魯 斌，陳勇杏，吳博宇，王 赟，申開(kāi)澤，于富強(qiáng)，華 燕*

高山桑黃揮發(fā)油超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化及其生物活性研究

魯 斌1, 2，陳勇杏1，吳博宇1，王 赟3，申開(kāi)澤1，于富強(qiáng)2*，華 燕1*

1. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224 2. 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，中國(guó)西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù)，云南省真菌多樣性與綠色發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201 3. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224

優(yōu)化高山桑黃揮發(fā)油的提取工藝，對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析，并評(píng)價(jià)其生物活性。采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法（RSM）優(yōu)化超臨界CO2萃取高山桑黃揮發(fā)油的工藝條件；使用GC-MS、MTS和微量稀釋方法鑒定揮發(fā)油的化學(xué)成分，并評(píng)估其體外抗炎、抗腫瘤和抗菌活性。超臨界CO2萃取高山桑黃揮發(fā)油的最佳工藝條件為萃取溫度47 ℃、萃取壓力31 MPa、萃取時(shí)間1.5 h，在此條件下?lián)]發(fā)油提取得率為（0.326±0.005）%。高山桑黃揮發(fā)油主要化學(xué)成分為四氯藜蘆醚、1,2,4,5-四氯-3,6-二甲氧基苯、1,2,3,4-四氯-5-甲氧基-6-硝基苯、亞油酸乙酯、二十五烷。揮發(fā)油表現(xiàn)出顯著的體外抗炎和抗腫瘤作用，但其抑菌活性不顯著。成功優(yōu)化了高山桑黃揮發(fā)油的提取工藝，在最適條件下獲得了較高的得率；結(jié)合體外模型與生物活性評(píng)價(jià)，可為高山桑黃的藥物開(kāi)發(fā)和資源利用提供價(jià)值參考。

高山桑黃；揮發(fā)油；響應(yīng)面法；提取工藝；生物活性

廣義桑黃是銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）下桑黃孔菌屬Sheng H. Wu, L. W. Zhou & Y. C. Dai、木層孔菌屬和纖孔菌屬屬下多個(gè)物種的統(tǒng)稱(chēng)[1]，狹義桑黃是指(Sheng H. Wu, T. Hatt. & Y. C. Dai) Sheng H. Wu, L. W. Zhou & Y. C. Dai[2-3]，通常情況下桑黃指桑黃孔菌屬下的物種。桑黃又名桑耳、桑臣、桑黃菇、猢猻眼、桑上寄生、樹(shù)雞等，在中國(guó)已有兩千多年的藥用記載歷史，被譽(yù)為“森林黃金”[4]；其藥用功效最早見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》和《藥性論》，常用于治療血崩、血淋、脫肛泄血、帶下、閉經(jīng)、脾虛泄瀉、癥瘕積聚、癖飲等疾病[5]。

目前，已從桑黃中分離得到多種類(lèi)型的化合物，包括甾體類(lèi)、萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、多酚類(lèi)、生物堿類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、香豆素類(lèi)等多種有效成分[6-10]。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)桑黃的藥理作用進(jìn)行了深入的研究，明確桑黃具有廣泛的藥理作用，主要表現(xiàn)在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、肝臟保護(hù)和抗肝纖維化、自由基清除和抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抑菌、消炎、降血糖等活性方面[11-20]；因其顯著的抗腫瘤效果，被認(rèn)為是目前生物抗癌領(lǐng)域中藥理活性最高的藥用真菌[21-22]。近年來(lái)，中藥揮發(fā)油成分及其生物活性受到廣泛關(guān)注，然而大型藥用真菌在此方面的相關(guān)研究卻較少，僅在靈芝(Curtis) P. Karst.、銀耳Berk.、香栓菌(L.) Fr.等部分真菌開(kāi)展了揮發(fā)油的化學(xué)成分以及抗菌、抗氧化、細(xì)胞毒活性等藥理活性方面的研究工作[23-26]。

揮發(fā)油作為一種揮發(fā)性的芳香物質(zhì)被廣泛應(yīng)用，常用的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑萃取法、壓榨法、超聲波輔助萃取、分子蒸餾法、超臨界流體萃取法和亞臨界流體萃取等[27]。超臨界CO2流體萃取技術(shù)是利用CO2在高壓下處于超臨界狀態(tài)而萃取分離各種有機(jī)物的一種先進(jìn)技術(shù)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于揮發(fā)油物質(zhì)的分離應(yīng)用方面以及醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域[28]。超臨界流體萃取法相比于其他方法具有提取率高和保護(hù)有效成分等明顯優(yōu)勢(shì)[29-30]，且采用CO2為萃取溶劑，具有無(wú)毒無(wú)污染、廉價(jià)及來(lái)源豐富等特點(diǎn)[31]，適用于天然藥物的萃取分離。本實(shí)驗(yàn)以桑黃孔菌屬中的高山桑黃(Y. C. Dai & X. M. Tian) L. W. Zhou & Y. C. Dai（在真菌分類(lèi)學(xué)研究上，經(jīng)桑黃孔菌屬系統(tǒng)發(fā)育分析，確定高山桑黃隸屬于桑黃孔菌屬中的一種）子實(shí)體為原料，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（Box Behnken design- response surface methodology，BBD-RSM）對(duì)其揮發(fā)油進(jìn)行提取工藝優(yōu)化、化學(xué)成分分析及相關(guān)生物活性探討，以期為桑黃資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考和理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

Speed SFE型超臨界萃取儀，美國(guó)ASI公司；7890B-5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；Sartorius BAS2245型萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；YB-200型高速多功能粉碎機(jī)，上海力箭機(jī)械有限公司；美國(guó)Thermo Scientific Multiskan FC多功能酶標(biāo)儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.2 材料

高山桑黃(Y. C. Dai & X. M. Tian) L. W. Zhou & Y. C. Dai子實(shí)體購(gòu)于昆明市官渡區(qū)福盛堂中藥材經(jīng)營(yíng)部，由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所劉建偉鑒定，ITS序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（ITS OP881498和LSU OP881500），樣品保存于西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院非木質(zhì)資源培育與利用教研室。經(jīng)自然晾干、粉碎過(guò)60目篩備用。

人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系：白血病HL-60細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞、肝癌SMMC-7721細(xì)胞、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。菌種：大腸埃希氏菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌金黃亞種subsp.（ATCC29213）、腸沙門(mén)氏菌腸亞種subsp.（ATCC14028）、銅綠假單胞菌（ATCC27853），購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.3 試劑

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清，BI公司；Griess Reagent、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及對(duì)照藥物-NMMA［總一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）抑制劑，即G- monomethyl--arginine, monoacetate salt，也稱(chēng)ω- Me--Arg，或NG-Me--Arg, AcOH，是NOS廣普性抑制劑］、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），美國(guó)Sigma公司；頭孢他啶，上海源葉生物科技有限公司；青霉素G鈉，Biosharp公司；MH肉湯、LB肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂粉，Scientific Research Special公司；正己烷，分析純，廣東光華科技股份有限公司；二氯甲烷，分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水硫酸鈉，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 高山桑黃揮發(fā)油超臨界CO2萃取工藝

將粉碎的高山桑黃干燥粉末過(guò)60目藥篩后裝入萃取釜，通入CO2，設(shè)定萃取釜溫度，當(dāng)溫度達(dá)到設(shè)定值后開(kāi)始增壓至設(shè)定壓力，計(jì)時(shí)靜態(tài)萃取，然后調(diào)節(jié)CO2流量進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)萃取，用裝有溶劑的樣品瓶收集得到有特殊香味的黃色油狀物。稱(chēng)定質(zhì)量后通過(guò)公式計(jì)算揮發(fā)油得率。

揮發(fā)油得率＝萃取揮發(fā)油量/原料質(zhì)量

2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化高山桑黃揮發(fā)油的提取條件

通常情況下，萃取所用壓力、溫度和時(shí)間等因素會(huì)影響揮發(fā)油的得率，因此，在本試驗(yàn)中選擇萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間為單因素試驗(yàn)條件。

2.2.1 萃取溫度對(duì)高山桑黃揮發(fā)油提取的影響 固定稱(chēng)取30 g樣品干燥粉末（已過(guò)60目篩）裝入超臨界CO2萃取儀萃取釜內(nèi)，在萃取壓力為30 MPa，靜態(tài)萃取0.5 h后，在CO2流量10 L/h條件下連續(xù)動(dòng)態(tài)萃取1.5 h，用二氯甲烷富集得到有特殊香味的黃色油狀物并使用無(wú)水硫酸鈉干燥處理，考察不同萃取溫度（35、40、45、50、55 ℃）對(duì)揮發(fā)油得率的影響。在萃取壓力為30 MPa，靜態(tài)萃取0.5 h后，設(shè)定CO2流量10 L/h，連續(xù)動(dòng)態(tài)萃取1.5 h的條件下，不同萃取溫度提取揮發(fā)油的得率見(jiàn)表1。結(jié)果表明，在45 ℃下萃取揮發(fā)油的得率最大，且揮發(fā)油得率在一定溫度條件下隨溫度的升高而增加，因?yàn)樵诔R界萃取中，升高溫度有助于分子間的相互作用，增加分子擴(kuò)散系數(shù)，提高萃取效率；但溫度升高到一定程度得率反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是由于溫度過(guò)高時(shí)，分子間密度降低不利于傳質(zhì)作用，不利于組分的溶出導(dǎo)致?lián)]發(fā)油得率降低[29]。

表1 萃取溫度對(duì)高山桑黃揮發(fā)油得率的影響(, n = 3)

2.2.2 萃取壓力對(duì)高山桑黃揮發(fā)油提取的影響 固定稱(chēng)取30 g樣品干燥粉末（過(guò)60目篩）裝入超臨界CO2萃取儀萃取釜內(nèi)，在萃取溫度45 ℃，靜態(tài)萃取0.5 h后在CO2流量10 L/h條件下連續(xù)動(dòng)態(tài)萃取1.5 h，用二氯甲烷富集得到有特殊香味的黃色油狀物并使用無(wú)水硫酸鈉干燥處理，考察不同萃取壓力（20、25、30、35、40 MPa）對(duì)揮發(fā)油得率的影響。在萃取溫度40 ℃，靜態(tài)萃取0.5 h后在CO2流量10 L/h條件下連續(xù)動(dòng)態(tài)萃取1.5 h，不同萃取壓力對(duì)揮發(fā)油得率的影響見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，在一定范圍內(nèi)隨著萃取壓力的增大揮發(fā)油的得率有明顯增大，當(dāng)超過(guò)最適壓力后，萃取效率變低。在超臨界CO2萃取過(guò)程中，當(dāng)溫度一定時(shí)，壓力越大，超臨界流體的密度越大，溶解能力也越大；但壓力超過(guò)一定變化量時(shí)，傳質(zhì)效率降低，溶解度也受影響，易產(chǎn)生溝流現(xiàn)象使樣品物料結(jié)塊，不利于組分的溶出，從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)油得率降低[28]。

表2 萃取壓力對(duì)高山桑黃揮發(fā)油得率的影響(, n = 3)

2.2.3 萃取時(shí)間對(duì)高山桑黃揮發(fā)油提取的影響 固定稱(chēng)取30 g樣品干燥粉末（過(guò)60目篩）裝入超臨界CO2萃取儀萃取釜內(nèi)，在萃取壓力為30 MPa，靜態(tài)萃取0.5 h后在CO2流量10 L/h條件下連續(xù)動(dòng)態(tài)萃取，用二氯甲烷富集得到有特殊香味的黃色油狀物并使用無(wú)水硫酸鈉干燥處理，考察不同萃取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）對(duì)揮發(fā)油得率的影響。在萃取壓力為25 MPa下，靜態(tài)萃取0.5 h后設(shè)定CO2流量為10 L/h連續(xù)動(dòng)態(tài)萃取，萃取溫度40 ℃，獲得不同萃取時(shí)間下?lián)]發(fā)油的得率見(jiàn)表3。隨著時(shí)間的增加，使物料與CO2得到充分接觸，揮發(fā)油的萃取效率也隨之增加，當(dāng)達(dá)到1.5 h時(shí)，萃取過(guò)程達(dá)到最后的萃取階段，物料中的大部分精油幾乎完全被萃取出，獲得最大得率；再往后延長(zhǎng)萃取時(shí)間，得率出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，這說(shuō)明延長(zhǎng)時(shí)間對(duì)萃取效率幾乎無(wú)影響，反而導(dǎo)致一些極易揮發(fā)的物質(zhì)隨CO2氣流擴(kuò)散到環(huán)境中，使揮發(fā)油萃取得率降低，同時(shí)也增加了時(shí)間成本和CO2的消耗量[32]。

表3 萃取時(shí)間對(duì)高山桑黃揮發(fā)油得率的影響(, n = 3)

2.3 BBD-RSM優(yōu)化揮發(fā)油的提取工藝

2.3.1 BBD-RSM結(jié)果分析 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Design Expert 13軟件中的BBD-RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以萃取溫度（1）、萃取壓力（2）、萃取時(shí)間（3）為影響因素，以高山桑黃揮發(fā)油的得率（）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平組合設(shè)計(jì)優(yōu)化并確定超臨界CO2萃取法提取揮發(fā)油的最佳工藝條件。BBD-RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及結(jié)果見(jiàn)表4。

通過(guò)響應(yīng)面軟件對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸分析，得到揮發(fā)油萃取得率的回歸方程為＝0.331 2＋0.009 81＋0.008 62－0.003 43＋0.008 512＋0.005 013＋0.001 723－0.019 512－0.020 222－0.019 232。

表4 BBD-RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 4 Response surface experiment design and results

試驗(yàn)號(hào)X1/℃X2/MPaX3/hY/% 150 (+1)30 (0)2.0 (+1)0.303±0.004 250 (+1)25 (?1)1.5 (0)0.284±0.001 340 (?1)35 (+1)1.5 (0)0.282±0.002 445 (0)30 (0)1.5 (0)0.332±0.004 545 (0)35 (+1)2.0 (+1)0.296±0.004 645 (0)35 (+1)1.0 (?1)0.301±0.003 745 (0)30 (0)1.5 (0)0.335±0.001 850 (+1)30 (0)1.0 (?1)0.298±0.002 945 (0)25 (?1)1.0 (?1)0.291±0.001 1040 (?1)25 (?1)1.5 (0)0.278±0.001 1140 (?1)30 (0)2.0 (+1)0.277±0.003 1245 (0)30 (0)1.5 (0)0.330±0.004 1345 (0)30 (0)1.5 (0)0.328±0.002 1445 (0)30 (0)1.5 (0)0.331±0.003 1545 (0)25 (?1)2.0 (+1)0.279±0.002 1650 (+1)35 (+1)1.5 (0)0.322±0.002 1740 (?1)30 (0)1.0 (?1)0.292±0.003

2.3.2 響應(yīng)面回歸方程方差分析與試驗(yàn)驗(yàn)證 根據(jù)表5方差分析可知，模型中值＜0.01且失擬項(xiàng)不顯著＝0.163 5＞0.05，說(shuō)明模型擬合良好且顯著，方法可靠二次模型選擇合適。模型中2＝0.988 4，2adj＝0.973 5，表明回歸方程適合對(duì)本實(shí)驗(yàn)中揮發(fā)油得率的分析和預(yù)測(cè)。其中單因素1、2之間對(duì)揮發(fā)油得率的影響有極顯著差異（＜0.01），而單因素3對(duì)揮發(fā)油得率的影響差異顯著（＜0.05），在萃取溫度與萃取壓力交互項(xiàng)（12）中對(duì)揮發(fā)油得率的相互作用影響有極顯著差異（＜0.01），萃取溫度與萃取時(shí)間交互項(xiàng)（13）對(duì)揮發(fā)油得率的相互作用影響具有顯著性（＜0.05）。在各單因素水平范圍內(nèi)，根據(jù)值判斷出各因素間對(duì)結(jié)果的影響程度大小為1（萃取溫度）＞2（萃取壓力）＞3（萃取時(shí)間）。

表5 響應(yīng)面回歸方差分析

Table 5 Response surface statistical results of regression variance analysis

方差來(lái)源平方和自由度均方F值P值顯著性方差來(lái)源平方和自由度均方F值P值顯著性 模型7.30×10?398.11×10?466.34＜0.000 1極顯著X121.60×10?311.60×10?3130.67＜0.000 1極顯著 X18.00×10?418.00×10?462.23＜0.000 1極顯著X221.70×10?311.70×10?3140.93＜0.000 1極顯著 X26.00×10?416.00×10?448.702.00×10?4極顯著X321.60×10?311.60×10?3127.33＜0.000 1極顯著 X31.00×10?411.00×10?47.460.029 3顯著殘差1.00×10?471.43×10?5 X1X23.00×10?413.00×10?423.651.80×10?3極顯著失擬項(xiàng)1.00×10?433.33×10?52.920.163 5 X1X31.00×10?411.00×10?48.180.024 3顯著誤差2.68×10?546.70×10?6 X2X31.22×10?511.22×10?51.000.350 1 合計(jì)7.40×10?316

綜上所述，由響應(yīng)面回歸方差分析及二元回歸方程繪制各因素之間交互影響的等高線(xiàn)圖和相互作用的曲面圖，如圖1所示。通過(guò)響應(yīng)面模型擬合方程分析得到優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)條件為萃取溫度46.53 ℃，萃取壓力31.37 MPa，萃取時(shí)間1.48 h，揮發(fā)油得率的預(yù)測(cè)值為0.334%。結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行參數(shù)調(diào)整后得到最優(yōu)工藝條件為萃取溫度47 ℃，萃取壓力31 MPa，萃取時(shí)間1.5 h。在此工藝參數(shù)下，試驗(yàn)平行3次進(jìn)行驗(yàn)證，揮發(fā)油得率分別為0.322%、0.326%、0.331%，計(jì)算高山桑黃揮發(fā)油的最終平均提取得率為（0.326±0.005）%，與模型理論值基本一致，說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢院芎梅从吵龈飨嗷プ饔靡蛩嘏c揮發(fā)油得率之間的影響關(guān)系，對(duì)工藝條件優(yōu)化具有指導(dǎo)作用。

圖1 各因素間的交互作用對(duì)高山桑黃揮發(fā)油得率的影響

2.4 高山桑黃揮發(fā)油GC-MS分析

將萃取得到的揮發(fā)油溶于正己烷進(jìn)行無(wú)水硫酸鈉干燥處理后，過(guò)0.45 μm膜，備用。

GC條件：HP-5 MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為高純氦氣；恒定流量1.0 mL/min；采用程序升溫，初始溫度50 ℃，保持1 min，以速率10 ℃/min升至160 ℃，保持5 min，以3 ℃/min的速率升至200 ℃，保持5 min；再以10 ℃/min的速率升至250 ℃，保持2 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比25∶1。

MS條件：EI離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；溶劑延遲4 min；全掃描質(zhì)量范圍/30～550。

通過(guò)檢索NIST 14.L化學(xué)工作站標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)鑒定分析總離子流圖內(nèi)各峰的質(zhì)譜圖結(jié)果（圖2），采用峰面積歸一化法確定組分的相對(duì)含量。

對(duì)采用CO2超臨界萃取法提取得到的揮發(fā)油進(jìn)行分析，通過(guò)色譜圖解卷積方式進(jìn)行譜庫(kù)檢索鑒定其化學(xué)成分及相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表6。根據(jù)結(jié)果顯示，使用CO2超臨界萃取法得到的揮發(fā)油化學(xué)成分較多，共鑒定了37種化合物，這些組分包括酮類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、烷烴類(lèi)、烯烴類(lèi)以及其他類(lèi)等，其中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的主要化學(xué)成分為四氯藜蘆醚（19.97%）、1,2,3,4-四氯-5-甲氧基-6-硝基苯（14.24%）、二十五烷（9.97%）、亞油酸乙酯（8.38%）、1,2,4,5-四氯-3,6-二甲氧基苯（6.76%）、2(3)-呋喃酮二氫-5,5-二甲基-4-(3-氧代丁基)（5.98%）、十二烷（4.78%）、2,4-癸二烯醛（3.92%）、花側(cè)柏烯（2.67%）、十三烷（2.57%）、(+)-γ-古蕓烯（2.29%）、α-布藜烯（2.28%）、十七烷（2.08%）、十六烷（1.67%）、馬芐烯酮（1.42%）、5-羥基-2,4-二叔丁基苯基戊酸酯（1.21%）。

圖2 高山桑黃揮發(fā)油GC-MS分析總離子流圖

表6 高山桑黃揮發(fā)油成分分析

Table 6 Components analysis of volatile oil from S. alpinus

峰號(hào)化合物名稱(chēng)分子式CAS號(hào)相對(duì)含量/% 11,3-二氯-2-丙醇（1,3-dichloro-2-propanol）C3H6Cl2O96-23-10.44 23-羥基-2-丁酮（acetoin）C4H8O2513-86-00.05 33,3-二甲基已烷（3,3-dimethyl-hexane）C8H18563-16-60.11 4十一烷（undecane）C11H241120-21-40.92 5壬醛（nonanal）C9H18O124-19-60.36 6(?)-4-萜品醇［(R)-4-methyl-1-(1-methylethyl)-3-cyclohexen-1-ol］C10H18O20126-76-50.93 72-(4-甲基苯基)丙-2-醇（α,α,4-trimethyl-benzenemethanol）C10H14O1197-01-90.42 8(S)-(+)-5-甲基-1-己醇［(S)-(+)-5-methyl-1-heptanol］C8H18O57803-73-30.13 9十二烷（dodecane）C12H26112-40-34.78 10馬芐烯酮（4,6,6-trimethyl-bicyclo[3.1.1]hept-3-en-2-one）C10H14O80-57-91.42 111-庚烯-3-酮（1-hepten-3-one）C7H12O2918-13-00.12 122,4-癸二烯醛［(E,Z)-2,4-decadienal］C10H16O25152-83-43.92 13十三烷（tridecane）C13H28629-50-52.57 144,5-二甲基壬烷（4,5-dimethyl-nonane）C11H2417302-23-70.26 15鯨蠟烯（cetene）C16H32629-73-20.60 162,7-二甲基十一烷（2,7-dimethyl-undecane）C13H2817301-24-50.54 17香葉基丙酮［(E)-6,10-dimethyl-5,9-undecadien-2-one］C13H22O3796-70-10.92 183,5-二甲基十一烷（3,5-dimethyl-undecane）C13H2817312-81-10.72 196-乙基-2-甲基癸烷（6-ethyl-2-methyl-decane）C13H2862108-21-80.66 20α-布藜烯{[1S-(1α,7α,8aβ)]-1,2,3,5,6,7,8,8a-octahydro-1,4-dimethyl-7-(1-methylethenyl)-azulene}C15H243691-11-02.28 21(+)-γ-古蕓烯{[1R-(1α,3aβ,4α,7β)]-1,2,3,3a,4,5,6,7-octahydro-1,4-dimethyl-7-(1-methylethenyl)-azulene}C15H2422567-17-52.29 225-羥基-2,4-二叔丁基苯基戊酸酯（5-hydroxy-pentanoic acid, 2,4-di-t-butylphenylesters）C19H30O3166273-38-71.21 23花側(cè)柏烯［(R)-1-methyl-4-(1,2,2-trimethylcyclopentyl)-benzene］C15H2216982-00-62.67 242(3H)-呋喃酮二氫-5,5-二甲基-4-(3-氧代丁基)［dihydro-5,5-dimethyl-4-(3-oxobutyl)-2(3H)-furanone］C10H16O34436-81-15.98 25十六烷（hexadecane）C16H34544-76-31.67 26(1-乙基丙基)環(huán)己烷［(1-ethylpropyl)-cyclohexane］C11H2226321-98-20.63 27十七烷（heptadecane）C17H36629-78-72.08 28四氯藜蘆醚（1,2,3,4-tetrachloro-5,6-dimethoxy-benzene）C8H6Cl4O2944-61-619.97 291,2,4,5-四氯-3,6-二甲氧基苯（1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxy-benzene）C8H6Cl4O2944-78-56.76 30四氫糠醇丙酸酯（n-butyric acid tetrahydrofurfuryl ester）C8H14O3637-65-00.31 311,2,3,4-四氯-5-甲氧基-6-硝基苯（1,2,3,4-tetrachloro-5-methoxy-6-nitro-benzene）C7H3Cl4NO369576-80-314.24 32大根香葉烷［1,7-dimethyl-4-(1-methylethyl)cyclodecane］C15H30645-10-30.73 333,3-二甲基已烷（3,3-dimethyl-hexane）C8H18563-16-60.75 341,3-苯二酚單苯甲酸酯（1,3-benzenediol,monobenzoate）C13H10O3136-36-70.15 35丙烯醛（2-propenal）C3H4O107-02-80.07 36亞油酸乙酯（linoleic acid ethyl ester）C20H36O2544-35-48.38 37二十五烷（pentacosane）C25H52629-99-29.97

2.5 生物活性

2.5.1 揮發(fā)油對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放水平的影響 將RAW264.7細(xì)胞接種至96孔板，用1 μg/mL LPS進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，同時(shí)加入待測(cè)樣品（終質(zhì)量濃度50 μg/mL）處理初篩，確定初篩結(jié)果活性良好后再以終質(zhì)量濃度為50 μg/mL進(jìn)行2倍系列質(zhì)量濃度稀釋復(fù)篩，設(shè)置對(duì)照（不含藥物）組和陽(yáng)性對(duì)照（-NMMA）組。細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)后，吸取培養(yǎng)基通過(guò)Griess法檢測(cè)NO生成，在570 nm處測(cè)定吸光度（）值。在剩余培養(yǎng)基中加入MTS進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測(cè)，排除樣品對(duì)細(xì)胞的毒性影響。

NO生成抑制率＝(對(duì)照組570－樣品或陽(yáng)性對(duì)照組570)/對(duì)照組570

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞，采用Griess法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的濃度，并計(jì)算待測(cè)樣品抑制RAW264.7細(xì)胞釋放NO的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。通過(guò)待測(cè)樣品的活性初篩結(jié)果，進(jìn)一步設(shè)置系列質(zhì)量濃度梯度，以待測(cè)樣品終質(zhì)量濃度為50 μg/mL按照2倍稀釋關(guān)系進(jìn)行活性復(fù)篩并最終計(jì)算IC50。根據(jù)表7結(jié)果顯示，以陽(yáng)性對(duì)照藥物-NMMA作為參考，揮發(fā)油能夠很好地抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO，具有較高的抑制活性，說(shuō)明該揮發(fā)油提取物在炎癥治療方面具有一定療效。

2.5.2 揮發(fā)油的細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià) 使用MTS法測(cè)定揮發(fā)油的細(xì)胞毒活性。接種細(xì)胞：用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液（DMEM或者RMPI 1640）配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔3000～15 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，細(xì)胞提前12～24 h接種培養(yǎng)。加入待測(cè)樣品溶液：供試樣品用DMSO溶解，以100 μg/mL質(zhì)量濃度進(jìn)行初篩，在初篩結(jié)果有活性前提下以100、20、4、0.8、0.16 μg/mL質(zhì)量濃度復(fù)篩，每孔終體積200 μL，每種處理均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。顯色：在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，貼壁細(xì)胞棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加MTS溶液20 μL和培養(yǎng)液100 μL；設(shè)3個(gè)空白復(fù)孔（MTS溶液20 μL和培養(yǎng)液100 μL的混合液），繼續(xù)孵育2～4 h，使反應(yīng)充分進(jìn)行后測(cè)定值。比色：選擇492 nm波長(zhǎng)，多功能酶標(biāo)儀讀取各孔值，記錄結(jié)果。

表7 高山桑黃揮發(fā)油對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放NO的影響(, n = 3)

細(xì)胞抑制率＝(對(duì)照－樣品)/(對(duì)照－空白)

對(duì)照為含有MTS溶液、培養(yǎng)液、細(xì)胞的值，樣品為含有MTS溶液、培養(yǎng)液、細(xì)胞和藥物（揮發(fā)油/順鉑/紫杉醇）的值，空白為含有MTS溶液、培養(yǎng)液的值

每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)順鉑（DDP）和紫杉醇（Taxol）2個(gè)陽(yáng)性化合物，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，應(yīng)用兩點(diǎn)法（Reed and Muench法）計(jì)算化合物的IC50值。

lgIC50＝高于或等于50%細(xì)胞存活率的稀釋度的對(duì)數(shù)＋距離比例×稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)

距離比例＝(高于或等于50%細(xì)胞存活率的百分?jǐn)?shù)－50%)/(高于或等于50%細(xì)胞存活率的百分?jǐn)?shù)－低于50%細(xì)胞存活率的百分?jǐn)?shù))

根據(jù)MTS原理方法考察揮發(fā)油對(duì)5株腫瘤細(xì)胞（白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MDA-MB-231、結(jié)腸癌SW480）的抑制活性，在揮發(fā)油樣品質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)初篩對(duì)體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制活性，進(jìn)一步設(shè)置系列質(zhì)量濃度復(fù)篩的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8，表明揮發(fā)油對(duì)5株體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)均有較高的抑制活性。

2.5.3 揮發(fā)油抑菌活性的測(cè)定 將待測(cè)樣品用DMSO溶解并加入96孔培養(yǎng)板，以128 μg/mL質(zhì)量濃度進(jìn)行初篩，向各孔加入菌液（5×105cfu/mL）；在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定625 nm波長(zhǎng)下的值。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置培養(yǎng)基空白對(duì)照、細(xì)菌對(duì)照以及頭孢他啶、青霉素G鈉陽(yáng)性藥物對(duì)照。

本實(shí)驗(yàn)選取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌金黃亞種、腸沙門(mén)氏菌腸亞種、銅綠假單胞菌4株細(xì)菌進(jìn)行揮發(fā)油的體外抗細(xì)菌活性篩選。其抑制作用篩選結(jié)果見(jiàn)表9，結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)量濃度為128 μg/mL時(shí)，揮發(fā)油對(duì)4株細(xì)菌均無(wú)明顯抑制作用。

3 結(jié)論

炎癥是許多疾病發(fā)生的必經(jīng)過(guò)程，不僅誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，而且促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，腫瘤是目前威脅人類(lèi)健康的重大疾病，也是全球主要的公共健康問(wèn)題[33]。當(dāng)機(jī)體受到感染刺激時(shí)體內(nèi)巨噬細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥因子[34]，其中NO是一種十分重要的炎癥因子，在炎癥發(fā)生過(guò)程中，具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞，參與組織炎癥的重要作用[33]?？寡谆钚匝芯恐袦y(cè)試方法較多，表征抗炎作用的主要方法之一是通過(guò)藥物或藥材對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥評(píng)價(jià)其抑制效果。

表8 高山桑黃揮發(fā)油對(duì)5種癌細(xì)胞的IC50

Table 8 IC50 of S. alpinus volatile oil on five types of cancer cells

組別IC50/(μg?mL?1) HL-60A549SMMC-7721MDA-MB-231SW480 揮發(fā)油30.22±2.2726.60±1.7719.90±1.8440.25±0.9344.55±0.81 順鉑13.32±0.1915.87±0.266.59±0.1815.77±0.4524.26±1.11 紫杉醇＜0.008＜0.0080.12±0.01＜0.008＜0.008

表9 高山桑黃揮發(fā)油抑菌結(jié)果

Table 9 Antibacterial results of volatile oil of S. alpinus

分組質(zhì)量濃度/(μg?mL?1)抑制率/% 大腸埃希菌金黃色葡萄球菌腸沙門(mén)氏菌銅綠假單胞菌 青霉素G鈉5 97.72±0.00 10 99.19±0.11 頭孢他啶2100.16±0.08 99.43±0.16 揮發(fā)油12810.38±2.98?63.10±0.36?10.67±1.5415.93±0.79

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)不少天然藥物不僅來(lái)源廣泛，還具有毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，深受青睞。MTS法是一種簡(jiǎn)便、快速測(cè)定抗癌藥物敏感性的方法，常用于抗癌活性藥物研究的篩選工作中[35]。超臨界流體CO2萃取技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅猛，廣泛應(yīng)用在萃取中藥材有效成分研究領(lǐng)域。此萃取技術(shù)效率高、速度快，溶劑無(wú)毒無(wú)害，活性成分不易破壞，相對(duì)水蒸氣蒸餾法來(lái)說(shuō)優(yōu)勢(shì)明顯，對(duì)中藥有效成分提取的衛(wèi)生及品質(zhì)符合國(guó)家要求，也更有利于中藥現(xiàn)代化產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及人類(lèi)對(duì)環(huán)境的保護(hù)。

本研究利用超臨界流體CO2萃取技術(shù)，對(duì)高山桑黃揮發(fā)油的萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上通過(guò)GC-MS分析測(cè)定其揮發(fā)油的主要成分和含量，并評(píng)價(jià)了其對(duì)炎癥因子NO釋放的影響以及體外細(xì)胞毒活性。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)超臨界流體CO2的萃取溫度和壓力等因素對(duì)揮發(fā)油的得率有極顯著影響（＜0.01），而萃取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率影響顯著（＜0.05）。最終經(jīng)模型優(yōu)化獲得超臨界流體CO2萃取揮發(fā)油的最佳工藝條件為萃取溫度47 ℃，萃取壓力31 MPa，萃取時(shí)間1.5 h，以此參數(shù)條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)際測(cè)得揮發(fā)油的平均得率為（0.326±0.005）%，與二元回歸模型分析所得的揮發(fā)油提取得率預(yù)測(cè)值基本一致，說(shuō)明此模型可靠。

利用GC-MS對(duì)提取得到的高山桑黃揮發(fā)油進(jìn)行成分分析，共鑒定出37種化合物，其中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的化學(xué)成分主要包括四氯藜蘆醚（19.97%）、1,2,3,4-四氯-5-甲氧基-6-硝基苯（14.24%）、二十五烷（9.97%）、亞油酸乙酯（8.38%）、1,2,4,5-四氯-3,6-二甲氧基苯（6.76%）、2(3)-呋喃酮二氫-5,5-二甲基-4-(3-氧代丁基)（5.98%）、十二烷（4.78%）、2,4-癸二烯醛（3.92%）、花側(cè)柏烯（2.67%）、十三烷（2.57%）、(+)-γ-古蕓烯（2.29%）、α-布藜烯（2.28%）、十七烷（2.08%）、十六烷（1.67%）、馬芐烯酮（1.42%）、5-羥基-2,4-二叔丁基苯基戊酸酯（1.21%）等。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)展初期查閱大量資料對(duì)比發(fā)現(xiàn)，水蒸氣蒸餾法，溫度過(guò)高容易造成物質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，產(chǎn)生更多的裂解產(chǎn)物；但超臨界流體CO2萃取法與其相比，可以有效避免對(duì)成分的破壞，更好保護(hù)活性成分的結(jié)構(gòu)和功能，且萃取溶劑CO2具有無(wú)毒、廉價(jià)等特點(diǎn)，因此選擇超臨界流體CO2萃取法作為本項(xiàng)研究工作的技術(shù)方法。

本實(shí)驗(yàn)采用MTS法，對(duì)超臨界流體CO2萃取法得到的高山桑黃揮發(fā)油提取物進(jìn)行體外抗炎和抗腫瘤活性評(píng)價(jià)，均表現(xiàn)出顯著的抑制效果。然而，當(dāng)揮發(fā)油提取物質(zhì)量濃度為128 μg/mL時(shí)進(jìn)行體外抗菌活性初篩，發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、腸沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌均無(wú)明顯的抑制作用。

綜上，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)分析測(cè)試的物質(zhì)基礎(chǔ)，在實(shí)際應(yīng)用中，由于該技術(shù)提取的化學(xué)成分除揮發(fā)油外，還可能含有大量的脂溶性成分，推測(cè)其體外抗炎和抗腫瘤活性顯著的原因是揮發(fā)油成分以及其他脂溶性成分之間存在協(xié)同作用，從而發(fā)揮出更好的抑制活性。同時(shí)，揮發(fā)油的體外抗菌活性也與其特定的化學(xué)組成和含量有關(guān)[36-39]，根據(jù)實(shí)驗(yàn)初篩結(jié)果不顯著推測(cè)原因可能是與提取物成分種類(lèi)之間的拮抗作用致使抑菌活性降低或不明顯有關(guān)，還有可能是因?yàn)榧?xì)菌的細(xì)胞壁阻止了抗菌活性成分的進(jìn)入。本研究為高山桑黃揮發(fā)油超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化及其生物活性的研究，提供了初步的理論依據(jù)，其機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究考證，可為其資源開(kāi)發(fā)利用提供指導(dǎo)。

志謝：何新華教授、張鳳明博士對(duì)文章修改提出建議，西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院林產(chǎn)品分析檢測(cè)中心提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)、中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所活性篩選平臺(tái)對(duì)活性測(cè)試提供幫助。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of supercritical CO2extraction process and biological activities ofvolatile oil

LU Bin1, 2, CHEN Yong-xing1, WU Bo-yu1, WANG Yun3, SHEN Kai-ze1, YU Fu-qiang2, HUA Yan1

1. Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Utilization in the Southwest Mountains of China, College of Forestry, Southwest Forestry University, Ministry of Education, Kunming 650224, China 2. The Germplasm Bank of Wild Species, Yunnan Key Laboratory for Fungal Diversity and Green Development, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China 3. College of Life Science, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China

To optimize the extraction of volatile oil from Gaoshan Sanghuang (), analyze its constituents, and evaluate their biological activities.According to the result of the single factor experiment, the supercritical CO2extraction conditions of volatile oil fromwere optimized by the single factor test and response surface method (RSM). The chemical constituents, biological activities of anti-inflammatory, antitumor, and antibacterial of volatile oil were evaluated by GC-MS, MTS, and microdilution methods.The optimal conditions for extracting volatile oil were found to be 47 ℃ and 31 MPa pressure for 1.5 h. The yield obtained was (0.326 ± 0.005)%. The volatile oil ofcontains 1,2,3,4-tetrachloro-5,6-dimethoxy-benzene, 1,2,3,4-tetrachloro-5-methoxy-6-nitro-benzene, linoleic acid ethyl ester, and pentacosane. The volatile oil exhibited significant activitiesanti-inflammatory and antitumor properties. However, it showed no significant antibacterial activity.The study successfully optimized the extraction of volatile oil from, resulting in a significantly high yield under the tested conditions. The integration ofmodels and biological activities evaluation provides valuable insights for pharmaceutical development and resource utilization from.

(Y. C. Dai & X. M. Tian) L. W. Zhou & Y. C. Dai; volatile oil; response surface method; extraction process; biological activities

R283.6

A

0253 - 2670(2023)14 - 4520 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.012

2023-02-09

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2022Y584）；云南重大科技專(zhuān)項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（202202AE090001）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-21-05B）；西南林業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（KY21029）

魯 斌（1994—），男，碩士研究生，從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail: 1300255072@qq.com

于富強(qiáng)（1976—），男，正高級(jí)工程師，研究方向?yàn)榇笮驼婢N質(zhì)資源收集保藏與開(kāi)發(fā)利用。E-mail: fqyu@mail.kib.ac.cn

華 燕（1968—），女，教授，博士生導(dǎo)師，從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail: huayan1216@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]