和原個子樣品間的差異，采用OPLS-DA分別對產(chǎn)地和藥廠加工中的2種加工方式進行比較分析（均用三年生根平行比較），分析結(jié)果見表4。

不同加工方法間共鑒定出10種差異化合物，其中龍膽苦苷、馬錢苷酸、6′-β--葡萄糖基龍膽苦苷、十八烷基-3-[(2,6-二異丙基苯)氨基酯］-3-氧代丙酸乙酯、十四烷基硫酸酯和檸檬酸為共有的差異化合物。根據(jù)差異化合物含量高低，可以得出，無論是產(chǎn)地或藥廠加工，切片組藥材的主要差異化合物含量普遍高于原個子組。產(chǎn)地切片組藥材中，馬錢苷酸、6′-β--葡萄糖基龍膽苦苷、檸檬酸、十八烷基- 3-[(2,6-二異丙基苯)氨基酯]-3-氧代丙酸乙酯和十四烷基硫酸酯等成分含量高于原個子組；藥廠切片組的龍膽苦苷、馬錢苷酸和獐牙菜苦苷等環(huán)烯醚萜類化合物含量遠高于原個子組。

表4 不同加工方法組OPLS-DA結(jié)果

Table 4 OPLS-DA results of sliced roots and whole roots

比較組別R2XR2YQ2差異化合物 切片vs原個子（產(chǎn)地加工）0.8471.0000.9846′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、5-乙基環(huán)己烷-1,3-二酮、龍膽苦苷、馬錢苷酸、檸檬酸、十八烷基-3-[(2,6-二異丙基苯)氨基]酯]-3-氧代丙酸乙酯、十四烷基硫酸酯、獐牙菜苷 切片vs原個子（藥廠加工）0.5180.9890.5834-十一烷基苯磺酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、馬錢苷酸、檸檬酸、十八烷基-3- [(2,6-二異丙基苯)氨基]酯]-3-氧代丙酸乙酯、十四烷基硫酸酯、獐牙菜苦苷

3.6 藥廠加工與產(chǎn)地加工的粗莖秦艽化學成分的主成分分析

平行選取三年生烘干及曬干樣品，分別對藥廠、產(chǎn)地加工藥材的化學成分進行PCA和OPLS-DA分析（圖5）。使用PCA對數(shù)據(jù)進行處理，其中8個主成分的特征值＞1，占總方差的77%，由得分圖可以看出，產(chǎn)地加工樣品、藥廠加工樣品各自聚在一起，能夠明顯區(qū)分；OPLS-DA的交叉驗證參數(shù)2、2、2為0.693、0.992、0.770，共鑒定出5個差異明顯的化合物，分別為龍膽苦苷、馬錢苷酸、十四烷基硫酸酯、4-十一烷基苯磺酸和5,7-二羥基-4-丙基香豆素。根據(jù)差異化合物含量高低，藥廠加工藥材質(zhì)量優(yōu)于產(chǎn)地加工藥材。

圖5 產(chǎn)地與藥廠加工樣品的PCA得分圖(A)及OPLS-DA的S-plot圖(B)

4 討論

本實驗對粗莖秦艽藥材不同初加工樣品進行較為系統(tǒng)的化學成分比較分析，顯示蘆頭與根之間存在較大的差異；切片與原個子及不同干燥方法間也有明顯區(qū)分，表明藥材的部位及加工方式對化學成分具有一定影響，與前期HPLC分析方法評價基本結(jié)果一致[10]。同時，藥廠加工樣品均優(yōu)于產(chǎn)地加工樣品，分析可能有以下因素：首先是藥材本身，產(chǎn)地加工的樣品不除去蘆頭，而藥廠加工的樣品去除蘆頭；其次為干燥方式，產(chǎn)地烘干為傳統(tǒng)的炭火烘烤，藥廠加工則使用烘箱烘干，曬干方式上，藥廠有藥材專用的曬干場地，規(guī)范且統(tǒng)一。

UPLC-LTQ-Orbitrap高分辨質(zhì)譜采用全掃描模式，分別測定正、負離子模式下的總離子流圖，裂解方式采用了CID方式，絕大部分的化合物在此方式下均能產(chǎn)生更多的碎片信息，在保證預(yù)測化合物分子式的準確性前提下，更全面地鑒定粗莖秦艽中的化學成分。本研究運用UPLC-LTQ-Orbitrap MS技術(shù)，對不同加工方法下粗莖秦艽藥材中的化學成分進行表征分析，基于化合物相關(guān)數(shù)據(jù)庫、對照品指認和多級質(zhì)譜碎片離子等信息，并結(jié)合相關(guān)文獻報道，共鑒定出44個化合物，包括環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、三萜類、糖類、有機酸類、苯丙素類、香豆素類和其他類化合物，其中以環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類化合物居多。環(huán)烯醚萜苷類成分在負離子模式下傾向于丟失環(huán)烯醚萜母核、H2O和發(fā)生逆RDA反應(yīng)在環(huán)烯醚萜骨架；黃酮類成分在負離子模式下傾向于通過RDA反應(yīng)在C環(huán)上產(chǎn)生/151的特征離子。同時，粗莖秦艽藥材化學成分中有較多的同分異構(gòu)體，如山柰酚和木犀草素，在制備混合對照品溶液時，同分異構(gòu)體需分開配制。

對不同加工方法、不同干燥方式下粗莖秦艽藥材中差異性標志物的分析表明，共有差異性成分主要為環(huán)烯醚萜類和有機酸類，提示加工方式對粗莖秦艽藥材中這2大類成分的富集影響較大。不同初加工粗莖秦艽藥材中化學成分的類型沒有明顯變化，但是主要化學成分的含量發(fā)生了變化。根據(jù)差異性成分分析結(jié)果，粗莖秦艽趁鮮切片樣品的質(zhì)量高于原個子樣品，切片藥材中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷等藥效成分的含量均普遍高于原個子組。同時，藥材趁鮮切片也可極大縮短干燥時間[6]。關(guān)于粗莖秦艽藥材切片的方式、厚度等，需要進一步探討。“發(fā)汗”是中藥的特色加工方法[17]，可增加藥材的香味或減少刺激性，有利于干燥。本實驗分析結(jié)果顯示，不同干燥方式中，曬干組藥材主要差異性成分的含量比“發(fā)汗”組高，與大葉秦艽藥材的研究結(jié)果一致[18]，同時，“發(fā)汗”組藥材中龍膽苦苷、馬錢苷酸等指標性成分含量較高?？紤]到“發(fā)汗”干燥法耗時長，操作繁雜，粗莖秦艽藥材是否需要“發(fā)汗”，可根據(jù)實際情況加以選擇。

綜上，粗莖秦艽藥材初加工時，建議選用三年生藥材，并去除蘆頭部位，以提升藥材品質(zhì)。在加工過程中，藥效成分的含量受到多方面因素的影響，包括是否切片、干燥方法等。在實際應(yīng)用中，根據(jù)粗莖秦艽藥材特征、成分特點，建議趁鮮切片，可選用便捷的曬干方式。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents of underground part ofwithdifferent processing methodsbased on UPLC-LTQ-Orbitrap MS/MS

JI Wen-jing1, XIE Hui2, WU Jin-rong1, Ni Liang-hong1, ZHAO Zhi-li1

1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 2. Fudan University, Shanghai 200433, China

To study the differences of secondary metabolites in underground part ofprocessed in different ways based on metabolomics, so as to provide scientific basis for optimizing its processing and drying methods., collected from Lijiang of Yunnan Province, was processed in the locality and pharmaceutical factory, respectively. The processing methods included slicing and whole roots (not slicing), and the drying methods included stoving, air drying and sweating. UPLC-LTQ-Orbitrap-MS technology and multivariate statistical analysis were used to analyze the secondary metabolites of each sample to screen the characteristic compounds with differences.A total of 44 chemical components were identified by analysis of all samples. The results of principal component analysis (PCA) showed that there were significant differences in the chemical composition between rhizomes and roots, and there were obvious differences between sliced roots and whole roots. The results of orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) showed the quality of triennial materials was superior to that of biennial materials, the quality of roots was better than that of rhizomes, the quality of sliced roots was better than that of whole roots. The quality of materials by air drying was the best, and the quality of materials processed in pharmaceutical factory was better than that processed in the locality. The main differential compounds among different groups were also analyzed.It is suggested to select triennial materials, remove the rhizomes and slice the roots whenis processed. The results could provide the basis for the primary processing technology, quality control and rational application of.

Duthie ex Burk; UPLC-LTQ-Orbitrap-MS; metabonomics; processing method; drying method;gentiopicroside; loganic acid; sweroside; swertiamarin; 6′--β--glucosyl-gentiopicroside

R286.2

A

0253 - 2670(2023)14 - 4641 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.025

2023-01-03

國家自然科學基金面上項目（82073959）；國家自然科學基金面上項目（81173654）；上海市衛(wèi)生健康委員會中醫(yī)藥傳承和科技創(chuàng)新項目（2022QN030）

季文靜，女，碩士研究生，研究方向為中藥資源與品種鑒定。E-mail: 1147221058@qq.com

倪梁紅，男，副教授。E-mail: nlhtcm@126.com

趙志禮，男，教授。E-mail: zhilzhao@sohu.com

[責任編輯 時圣明]