許海棠，廖華珍，周菊英，韋貽春，藍(lán)艷姣

載丹皮酚納米纖維膜的制備、表征及性能評(píng)價(jià)

許海棠，廖華珍，周菊英*，韋貽春，藍(lán)艷姣

廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，林產(chǎn)化學(xué)與工程國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530006

以丹皮酚、聚己內(nèi)酯（polycaprolactone）、明膠（gelatin）為原料，利用靜電紡絲技術(shù)制備載藥纖維膜，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征及性能評(píng)價(jià)。采用靜電紡絲儀制備了聚己內(nèi)酯/丹皮酚纖維膜、聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜以及三層纖維膜（上下層為聚己內(nèi)酯膜，中間層為聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚膜）。通過掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜儀、X射線衍射儀、差示量熱掃描儀對(duì)單層纖維膜的形貌與結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)和溶血率測(cè)定法對(duì)載藥纖維膜的安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)；并測(cè)定了聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜的抗菌活性和抗氧化性；通過體外釋放實(shí)驗(yàn)考察丹皮酚的釋放規(guī)律。丹皮酚成功負(fù)載于電紡纖維中，CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)得聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜（載藥量≤15%）對(duì)L929細(xì)胞存活率并無明顯影響，溶血率實(shí)驗(yàn)測(cè)得樣品纖維膜的溶血率都低于1%。聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（19.93±0.10）mm。聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚載藥纖維膜對(duì)羥自由基的清除力較強(qiáng)，當(dāng)?shù)てし拥馁|(zhì)量濃度為1.1 mg/mL，載藥纖維膜的清除率為78.72%。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明藥物的釋放先是經(jīng)過一個(gè)快速釋放階段后進(jìn)入緩慢釋放過程。3層纖維膜的緩釋效果最好，累積釋放率為94.58%。制備的丹皮酚纖維膜具有較好的生物相容性和抑菌活性及抗氧化活性，具有緩釋性，其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用值得進(jìn)一步研究。

納米纖維膜；丹皮酚；聚己內(nèi)酯；明膠；抑菌性；釋藥性；溶血率

丹皮酚又名牡丹酚，是從牡丹、芍藥的干燥根皮等中藥材中提取得到的有效成分。近年來，由于其治療特性，丹皮酚已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。體外和體內(nèi)研究表明，丹皮酚具有廣泛的藥理活性，如抗炎活性[1]、抗菌活性[2]、抗氧化活性[3]、抗糖尿病活性[4]、抗過敏活性[5]、抗腫瘤活性[6]、抗動(dòng)脈粥樣硬化活性[7]以及緩解疼痛[8]的能力等。丹皮酚展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景，但是由于其水溶性低、穩(wěn)定性差、口服生物利用度低[9]，使其療效和應(yīng)用都受到了限制，所以在改善其負(fù)載方式與提高生物利用度方面仍需探索。

傳統(tǒng)的口服、靜脈注射及噴霧吸入等給藥方式因不能確定具體的給藥部位且難以控制藥量等缺陷，可能達(dá)不到預(yù)期效果，而借助藥物納米載體可以有效彌補(bǔ)這方面的缺陷[10]。近年來，具有成本低、直徑小、比表面積大、易實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)的靜電紡絲作為一種新型的可制備載藥納米纖維的技術(shù)，成為了研究熱點(diǎn)。由于電紡納米纖維的高孔隙率和優(yōu)良的連通性等特點(diǎn)，使其成為了多種藥物和生物活性物質(zhì)的儲(chǔ)庫(kù)，可實(shí)現(xiàn)增加溶解度，提高生物利用度、甚至達(dá)到可控釋放或靶向遞送的目的，受到了科研工作者的關(guān)注[11]。Kiss等[12]研發(fā)了能速釋的姜黃素電紡纖維，使水溶性極低的姜黃素在2 min內(nèi)溶出量達(dá)到（99.6±1.2）%。Rostami等[13]制備的載白藜蘆醇電紡纖維，為腸道靶向釋放，被腸道吸收的白藜蘆醇量（約為840 μmol/L），是其抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最低劑量（50 μmol/L）的16倍多。Yildiz等[14]以磺丁基醚-β-環(huán)糊精為基質(zhì)制備的磺胺異唑電紡納米纖維，藥物的溶解度提升了10倍。由此可見，電紡納米纖維可望作為難溶性藥物的載體，有效提高藥物溶解度和生物利用度。因此，基于丹皮酚的性質(zhì)，本課題組擬采用靜電紡絲技術(shù)制備可負(fù)載丹皮酚的纖維，以期提高其利用率，為相關(guān)新劑型的研究提供參考。

1 儀器與材料

MAGNA-IR550型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet Magna公司；TAQ2000型差示掃描量熱儀，美國(guó)TA公司；D8-Advance型X射線衍射儀，布魯克AXS公司；Supra55 Sapphire型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM），德國(guó)卡爾蔡司公司；JDF04型靜電紡絲機(jī)，長(zhǎng)沙納儀儀器科技有限公司；EnSpire型酶標(biāo)儀，上海葉拓科技有限公司；UV 5100型紫外分光光度儀，上海元析儀器有限公司。

丹皮酚，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%，批號(hào)C10402579，麥克林試劑有限公司；明膠，批號(hào)11825056，阿拉丁試劑有限公司；聚己內(nèi)酯，平均相對(duì)分子質(zhì)量80 000，批號(hào)RQ1854-100g，上海瑞永生物科技有限公司；,-二甲基甲酰胺（DMF）、六氟異丙醇、二氯甲烷、無水乙醇、冰醋酸等分析純?cè)噭┚?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

小鼠成纖維L929細(xì)胞購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 電紡溶液的配制

2.1.1 聚己內(nèi)酯/丹皮酚紡絲液的配制 精密量取DMF 1 mL，二氯甲烷4 mL，置于小圓底燒瓶中，混勻；精確稱量0.75 g聚己內(nèi)酯加入混合液中，常溫下磁力攪拌24 h。在上述溶液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)（基于聚己內(nèi)酯的質(zhì)量）為7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、20.0%的丹皮酚，繼續(xù)磁力攪拌3 h，得到均勻透明的不同載藥量的電紡溶液。

2.1.2 聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚紡絲液的配制 精確稱取0.525 g聚己內(nèi)酯和0.225 g明膠（聚己內(nèi)酯-明膠7∶3）溶于5 mL六氟異丙醇中，滴入20 μL冰醋酸，常溫下磁力攪拌12 h。在上述混合液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)（基于聚己內(nèi)酯和明膠的總質(zhì)量）為7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、20.0%的丹皮酚，繼續(xù)攪拌3 h，得到均勻透明的不同載藥量的電紡絲溶液[15]。

2.2 載丹皮酚纖維膜的制備

用5 mL注射器吸取制得的電紡溶液，采用18G針頭，安裝在電紡儀上，打開電源，在電壓為16 kV，推進(jìn)速度為0.6 mL/h，接收距離為15 cm的條件下制備聚己內(nèi)酯/丹皮酚載藥纖維膜；在電壓為14 kV，推進(jìn)速度為0.6 mL/h，接收距離為15 cm的條件下制備聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜[15]。

將所制得的纖維膜收集好放置在真空干燥箱中恒溫干燥24 h，溫度為45 ℃，揮干溶劑備用。

2.3 結(jié)構(gòu)與形貌表征

2.3.1 SEM表征 將真空干燥好的纖維膜裁剪成1 cm×1 cm的方形，噴金處理后利用SEM來觀察形貌，電壓為2 kV。使用Nano Measurer軟件處理圖片，測(cè)量纖維直徑，作纖維直徑分布圖。

紡絲的SEM照片見圖1-A。從圖1-A-a、b可以看出，聚己內(nèi)酯、聚己內(nèi)酯/丹皮酚纖維表面平滑，無明顯的藥物晶體析出，相互連接形成具有孔隙的孔狀結(jié)構(gòu)。從纖維直徑分布圖（圖1-B-a、b）可看出，聚己內(nèi)酯纖維直徑分布在50～550 nm，平均直徑為（220±79）nm；聚己內(nèi)酯/丹皮酚纖維直徑分布在50～400 nm，平均直徑為（190±59）nm。

從圖1-A-c、d可看到聚己內(nèi)酯＋明膠纖維之間出現(xiàn)細(xì)絲連接，光滑性較差，這是因?yàn)槊髂z的親水性較強(qiáng)，與聚己內(nèi)酯混溶后溶液粘度變大，在紡絲過程中，明膠分子帶有導(dǎo)電性，在電場(chǎng)的作用下進(jìn)行移動(dòng)從而使得電紡絲液變得不均勻[15-16]。從纖維直徑分布圖（圖1-B-c、d）可看出，聚己內(nèi)酯＋明膠纖維的平均直徑為（1118±359）nm，比聚己內(nèi)酯纖維直徑大很多，而載藥后的纖維平均直徑為 （1196±339）nm，二者的平均直徑相差不大。

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)TIR）掃描分析 以溴化鉀為背景，采用傅里變換葉紅外光譜儀對(duì)丹皮酚及各纖維膜進(jìn)行掃描測(cè)定，掃描范圍為500～4000 cm?1。所測(cè)樣品為各原料及載藥纖維膜，結(jié)果如圖2所示。

a-聚己內(nèi)酯 b-聚己內(nèi)酯/丹皮酚 c-聚己內(nèi)酯＋明膠 d-聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚

圖2中的丹皮酚FTIR圖，可觀察到丹皮酚的特征峰。其中，3225 cm?1處為O-H伸縮振動(dòng)峰；3082～3000 cm?1為芳?xì)浠纳炜s振動(dòng)峰[17]。1629 cm?1處有1個(gè)強(qiáng)峰，這是由于C＝O伸縮振動(dòng)形成；1206 cm?1處有C-O-C伸縮振動(dòng)峰[18]。

聚己內(nèi)酯纖維膜的FTIR圖中，2934 cm?1出現(xiàn)的是聚己內(nèi)酯鏈段端基O-H的特征峰，在1724 cm?1出現(xiàn)的強(qiáng)峰是羰基的伸縮振動(dòng)峰[19]。將聚己內(nèi)酯/丹皮酚纖維膜的FTIR譜線與丹皮酚的FTIR譜線對(duì)比，可以看出，丹皮酚在3225、3082、2681、1931 cm?1等特征吸收峰均消失；將其與聚己內(nèi)酯的FTIR譜線對(duì)比，沒有看到新的特征峰生成，說明丹皮酚和聚己內(nèi)酯之間沒有發(fā)生化學(xué)作用，丹皮酚被包裹在聚己內(nèi)酯中，導(dǎo)致部分特征峰被掩蓋。

圖2 各樣品的FTIR圖

從聚己內(nèi)酯＋明膠的FTIR圖可以看到，在3437 cm?1處有1個(gè)強(qiáng)峰，為N-H和O-H伸縮振動(dòng)疊加而成[20]。2934 cm?1出現(xiàn)的是聚己內(nèi)酯鏈段端基O-H的特征峰，1640 cm?1附近是明膠的N-H變形振動(dòng)吸收峰。在聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚的FTIR譜線中，丹皮酚的特征峰消失了，沒有生成新的特征峰，保留的是聚己內(nèi)酯和明膠的特征峰，說明在聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚電紡纖維膜中，丹皮酚被包埋在纖維內(nèi)部，與載體材料之間存在的是物理作用。

2.3.3 X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）掃描分析 使用X射線衍射儀對(duì)丹皮酚及各載藥纖維膜進(jìn)行測(cè)試，入射光源為Cu-K α射線，波長(zhǎng)0.154 1 nm；光管電壓40 kV，光管電流40 mA；掃描范圍10°～90°（2），步長(zhǎng)0.02°，結(jié)果如圖3所示。丹皮酚在11.7°～23.6°有多個(gè)強(qiáng)峰，峰型尖銳，提示丹皮酚是晶型結(jié)構(gòu)[17]。聚己內(nèi)酯在21.6°有1個(gè)強(qiáng)衍射峰，說明聚己內(nèi)酯為半晶體結(jié)構(gòu)[21]。可以看到，聚己內(nèi)酯/丹皮酚衍射圖與聚己內(nèi)酯的相似，無丹皮酚的衍射峰，說明丹皮酚被包埋在纖維內(nèi)部。對(duì)比丹皮酚、聚己內(nèi)酯＋明膠纖維膜與聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜的XRD譜線，發(fā)現(xiàn)丹皮酚的衍射峰在聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜中消失，說明丹皮酚被包埋于纖維內(nèi)。

2.3.4 差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法分析 采用DSC法對(duì)丹皮酚及各纖維膜的熱性能進(jìn)行測(cè)定，溫度條件為20～200 ℃。升降溫的速率均為10 ℃/min，整個(gè)實(shí)驗(yàn)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。圖4展示了丹皮酚以及各纖維膜的DSC曲線。從丹皮酚的DSC曲線可以看到，丹皮酚在60.78 ℃時(shí)，吸熱峰達(dá)到峰值，峰形尖銳，說明丹皮酚受熱易揮發(fā)。從聚己內(nèi)酯和聚己內(nèi)酯＋明膠的曲線可看出，溫度為40～60 ℃時(shí)，曲線出現(xiàn)了變化，此為發(fā)生了玻璃化轉(zhuǎn)變。將測(cè)得的數(shù)據(jù)計(jì)算可得，聚己內(nèi)酯纖維膜的吸熱焓變值為70.4 J/g；加入明膠后，纖維膜的吸熱焓變值降至68.1 J/g。由此可見聚己內(nèi)酯與明膠混合電紡之后，結(jié)晶度變低。聚己內(nèi)酯的結(jié)晶度越低，表明聚己內(nèi)酯與明膠的相容性越好，可以改善材料的性質(zhì)。比較聚己內(nèi)酯＋明膠和載丹皮酚纖維膜的DSC曲線，發(fā)現(xiàn)二者沒有明顯區(qū)別，說明丹皮酚被保護(hù)在載體內(nèi)部，熱穩(wěn)定性得到了提高。

圖3 樣品的X-射線衍射圖

圖4 樣品的DSC譜圖

2.4 生物相容性測(cè)試

2.4.1 細(xì)胞毒性測(cè)定 取各纖維膜的浸出液來檢測(cè)其對(duì)L929纖維細(xì)胞的毒性大小。參照文獻(xiàn)方法[22]，在裝有1 mL MEM培養(yǎng)液的離心管中，放入經(jīng)紫外線滅菌過的各纖維膜（5 mg），使其完全浸潤(rùn)到培養(yǎng)液中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

將小鼠成纖維L929細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔1×104個(gè)），置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組（聚己內(nèi)酯/明膠組、載5%丹皮酚纖維膜組、載10%丹皮酚纖維膜組、載15%丹皮酚纖維膜和載20%丹皮酚纖維膜組）和空白對(duì)照組。待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別加入各組纖維膜浸出液100 μL，以MEM培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組，每組平行培養(yǎng)3孔，培育24 h之后，除去上清液，每個(gè)孔中加入200 μL CCK-8/MEM（10%）培養(yǎng)液，培育4 h后，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（）值[15]。根據(jù)公式計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活性。

相對(duì)細(xì)胞活性＝實(shí)驗(yàn)/對(duì)照

當(dāng)前，為了評(píng)價(jià)載藥纖維膜的安全性，測(cè)定其細(xì)胞毒性是一項(xiàng)必要指標(biāo)。利用載藥纖維膜浸出液培養(yǎng)L929纖維細(xì)胞的結(jié)果見表1。從表1可知，聚己內(nèi)酯＋明膠纖維膜、載5%丹皮酚纖維膜和載10%丹皮酚纖維膜的相對(duì)細(xì)胞活性分別為98.12%、100.6%、100.9%，說明聚己內(nèi)酯＋明膠基體和低載藥量的丹皮酚樣品中對(duì)L929纖維細(xì)胞幾乎沒有毒性。隨著丹皮酚載藥量的增大，相對(duì)細(xì)胞活性有所下降，15%載丹皮酚纖維膜的相對(duì)細(xì)胞活性為90.22%，而20%載丹皮酚纖維膜的相對(duì)細(xì)胞活性降幅明顯，僅為12.61%，這與藥物自身毒性有關(guān)。

表1 各納米纖維膜浸出液培養(yǎng)后的L929細(xì)胞相對(duì)活性(, n = 3)

本實(shí)驗(yàn)中，L929纖維細(xì)胞在載丹皮酚量≤15%時(shí)的纖維膜浸出液中的相對(duì)細(xì)胞活性都超過90%，說明在一定載藥量范圍內(nèi)，所制備的聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜具有優(yōu)良的細(xì)胞相容性。

2.4.2 溶血率的測(cè)定 取新鮮兔血5.0 mL，加入3.2%檸檬酸鈉抗凝。參照文獻(xiàn)方法[23]稍加改動(dòng)：以轉(zhuǎn)速為1000 r/min，將抗凝全血離心10 min；棄去上清液，取0.4 mL紅細(xì)胞沉淀，加入無菌生理鹽水1.0 mL，混合，再次離心10 min，棄去上清液，加入0.5 mL的無菌生理鹽水稀釋紅細(xì)胞，得到紅細(xì)胞混懸液，備用。

將準(zhǔn)備好的各纖維膜小圓片待測(cè)樣品置于離心管中，加入無菌生理鹽水，使得待測(cè)樣品質(zhì)量濃度分別為100、200、500、800、1000 μg/mL。1 mL生理鹽水中加入20 μL紅細(xì)胞混懸液為陰性對(duì)照組；1 mL蒸餾水中加入20 μL紅細(xì)胞混懸液為陽(yáng)性對(duì)照組；取各樣品溶液1 mL，分別加入20 μL紅細(xì)胞混懸液為樣品組。將各溶液輕輕振搖，混合均勻，置37 ℃旋轉(zhuǎn)式混勻儀培育2 h后，于1000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，吸取上清夜0.2 mL至96孔板中，采用酶標(biāo)儀于545 nm處測(cè)定值，平行測(cè)定3次，根據(jù)公式計(jì)算溶血率。

溶血率＝(t－nc)/(pc－nc)

t、nc、pc分別為樣品組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的值

血液相容性是評(píng)價(jià)醫(yī)藥材料生物相容性最重要的指標(biāo)之一。任何一種生物材料或設(shè)備植入體內(nèi)后，與血液成分間的相互作用會(huì)影響下游事件的走向[24]。因此，測(cè)定溶血率是評(píng)價(jià)材料安全性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基材和載藥纖維膜的溶血率都不到1%，表明聚己內(nèi)酯、明膠和丹皮酚（試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)）沒有溶血作用，安全性高。

2.5 生物活性的測(cè)定

2.5.1 抗菌活性 采取抑菌圈法。將活化好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌液稀釋后（濃度為1×106CFU/mL），涂布在固體培養(yǎng)基上。各纖維膜打成8 mm薄膜圓片，經(jīng)紫外燈照射消毒后，貼在涂有菌液的培養(yǎng)基上。取含有0.4 μg的環(huán)丙沙星濾紙片作為陽(yáng)性對(duì)照組，聚己內(nèi)酯＋明膠纖維膜作為陰性對(duì)照組。將培養(yǎng)皿放在生化培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑，結(jié)果如表2和圖5所示。

從結(jié)果可知，聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為15.96 mm和19.93 mm，都超過了15 mm，說明聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有較強(qiáng)的抗菌能力。而對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于陽(yáng)性對(duì)照的抑菌圈直徑，說明聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚納米纖維膜保留了優(yōu)異的抑菌活性。

2.5.2 抗氧化活性 根據(jù)Fenton反應(yīng)原理，參照文獻(xiàn)方法[25]測(cè)定丹皮酚和載藥纖維膜清除羥自由基的能力。取3組試管，樣品管組加入100 μL水楊酸溶液（9 mmol/L）和100 μL硫酸亞鐵溶液（9 mmol/L），再分別加入纖維膜溶出液，加水至1.4 mL，最后加入過氧化氫（8 mmol/L）100 μL，得到含丹皮酚終質(zhì)量濃度為500～1100 μg/mL的系列樣品管，37 ℃下反應(yīng)15 min，用紫外分光光度計(jì)于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定值，記為1。將樣品溶液換成水，同樣操作得到0；將樣品管中的過氧化氫溶液換成水測(cè)得對(duì)照吸光值2。平行測(cè)定3次，羥自由基清除率用公式進(jìn)行計(jì)算。

表2 聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性(, n = 3)

圖5 聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈

清除率＝(0－1＋2)/0

在初試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)丹皮酚清除其他自由基的活性較弱，所以，本實(shí)驗(yàn)以測(cè)定載藥纖維膜對(duì)羥自由基的清除率來評(píng)價(jià)其抗氧化性能，并與丹皮酚原料藥比較，結(jié)果見表3。從表3中可以看到，隨著丹皮酚質(zhì)量濃度的增大，清除率呈上升趨勢(shì)，清除率與丹皮酚質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當(dāng)?shù)てし拥馁|(zhì)量濃度為1.1 mg/mL時(shí)，原料藥的清除率為79.31%，載藥纖維膜的清除率為78.72%。經(jīng)SPSS 17.0軟件分析，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，二者的清除能力相當(dāng)，無顯著性差異。

表3 樣品對(duì)?OH的清除能力(, n = 3)

2.6 丹皮酚體外釋放研究

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 精確稱取10.0 mg丹皮酚，加入磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），溶解、定容，得到0.1 mg/mL的儲(chǔ)備液。稀釋成一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液：4、6、8、10、12 μg/mL。采用紫外分光光度計(jì)，在274 nm處測(cè)定上述溶液的值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以值對(duì)丹皮酚溶液的質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝0.070 4＋0.007 8，2＝0.999 3，其中為值，為丹皮酚質(zhì)量濃度。

2.6.2 丹皮酚飽和溶解度的測(cè)定 取過量的丹皮酚原料藥，置于盛有20 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）錐形瓶中，恒溫振蕩72 h，靜置后取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，用紫外分光光度計(jì)在274 nm處測(cè)定值，平行測(cè)定3次，測(cè)得丹皮酚的飽和溶解度為（825±13）μg/mL。

2.6.3 丹皮酚體外釋放測(cè)定 精密稱取載丹皮酚纖維膜，放進(jìn)盛有50 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）的錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床中，設(shè)置溫度為37 ℃，振蕩頻率為100 r/min。定時(shí)從溶出介質(zhì)中移取5.0 mL溶液作為待測(cè)樣品，同時(shí)補(bǔ)充同體積PBS溶液。測(cè)定待測(cè)樣品在274 nm處的值，參照文獻(xiàn)方法中的公式[26]，計(jì)算累積釋放率，并作釋放曲線圖。

2.6.4 丹皮酚釋放行為 圖6展示了丹皮酚原料藥和3種載丹皮酚纖維膜的體外藥物累積釋放率。從丹皮酚釋放曲線圖可以看出，丹皮酚原料藥在4 h基本釋放完全，累積釋放率達(dá)到93.46%。從2個(gè)載藥纖維膜的釋放曲線圖可看到，各濃度的聚己內(nèi)酯/丹皮酚纖維膜和聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜在1 h內(nèi)均存在突釋效應(yīng)。明膠的加入，使得不同載藥量的纖維膜累積釋放率的差距增大，載藥量為15%的纖維膜的累積釋放率從31.26%提高到53.10%，但是突釋現(xiàn)象沒有得到改善。究其原因，可歸結(jié)為混紡中常見的問題。共混靜電紡絲法是在進(jìn)行紡絲前將藥物與聚合物溶液混合，直接溶解再紡絲。在這種方法中，聚合物的理化性質(zhì)、聚合物與藥物的相互作用決定了藥物在納米纖維中的分布以及藥物的釋放等。在共混靜電紡納米纖維的研究中發(fā)現(xiàn)，藥物突釋通常是由于2個(gè)原因造成，一是其直接與人體內(nèi)環(huán)境接觸導(dǎo)致容易擴(kuò)散；二是單軸纖維易于快速降解，從而造成難以控制給藥的局面。此外，溶解度差的藥物會(huì)導(dǎo)致其在聚合物溶液中分布不均勻，藥物向纖維表面的遷移，最終導(dǎo)致藥物初始突釋現(xiàn)象的出現(xiàn)。為了解決突釋問題，本研究制備了3層載丹皮酚纖維膜：聚己內(nèi)酯膜為上下層，聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚膜作為中間層。每一層的紡絲時(shí)間都為2 h，紡絲參數(shù)同上，并研究了其釋藥行為，結(jié)果見圖6。比較3個(gè)載藥纖維膜的釋放曲線圖可知，3層載藥膜的丹皮酚累積釋放率比單層載藥膜的高得多。從三層膜載藥釋放圖可看出，釋放效果最好的纖維膜的中間層聚己內(nèi)酯和明膠的比例為7∶3，在4 h時(shí)其藥物累積釋放率為20.62%，在前期沒有突釋效應(yīng)；24 h時(shí)累積釋放率達(dá)到47.83%，接著緩慢釋放，120 h時(shí)累積釋放率可達(dá)94.58%，幾乎完全釋放，與原料藥比，具有緩釋性。

圖6 載藥纖維膜體外藥物累積釋放曲線(, n = 3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用靜電紡絲技術(shù)制備了不同載體的載丹皮酚納米纖維膜，對(duì)其進(jìn)行了表征、生物活性測(cè)試和體外藥物釋放行為研究。FTIR是表征丹皮酚是否與載體發(fā)生反應(yīng)的有力測(cè)試手段，通過檢測(cè)對(duì)比丹皮酚的特征峰，發(fā)現(xiàn)載藥纖維膜的譜線中無丹皮酚的特征峰，與原材料紅外圖譜對(duì)比，也沒有生成新的峰，說明丹皮酚與載體沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，只是被成功地包埋在纖維內(nèi)部。分析TEM和XRD的表征結(jié)果與紅外光譜圖得到的結(jié)果一致。而DSC的檢測(cè)結(jié)果說明，丹皮酚負(fù)載在纖維內(nèi)部，被載體所保護(hù)，提高了熱穩(wěn)定性。

隨著醫(yī)藥學(xué)與材料學(xué)的發(fā)展，生物材料在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛[27]。材料在應(yīng)用于臨床前，需對(duì)其進(jìn)行生物相容性的評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和溶血率的測(cè)試，結(jié)果顯示，聚己內(nèi)酯＋明膠載體纖維膜是安全的生物材料。而載丹皮酚纖維膜隨著載藥量的增大，出現(xiàn)了細(xì)胞毒性，因此，我們要把載藥量控制在安全用藥范圍。在生物活性方面，聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的作用；對(duì)羥自由基具有較強(qiáng)的清除能力，可望在醫(yī)學(xué)研究、生物醫(yī)藥及食品包裝等領(lǐng)域開拓新的應(yīng)用。

從體外釋藥試驗(yàn)結(jié)果來看，聚己內(nèi)酯/丹皮酚和聚己內(nèi)酯＋明膠/丹皮酚纖維膜最佳的載藥量都是15%，但是存在具有突釋效應(yīng)和累積釋放率不高的缺點(diǎn)。考慮到聚己內(nèi)酯的疏水性，可以控制藥物釋放前期的突釋；而明膠的親水性又可以在后續(xù)的過程中促進(jìn)丹皮酚的釋放。結(jié)合兩者的特性，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)制備了3層膜，通過摸索調(diào)控中間層2種材料之間的比例，在釋藥實(shí)驗(yàn)中獲得了較為滿意的效果。下一步可對(duì)3層載丹皮酚纖維膜做更多的研究，比如各項(xiàng)表征、藥理活性及釋藥機(jī)制等，為開拓丹皮酚的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Zong S Y, Pu Y Q, Xu B L,. Study on the physicochemical properties and anti-inflammatory effects of paeonol in rats with TNBS-induced ulcerative colitis [J]., 2017, 42: 32-38.

[2] Himaya S W, Ryu B, Qian Z J,. Paeonol fromBleeler suppressed the neuro- inflammatory responsesvia NF-κB and MAPK signaling pathways [J]., 2012, 26(6): 878-887.

[3] 張鵬, 程鳳琦, 金圣奇, 等. 丹皮酚的體內(nèi)抗炎鎮(zhèn)痛和體外抗氧化效果評(píng)價(jià) [J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2022, 58(6): 96-100.

[4] Lau C H, Chan C M, Chan Y W,. Pharmacological investigations of the anti-diabetic effect ofand its active component paeonol [J]., 2007, 14(11): 778-784.

[5] Lee B M, Shin Y W, Bae E A,. Antiallergic effect of the root ofand its constituents paeoniflorin and paeonol [J]., 2008, 31(4): 445-450.

[6] Li M, Tan S Y, Wang X F. Paeonol exerts an anticancer effect on human colorectal cancer cells through inhibition of PGE2 synthesis and COX-2 expression [J]., 2014, 32(6): 2845-2853.

[7] Li H K, Dai M, Jia W. Paeonol attenuates high-fat-diet- induced atherosclerosis in rabbits by anti-inflammatory activity [J]., 2009, 75(1): 7-11.

[8] Zhang J Y, Lei L, Shang J,. Local application of paeonol prevents early restenosis: A study with a rabbit vein graft model [J]., 2017, 212: 278-287.

[9] Yao J J, Zhang Y X, Hu Q M,. Optimization of paeonol-loaded poly(butyl-2-cyanoacrylate) nanocapsules by central composite design with response surface methodology together with the antibacterial properties [J]., 2017, 101: 189-199.

[10] 周斐. 同軸載姜黃素抗氧化緩釋納米纖維膜的制備及其性能研究 [D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2022.

[11] 李銘巖, 楊柳榴, 王兵, 等. 靜電紡絲技術(shù)在藥物制劑中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2022, 53(8): 1091-1100.

[12] Kiss K, Hegedüs K, Vass P,. Development of fast-dissolving dosage forms of curcuminoids by electrospinning for potential tumor therapy application [J]., 2022, 611: 121327.

[13] Rostami M, Ghorbani M, Aman Mohammadi M,. Development of resveratrol loaded chitosan-gellan nanofiber as a novel gastrointestinal delivery system [J]., 2019, 135: 698-705.

[14] Yildiz Z I, Celebioglu A, Uyar T. Polymer-free electrospun nanofibers from sulfobutyl ether 7-beta-cyclodextrin (SBE 7-β-CD) inclusion complex with sulfisoxazole: Fast-dissolving and enhanced water-solubility of sulfisoxazole [J]., 2017, 531(2): 550-558.

[15] 廖華珍. 靜電紡載中藥活性成分納米纖維膜的制備及釋放性能研究 [D]. 南寧: 廣西民族大學(xué), 2021.

[16] Li D W, Chen W M, Sun B B,. A comparison of nanoscale and multiscale PCL/gelatin scaffolds prepared by disc-electrospinning [J]., 2016, 146: 632-641.

[17] Ma H D, Guo D Y, Fan Y,. Paeonol-loaded ethosomes as transdermal delivery carriers: Design, preparation and evaluation [J]., 2018, 23(7): 1756.

[18] 趙吉平, 鄒從早, 馬海平. 丹皮酚固體分散體制備表征及體外溶出特性[J]. 中國(guó)醫(yī)藥科學(xué), 2020, 10(9): 35-38.

[19] 胡運(yùn)玖, 左奕, 鄔均, 等. 聚己內(nèi)酯載藥微球的制備及釋藥性能研究 [J]. 材料導(dǎo)報(bào), 2015, 29(2): 29-32.

[20] 付銀鑫, 郭菲, 張明飛, 等. 聚己內(nèi)酯/明膠電紡納米纖維支架的制備與細(xì)胞相容性研究 [J]. 化工新型材料, 2014, 42(1): 110-112.

[21] Xue J J, He M, Liu H,. Drug loaded homogeneous electrospun PCL/gelatin hybrid nanofiber structures for anti-infective tissue regeneration membranes [J]., 2014, 35(34): 9395-9405.

[22] 陳星竹, 于明岳, 劉雙, 等. 載氟聚碳酸丙烯酯牙貼片再礦化性能及其對(duì)小鼠成纖維L929細(xì)胞的毒性作用 [J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2022, 48(6): 1429-1436.

[23] 黃娜, 高慧敏, 陳兩綿, 等. 金銀花與山銀花的體外溶血作用分析 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2017, 23(12): 6-12.

[24] 沈勇. 仿生取向纖維的剛度變化對(duì)巨噬細(xì)胞極化與血液相容性的影響 [D]. 上海: 東華大學(xué), 2021.

[25] 王晶晶, 仇建飛, 蔡玉紅, 等. 富硒木耳水提物體外抗氧化作用研究 [J]. 東北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2021, 46(6): 134-138.

[26] 楊佳佳, 韋世權(quán), 李婉蓉, 等. 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化丹皮酚脂微球處方工藝及其體外釋藥機(jī)制研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(15): 3901-3910.

[27] 秦政, 楊欽博, 蘇白海. 血液接觸生物材料的血液相容性評(píng)價(jià)研究進(jìn)展 [J]. 高分子通報(bào), 2021(2): 1-8.

Preparation, characterization and performance evaluation of nanofiber membranes loaded with paeonol

XU Hai-tang, LIAO Hua-zhen, ZHOU Ju-ying, WEI Yi-chun, LAN Yan-jiao

Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products, State Ethnic Affairs Commission, Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products, Guangxi Collaborative Innovation Center for Chemistry and Engineering of Forest Products, Guangxi Minzu University, Nanning 530006, China

To prepare drug-loaded fiber membrane by using electrospin technology, with paeonol, polycaprolactone, gelatin as raw materials and performe their structural characterization and performance evaluation.Polycaprolactone/ paeonol fiber membrane, polycaprolactone + gelatin/paeonol fiber membrane and three layers of fiber film (which polycaprolactone membrane as the upper and lower layers and polycaprolactone + gelatin/paeonol membrane as the middle layer) were prepared. The morphology and structure of the single layer fiber membrane were characterized by scanning electron microscope, Fourier transform infrared spectrum, X-ray diffraction, and differential scanning calorimetry. The security of the loaded fiber membrane was assessed by CCK-8 and hemolysis test. The antibacterial activity and antioxidant properties of polycaprolactone + gelatin/paeonol were evaluated. Therelease rule of paeonol from drug loaded fiber membrane was investigated.Paeonol was successfully loaded in the electrospun fibers. CCK-8 test indicated that the polycaprolactone + gelatin/paeonol fiber membrane (drug loading capacity ≤ 15%) showed no influence to the cell viability, and hemolysis test showed hemolysis ratio of samples was under 1%. The excellent antibacterial effect of polycaprolactone + gelatin/paeonol fiber membrane againstand, which the diameter of the bacteriostatic ring for.was (19.93 ± 0.10) mm. Polycaprolactone + gelatin / paeonol had a strong clearance of hydroxyl radicals, when the concentration of paeonol was 1.1 mg/mL, the clearance rate of the membrane was 78.72%.release experiments show that the release of the drug first goes through a rapid release and then enters the slow release. The fiber membrane with the best sustained-release effect was three layers, which the cumulative release rate was 94.58%.The prepared paeonol fiber membrane has good biocompatibility, bacteriactivity and oxidation resistance, and slow release, and its application in the field of biomedicine is worth further study.

nanofiber membrane; paeonol; polycaprolactone; gelatin; antibacterial; release; hemolysis rate

R283.6

A

0253 - 2670(2023)14 - 4493 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.009

2023-02-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（52063004）

許海棠，碩士生導(dǎo)師，正高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)樗幬镄聞┬团c制劑新技術(shù)。E-mail: xhthellen@163.com

周菊英，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)樗上慊δ懿牧系闹苽渑c應(yīng)用。E-mail: zhoujuying@126. com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]