陳會(huì)朋，王 銀，余惠旻，周紅祖

基于UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)分析加味左金丸化學(xué)成分及指紋圖譜研究

陳會(huì)朋1，王 銀1，余惠旻2*，周紅祖3*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院（龍崗），廣東 深圳 518116 2. 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518060 3. 深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033

采用 UPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)對(duì)加味左金丸中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。色譜柱為ACQUITY Premier BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為乙睛-甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，體積流量為0.3 mL/min；質(zhì)譜的離子源為ESI，模式為正、負(fù)離子模式。通過(guò)質(zhì)譜給出的分子離子峰和二級(jí)質(zhì)譜碎片離子峰，結(jié)合對(duì)照品的相對(duì)保留時(shí)間，參考相關(guān)的文獻(xiàn)，對(duì)于加味左金丸中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。并建立不同批次加味左金丸樣品的指紋圖譜。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的分析，從加味左金丸中鑒定出92個(gè)成分，其中包括16個(gè)有機(jī)酸類(lèi)成分、34個(gè)黃酮類(lèi)成分、17個(gè)生物堿類(lèi)成分、21個(gè)萜類(lèi)成分與4個(gè)其他類(lèi)成分。建立的加味左金丸指紋圖譜有13個(gè)共有峰，分別為黃芩苷、山柰酚-3--葡萄糖苷、槲皮素、漢黃芩素、甘草素、千層紙素A、芍藥苷、吳茱萸次堿、小檗堿、巴馬汀、枸橘苷、橙皮苷、柴胡皂苷d。指紋圖譜方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，多批次加味左金丸的成分基本一致。建立的UPLC-Q-TOF/MS方法對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定，建立的指紋圖譜方法為進(jìn)一步分析加味左金丸的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了重要依據(jù)。

HPLC-MS；加味左金丸；裂解規(guī)律；指紋圖譜；黃芩苷；山柰酚-3--葡萄糖苷；漢黃芩素；甘草素；千層紙素A；芍藥苷；吳茱萸次堿；小檗堿；柴胡皂苷d

中成藥由于由多個(gè)中藥材組成，同時(shí)經(jīng)過(guò)多次提取分離，其化學(xué)成分相對(duì)較為復(fù)雜，研究難度比較大。采用傳統(tǒng)的提取分離鑒定手段，不僅周期長(zhǎng)、效率低，同時(shí)還不能比較全面地進(jìn)行分析研究。UPLC-Q-TOF/MS的分析技術(shù)作為目前一種快速分析中成藥、中藥材、中藥提取物中化學(xué)成分的手段，因其高靈敏度、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于中藥的定性研究中[1-4]。UPLC-Q-TOF/MS一方面可以對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行精確分析，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)可推導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)，另一方面可以進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜中碎片峰，進(jìn)一步確證其結(jié)構(gòu)，定量與定性雙重分析手段提高了化合物結(jié)構(gòu)確證的準(zhǔn)確性。

加味左金丸收載于《中國(guó)藥典》2020年版，由黃連（姜炙）、吳茱萸（甘草炙）、黃芩、柴胡、木香、香附（醋炙）、郁金、白芍、青皮（醋炙）、枳殼（去瓤麩炒）、陳皮、延胡索（醋炙）、當(dāng)歸、甘草14味中藥材組成，具有平肝降逆、疏郁止痛的功效[5]，臨床上用于胃炎、胃潰瘍、結(jié)腸炎等[6-13]，同時(shí)具有抗腫瘤的活性[14]。目前，通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，加味左金丸的成分研究只限于指標(biāo)含量的測(cè)定[15]，未見(jiàn)到對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)和深入的研究。課題組在前期已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行了指標(biāo)成分的定量研究與無(wú)機(jī)元素的分析研究[15-16]，在此基礎(chǔ)上為了進(jìn)一步剖析其物質(zhì)基礎(chǔ)與有效成分。本實(shí)驗(yàn)采用高分辨質(zhì)譜對(duì)其含有的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，對(duì)該中成藥中化學(xué)成分進(jìn)行精確的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定，通過(guò)質(zhì)譜裂解規(guī)律，進(jìn)而確定其分子式，同時(shí)結(jié)合參考文獻(xiàn)與對(duì)照品準(zhǔn)確定位，為加味左金丸的系統(tǒng)深入研究提供研究的基礎(chǔ)。最后，進(jìn)一步通過(guò)建立指紋圖譜，為該中成藥的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1290 Infinity II液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）；1260液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）；6230 B飛行時(shí)間（TOF）液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，MassHunter Acquisition 色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；Arium?水純化系統(tǒng)（德國(guó)Sartorius公司）；Secura125-1C型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；SB-1200DT型超聲波清洗器（寧波新芝超聲波儀器有限公司）。

對(duì)照品阿魏酸（批號(hào)110773-201313，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%）、芍藥苷（批號(hào)110736-201842，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.4%）、黃芩苷（批號(hào)110715-201821，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.4%）、木香烴內(nèi)酯（批號(hào)111524-201710，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、去氫木香內(nèi)酯（批號(hào)111525-201912，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、延胡索乙素（批號(hào)110726-201819，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%）、吳茱萸次堿（批號(hào)110801-201608，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)110713-201814，質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.7%）、鹽酸巴馬汀（批號(hào)110732-201812，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.6%）、吳茱萸堿（批號(hào)110802-201710，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、柚皮苷（批號(hào)110722-201815，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.7%）、橙皮苷（批號(hào)110721-201818，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%）、柴胡皂苷a（批號(hào)110777-201912，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.8%）、柴胡皂苷d（批號(hào)110778-201912，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.3%）、槲皮素（批號(hào)100081-201610，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.6%）、漢黃芩素（批號(hào)111514-202207，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.6%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院。山柰酚-3--葡萄糖苷（批號(hào)221011，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、甘草素（批號(hào)220517，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%）、千層紙素A（批號(hào)220106，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、枸橘苷（批號(hào)220803，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%），購(gòu)自深圳惠達(dá)生物科技有限公司。

加味左金丸為北京同仁堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為1903226、1705061、1705062、1705063、1903501、2005041、2007112、2009021、2011011、2012012、2103022、2105103、2107124、2109121、2111202，分別編號(hào)為S1～S15。甲醇、乙腈，色譜純，默克公司。水為超純水，其他試劑均為分析純。2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY Premier BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為乙腈-甲醇1∶1，B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～3 min，5% A；3～10 min，5%～20% A；10～15 min，20%～40% A；15～20 min，40%～60% A；20～30 min，60%～80% A；30～38 min，80%～90% A；體積流量為0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量3 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為ESI源，采集模式正離子與負(fù)離子模式，離子掃描范圍為/100～1500，干燥氣溫度360 ℃，干燥氣體積流量10 L/min，霧化器壓力400 kPa，裂解電壓175 V，毛細(xì)管電壓3500 V，碰撞能量30 eV。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min（功率250 W、頻率40 kHz），放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.2 藥材溶液的制備 按加味左金丸處方比例和工藝，分別制備含單味藥材的樣品，并按“2.3”項(xiàng)下方法制備各藥材溶液。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取各對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度約為10 μg/mL的對(duì)照品溶液。

3 結(jié)果

3.1 加味左金丸中化合物的鑒定與分析

取供試品溶液和各藥材溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜與“2.2”項(xiàng)下的質(zhì)譜條件，高分辨質(zhì)譜測(cè)定，得到正、負(fù)離子模式下的總離子流圖，見(jiàn)圖1。通過(guò)質(zhì)譜給出的分子離子峰和二級(jí)質(zhì)譜碎片離子峰，結(jié)合對(duì)照品的相對(duì)保留時(shí)間，參考相關(guān)的文獻(xiàn)，從加味左金丸中分離和鑒定出92個(gè)成分，包括16個(gè)有機(jī)酸類(lèi)成分、34個(gè)黃酮類(lèi)成分、17個(gè)生物堿類(lèi)成分、21個(gè)萜類(lèi)成分與4個(gè)其他類(lèi)成分。其中14個(gè)來(lái)自枳殼、陳皮和青皮，11個(gè)來(lái)自甘草，14個(gè)來(lái)自白芍，6個(gè)來(lái)自香附，10個(gè)來(lái)自黃連，2個(gè)來(lái)自吳茱萸，11個(gè)來(lái)自黃芩，7個(gè)來(lái)自延胡索，5個(gè)來(lái)自木香，5個(gè)來(lái)自柴胡，6個(gè)來(lái)自當(dāng)歸，2個(gè)來(lái)自郁金，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 有機(jī)酸類(lèi)化合物

有機(jī)酸類(lèi)是分子結(jié)構(gòu)中含有羧基的化合物，在中草藥的葉、根、特別是果實(shí)中廣泛分布。方中的有機(jī)酸類(lèi)化合物根據(jù)羧基相連的結(jié)構(gòu)，主要分為脂肪族類(lèi)有機(jī)酸和芳香族類(lèi)有機(jī)酸。加味左金丸中共鑒定出16個(gè)有機(jī)酸，包括化合物1、4、5、7、10、12、13、18、45、63、68、73、77、78、82、91。由于結(jié)構(gòu)中都含有羧基，因此質(zhì)譜中的負(fù)離子模式的響應(yīng)最好，二級(jí)質(zhì)譜容易產(chǎn)生CO2，H2O等中性丟失。例如綠原酸的裂解規(guī)律，負(fù)離子模式可見(jiàn)其分子離子峰/353 [M－H]?，其特征碎片離子為/191、/179、/173、/161、/135，其中/191與/179是其酰氧鍵斷裂產(chǎn)生的碎片，/191與/179的碎片峰丟失H2O形成/173、/161的碎片峰，/173的碎片峰丟失CO2形成/135的碎片峰，經(jīng)與文獻(xiàn)報(bào)道[33]對(duì)比，確定該化合物為綠原酸。例如沒(méi)食子酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律，負(fù)離子模式可見(jiàn)其分子離子峰/169 [M－H]?，其特征碎片離子為/125、107、97，分別為分子離子峰丟失CO2、CO2與H2O、CO2與CO產(chǎn)生的裂解的碎片，經(jīng)與文獻(xiàn)報(bào)道[34]對(duì)比，確定該化合物為沒(méi)食子酸。

圖1 加味左金丸提取液的UPLC-Q-TOF/MS總離子流色譜圖

表1 加味左金丸提取液中化合物的UPLC-Q-TOF/MS定性分析結(jié)果

Table 1 Qualitative analysis results of chemical constituents in Jiawei Zuojin Pill extracting solution by UPLC-Q-TOF/MS

峰號(hào)tR/min準(zhǔn)分子離子峰分子式實(shí)測(cè)值(m/z)理論值(m/z)誤差(×10?6)碎片離子化合物名稱來(lái)源植物 10.65[M－H]?C7H12O6191.053 8191.054 5?3.66127.103 4, 109.044 1, 93.160 4奎寧酸陳皮、青皮、枳殼[17] 21.26[M＋H]+C27H30O15595.165 2595.165 9?1.18577.165 3, 433.117 3新西蘭牡荊苷II甘草[18] 31.43[M＋H]+C27H30O14579.184 1579.184 7?1.04136.065 1野漆樹(shù)苷陳皮、青皮、枳殼[17] 41.78[M－H]?C7H6O5169.013 3169.013 5?1.18125.023 2沒(méi)食子酸白芍[19] 52.68[M－H]?C6H8O7191.019 6191.019 31.57173.008 3, 129.021 3檸檬酸白芍[19] 63.72[M－H]?C23H28O14S559.112 8559.112 30.89530.106 1, 397.074 5氧化芍藥苷亞硫酸酯白芍[19] 74.31[M－H]?C9H10O3165.056 3165.055 54.85121.066 4, 119.050 1, 93.034 5對(duì)羥基苯丙酸甘草[20] 85.11[M＋H]+C23H28O12497.166 5497.165 71.61467.153 3, 359.127 4, 335.112 7氧化芍藥苷白芍[19] 95.23[M＋H]+C23H28O11481.170 6481.170 30.62319.117 1, 301.107 5, 197.080 4芍藥內(nèi)酯苷白芍[20] 105.51[M－H]?C10H10O5209.046 2209.045 62.87165.056 6, 121.065 3對(duì)羥基芐基丙二酸甘草[20] 115.92[M＋H]+C15H23NO234.178 6234.177 40.85146.173 2rotundine B香附[21] 126.43[M－H]?C15H14O6289. 070 1289. 071 3?0.69271.060 6, 181.070 2兒茶素白芍[19] 136.91[M－H]?C16H18O9353.087 2353.086 51.98191.064 2, 179.043 1, 161.021 6綠原酸黃連[18] 147.88[M＋H]+[M－H]?C15H12O4257.080 6255.080 4257.080 9255.080 9?1.17?1.96147.044 1, 137.023 3, 135.009 22',4,4'-三羥基查耳酮甘草[20] 158.93[M＋H]+C18H13N3O288.114 1288.114 7?2.08273.089 8, 244.087 5217.076 9, 190.066 2吳茱萸次堿*吳茱萸[22-23] 1610.14[M－H]?C23H28O13S543.116 9543.117 3?0.74513.106 5, 381.075 3芍藥苷亞硫酸酯白芍[19] 1711.05[M－H]?[M＋H]+C21H18O11445.085 2447.085 7445.084 9447.084 90.671.79269.046 3黃芩苷*黃芩[24] 1811.63[M＋H]+C16H24O8345.051 3344.047 11.98181.052 7, 161.065 8牡丹皮苷F白芍[19] 1912.02[M＋H]+C15H23NO234.178 2234.177 33.84216.173 5, 188.172 8, 160.162 6, 146.175 2(+)-β-rotunol香附[21] 2012.64[M＋H]+C20H17NO5352.116 5352.117 4?2.56337.091 4, 322.399 8, 308.088 9, 294.072 9氧化小檗堿黃連[25] 2113.42[M＋H]+C26H28O14565.154 7565.155 3?1.06433.114 2, 415.105 2夏佛托苷甘草[18] 2213.62[M＋H]+C17H18O6319.116 8319.117 8?3.13301.106 5, 197.080 6, 105.033 2, 77.039 3芍藥內(nèi)酯C白芍[20] 2313.78[M＋H]+C21H25NO4356.177 8356.178 5?1.97340.154 1, 308.128 4, 192.101 6, 177.078 1, 148.075 8異紫堇球堿延胡索[26] 2414.22[M＋H]+C20H19NO5354.125 3354.126 1?2.26336.123 2, 188.070 3, 149.059 4, 135.044 3原阿片堿延胡索[26] 2514.22[M＋H]+C21H25NO4356.178 8356.178 21.68178.086 5, 163.062 4, 151.057 6延胡索乙素*延胡索[26] 2614.51[M＋H]+C21H23NO5370.156 9370.157 4?1.35342.169 4, 295.069 1, 206.081 5隱品堿延胡索[26] 2714.73[M＋H]+C21H25NO4356.177 7356.178 2?1.40340.154 1, 310.119 5, 292.096 2海罌粟堿延胡索[26]

續(xù)表1

峰號(hào)tR/min準(zhǔn)分子離子峰分子式實(shí)測(cè)值(m/z)理論值(m/z)誤差(×10?6)碎片離子化合物名稱來(lái)源植物 2815.33[M－H]?C26H28O13547.154 5547.153 12.56487.114 5, 457.107 2, 367.076 1, 337.069 4白楊素-6-C-阿拉伯糖- 8-C-葡萄糖苷黃芩[24] 2915.56[M＋H]+C23H28O11481.172 1481.171 21.87451.160 1, 359.135 9, 329.122 2芍藥苷*白芍[19] 3015.76[M]+C20H24NO4342.169 1342.169 6?1.46297.115 2, 265.091 3木蘭堿黃連[18] 3115.84[M－H]?[M＋H]+C21H18O11445.086 1447.083 9445.084 4447.084 43.82?1.12269.060 5, 225.040 3197.040 2去甲漢黃芩素-7-O- β-D-葡萄糖醛酸苷黃芩[24] 3217.17[M－H]?C36H58O10649.237 2649.236 21.54487.081 5長(zhǎng)梗冬青苷陳皮、青皮、枳殼[17] 3318.41[M－H]?C27H32O15595.176 9595.177 6?1.18287.084 1, 151.039 5圣草枸杞苷陳皮、青皮、枳殼[17] 3418.72[M＋H]+C11H13NO3208.096 3208.096 8?2.40165.094 6, 150.073 2唐松草林堿黃連[18] 3518.91[M＋H]+C21H19NO4350.132 1350.131 12.86334.107 2, 320.091 4, 304.096 2, 290.081 7 二氫白屈菜紅堿延胡索[26] 3619.13[M－H]?C27H32O15595.176 9595.177 8?1.51287.089 4, 151.160 1, 135.096 7新圣草枸杞苷陳皮、青皮、枳殼[17] 3719.65[M＋H]+C15H10O7303.049 2303.049 5?0.99257.043 1, 229.051 3槲皮素*甘草[18] 3820.21[M＋H]+C21H20O12465.103 8465.103 41.29303.051 5, 285.039 5, 257.044 3金絲桃苷白芍[19] 3920.66[M＋H]+C21H20O11449.107 3449.108 3?2.23287.055 4, 153.081 6,135.024 3山柰酚-3-O-葡萄糖苷*白芍[19] 4021.13[M＋H]+C15H12O4257.080 5257.080 8?1.17239.073 1, 137.027 2甘草素*甘草[18] 4121.24[M－H]?C27H32O14579.167 6579.168 7?1.90433.167 2, 271.090 6, 153.001 4柚皮苷*青皮、枳殼[17]，陳皮[21] 4221.38[M＋H]+C15H20O2233.153 1233.153 6?2.14215.143 2, 187.147 1, 159.116 5, 145.100 4, 131.084 1, 119.084 2, 105.069 5, 91.053 4, 81.069 6木香烴內(nèi)酯*木香[27-28] 4321.86[M－H]?[M＋H]+C16H12O6299.063 8301.064 1299.063 3301.063 31.672.66286.038 15,7,4′-三羥基-8-甲氧基黃酮黃芩[24] 4422.41[M＋H]+C15H20O3249.148 6249.148 21.61231.138 3, 203.143 1, 213.125 1, 185.131 6, 157.099 4, 143.084 4珊塔瑪內(nèi)酯木香[28] 4522.48[M＋H]+C12H14O3207.101 7207.101 41.45137.059 2, 165.090 4乙酸丁香酚酯木香[28] 4622.56[M－H]?C27H32O14579.169 8579.168 71.90271.090 1, 151.001 7蕓香柚皮苷青皮、枳殼[17]、陳皮[21] 4722.87[M＋H]+C15H22O2235.169 5235.169 21.28161.133 5木香酸木香[28] 4823.15[M＋H]+C15H18O2231.138 8231.138 22.60213.127 4, 195.116 2, 185.132 1, 180.093 2, 175.076 3, 165.069 3, 157.101 4, 143.085 2, 128.062 5去氫木香內(nèi)酯*木香[27-28] 4923.54[M＋H]+C28H34O15611.173 9611.174 6?0.82449.119 2, 303.099 3, 195.096 1橙皮苷*青皮、枳殼[17]、陳皮[21] 5023.63[M－H]?C15H10O6285.040 9285.040 41.75199.040 5, 175.042 1, 151.005 3, 133.031 4木犀草素黃芩[29]

續(xù)表1

續(xù)表1

峰號(hào)tR/min準(zhǔn)分子離子峰分子式實(shí)測(cè)值(m/z)理論值(m/z)誤差(×10?6)碎片離子化合物名稱來(lái)源植物 7833.22[M－H]?C18H30O2277.216 4277.217 2?2.89255.216 6, 248.217 3, 219.216 3, 206.216 2亞麻酸當(dāng)歸[30] 7933.38[M＋H]+C16H12O5285.075 1285.075 9?2.81270.052 8千層紙素A*黃芩[18] 8034.31[M－H]?C17H14O6313.072 6313.071 14.79298.049 6, 295.228 2, 283.024 6, 255.024 7, 164.982 5二羥基-二甲氧基黃酮黃芩[29] 8134.45[M＋H]+C15H24O2237.177 1237.177 3?0.84219.172 7, 201.175 1isocorymbolone香附[21] 8235.06[M－H]?C18H34O2281.248 6281.250 2?5.69255.252 2, 164.253 1, 130.241 1十八烯酸當(dāng)歸[30] 8335.22[M＋H]+C20H20O7373.121 5373.120 13.75357.128 3, 343.125 2, 329.123 8, 312.115 3甜橙黃酮青皮、枳殼、陳皮[21] 8435.43[M＋H]+C21H22O8403.119 9403.119 41.24388.105 4, 373.108 3, 355.089 0, 358.098 1, 330.006 7, 327.065 3川陳皮素青皮、枳殼[17]、陳皮[21] 8535.58[M－H]?C15H10O4253.050 8253.050 60.79209.063 3, 143.054 3, 63.039 1白楊素黃芩[29] 8636.14[M－H]?C28H34O14593.124 2593.124 10.17447.289 8, 285.082 6, 270.079 2枸橘苷*陳皮、青皮、枳殼[17] 8736.77[M＋H]+C15H24O2237.176 3237.176 4?0.42219.173 9, 201.174 6, 179.172 4cypersol B香附[21] 8836.98[M＋H]+C19H22O6343.109 7343.109 50.58327.103 3, 313.103 8, 299.105 1, 282.103 5黃芩配基甲醚青皮、枳殼、陳皮[21] 8937.35[M＋H]+C22H24O9433.141 4433.140 52.08418.142 9, 403.148 2, 385.143 63,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮青皮、枳殼、陳皮[21] 9037.35[M＋H]+C15H22O219.167 2219.167 4?0.91201.163 3, 163.167 3, 145.165 1, 135.163 4香附烯酮香附[21] 9137.76[M＋H]+C16H22O4279.159 8279.159 22.15205.085 6, 149.023 8, 57.069 3鄰苯二甲酸二丁酯白芍[20] 9237.76[M＋H]+C15H22O219.168 9219.168 42.28201.165 5, 163.168 1, 145.166 3, 135.167 2α-香附酮香附[21]

*該化合物是由對(duì)照品進(jìn)行指認(rèn)

*This compound was identified using reference standards

3.3 黃酮類(lèi)化合物

黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于自然界的植物中，是以黃酮（2-苯基色原酮）為母核而衍生的一類(lèi)黃色色素，以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物，在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷類(lèi)的形式存在，也有的以游離形式存在。根據(jù)三碳鍵（C3）結(jié)構(gòu)的氧化程度和B環(huán)的連接位置等特點(diǎn)，黃酮類(lèi)化合物可分為下列幾類(lèi)：黃酮和黃酮醇；黃烷酮（又稱二氫黃酮）和黃烷酮醇（又稱二氫黃酮醇）；異黃酮；異黃烷酮（又稱二氫異黃酮）；查耳酮；二氫查耳酮；橙酮；黃烷和黃烷醇。糖基多連在C8或C6位置上，以氧苷為主，連接的糖有單糖（葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等），雙糖（槐糖、龍膽二糖、蕓香糖等）、三糖（龍膽三糖、槐三糖等）與酰化糖（2-乙酰葡萄糖、嗎啡酰葡萄糖等）。加味左金丸中共鑒定出黃酮共34個(gè)，其中黃酮苷元19個(gè)、黃酮苷15個(gè)。按母核的結(jié)構(gòu)不同，包括黃酮20個(gè)、二氫黃酮10個(gè)、黃酮醇3個(gè)、查耳酮1個(gè)。黃酮類(lèi)化合物在質(zhì)譜中的裂解方式，主要有CO、CO2等中性離子丟失、丟失側(cè)鏈基團(tuán)，糖基的斷裂，C環(huán)發(fā)生RDA裂解等。以二氫黃酮苷類(lèi)成分柚皮苷為例，負(fù)離子模式可見(jiàn)其分子離子峰/579 [M－H]?，其特征碎片離子為/433、/271、/153，其中/433為準(zhǔn)分子離子峰脫去鼠李糖得到的碎片峰，/271為碎片峰/433脫去1分子葡萄糖產(chǎn)生的，/153是碎片峰/271發(fā)生逆-狄爾斯-阿爾德反應(yīng)（RDA）裂解，丟失/120中性碎片得到的，經(jīng)與文獻(xiàn)報(bào)道[35]對(duì)比，確定該化合物為柚皮苷。以黃酮類(lèi)成分漢黃芩素為例，正離子模式可見(jiàn)其分子離子峰/285 [M＋H]+，負(fù)離子模式可見(jiàn)其分子離子峰/283 [M－H]?，其特征碎片離子為/268、/240、/239、/224，其中/268為準(zhǔn)分子離子峰脫去甲基得到的碎片峰，/240為碎片峰/268脫去-CO得到的碎片峰，/240為碎片峰/268脫去-COH得到的碎片峰，/224為碎片峰/268脫去-COH得到的碎片峰，經(jīng)與文獻(xiàn)報(bào)道[24]對(duì)比，確定該化合物為漢黃芩素，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2，可能的裂解途徑見(jiàn)圖3。

3.4 生物堿類(lèi)化合物

生物堿是存在于自然界中的一類(lèi)含氮的堿性有機(jī)化合物，有顯著的生物活性，是中草藥中重要的有效成分之一。加味左金丸中鑒定得到17個(gè)生物堿類(lèi)成分，主要來(lái)在于黃連、吳茱萸和延胡索。生物堿的類(lèi)型主要為異喹啉類(lèi)生物堿和吲哚類(lèi)生物堿，異喹啉類(lèi)生物堿主要來(lái)自于黃連和延胡索，如表小檗堿、小檗堿、氧化小檗堿、巴馬汀等；吲哚類(lèi)生物堿主要來(lái)自于吳茱萸，如吳茱萸次堿和吳茱萸堿。以異喹啉類(lèi)生物堿原小檗堿型的小檗堿舉例，正離子模式下的分子離子峰為/336 [M]+，其特征碎片離子為/321、/320、/292，其中/320為準(zhǔn)分子離子峰失去端基上的甲基并發(fā)生氫重排得到的碎片峰，/292為碎片峰/320脫去-CO產(chǎn)生的，經(jīng)與文獻(xiàn)報(bào)道[35]對(duì)比，進(jìn)一步對(duì)比對(duì)照品確定該化合物為小檗堿。以異喹啉類(lèi)生物堿氧化小檗堿型的氧化小檗堿舉例，正離子模式下的分子離子峰為/352 [M＋H]+，其特征碎片離子為/337、/322、/308、/294，其中/337為準(zhǔn)分子離子峰失去甲基得到的碎片峰，其中/322為/337碎片峰失去端基上的甲基并發(fā)生氫重排得到的碎片峰，/308為/337碎片峰失去-CHO得到的碎片峰，/294為/308碎片峰失去甲基得到的碎片峰，經(jīng)與文獻(xiàn)報(bào)道[25]對(duì)比，確定該化合物為氧化小檗堿，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4，可能的裂解途徑見(jiàn)圖5。以吲哚類(lèi)生物堿的吳茱萸次堿舉例，正離子模式下的分子離子峰為/288 [M＋H]+，其特征碎片離子為/273、244、217、190，其中/273為準(zhǔn)分子離子峰失去-CH3得到的碎片峰，其中/244為/273碎片峰丟失-HCO的碎片峰，/217為/244碎片峰失去-HCN得到的碎片峰，/190為/217碎片峰失去-HCN得到的碎片峰，經(jīng)與文獻(xiàn)報(bào)道[23]對(duì)比，進(jìn)一步對(duì)比對(duì)照品確定該化合物為吳茱萸次堿，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6，可能的裂解途徑見(jiàn)圖7。

圖2 漢黃芩素的MS/MS圖

圖3 漢黃芩素可能的裂解途徑

圖4 氧化小檗堿的MS/MS圖

圖5 氧化小檗堿可能的裂解途徑

3.5 萜類(lèi)化合物

萜類(lèi)化合物是由甲戊二羥酸衍生、且分子骨架以異戊二烯單元（C5單元）為基本結(jié)構(gòu)單元的化合物及其衍生物，在自然界中，萜類(lèi)化合物分布很廣，有些具有生理活性。根據(jù)分子中包括異戊二烯單位的數(shù)目將萜類(lèi)可分為單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜、多萜。加味左金丸中鑒定得到21個(gè)萜類(lèi)成分，有倍半萜類(lèi)、倍半萜內(nèi)酯類(lèi)、單萜類(lèi)和三萜類(lèi)。倍半萜類(lèi)化合物有α-香附酮、香附烯酮、石竹烯氧化物、isocorymbolone、cypersol B；倍半萜內(nèi)酯類(lèi)化合物有去氫木香烴內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、珊塔瑪內(nèi)酯、木香酸；單萜類(lèi)化合物主要來(lái)自于白芍，有氧化芍藥苷亞硫酸酯、氧化芍藥苷、芍藥苷亞硫酸酯、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥內(nèi)酯C；三萜類(lèi)化合物主要來(lái)自于柴胡，有柴胡皂苷 D、柴胡皂苷 A、柴胡皂苷C、4″--乙?；窈碥誅、柴胡皂苷G、長(zhǎng)梗冬青苷。以倍半萜內(nèi)酯類(lèi)化合物去氫木香烴內(nèi)酯舉例，正離子模式下的分子離子峰為/231 [M＋H]+，其特征碎片離子為/213、195、185、180、175、165、157、143、128，其中/213為準(zhǔn)分子離子峰失去1分子H2O得到的碎片峰，其中/195為準(zhǔn)分子離子峰失去2分子H2O得到的碎片峰，其中/185為/213碎片峰失去CO得到的碎片峰，經(jīng)與文獻(xiàn)報(bào)道[28]對(duì)比，確定該化合物為去氫木香烴內(nèi)酯。以三萜皂苷類(lèi)化合物柴胡皂苷G舉例，負(fù)離子模式下的分子離子峰為/779 [M－H]?，根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量可確定其分子式為C42H68O13，其特征碎片離子為/617、471，其中/617為母離子峰失去1分子半乳糖得到的碎片峰，其中/471為/617碎片峰失去1分子的葡萄糖得到的碎片峰，經(jīng)與文獻(xiàn)報(bào)道[29]對(duì)比，確定該化合物為柴胡皂苷G。

圖6 吳茱萸次堿的MS/MS圖

圖7 吳茱萸次堿可能的裂解途徑

3.6 指紋圖譜的建立

3.6.1 色譜條件 指紋圖譜的色譜條件為：色譜柱為Atlantis T3 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，5% A；5～40 min，5%～40% A；40～60 min，40%～60% A；60～90 min，60%～80% A；90～94 min，80%～5% A；94～104 min，5% A；體積流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。液相色譜圖見(jiàn)圖8。

3.6.2 精密度試驗(yàn) 取同一批次（1903226）的樣品，按“2.3.1”項(xiàng)方法制備成供試品溶液，作為精密度試驗(yàn)溶液，按“3.6.1”項(xiàng)下的色譜條件，供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定。由于12號(hào)峰（橙皮苷）面積最大，同時(shí)分離度符合要求，因此選擇此峰為參照峰。以12號(hào)峰為參照峰，計(jì)算13個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積的RSD均小于4.0%，表明方法的精密度良好。

3.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次（1903226）的樣品，精密稱取6份，按“2.3.1”項(xiàng)方法制備成供試品溶液，作為重復(fù)性試驗(yàn)溶液，按“3.6.1”項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定。以12號(hào)峰為參照峰，計(jì)算13個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積的RSD均小于4.0%，表明該檢測(cè)方法重復(fù)性良好。

3.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3.1”項(xiàng)方法制備成供試品溶液，作為穩(wěn)定性試驗(yàn)溶液，按“3.6.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、16、18、24、36、48 h進(jìn)行測(cè)定。以12號(hào)峰為參照峰，計(jì)算13個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.0%，相對(duì)峰面積的RSD均小于4.0%，表明48 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

3.6.5 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 將15批加味左金丸按“2.3.1”項(xiàng)方法制成供試品溶液，按“3.6.1”項(xiàng)指紋圖譜的色譜條件對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，以S1號(hào)樣品的色譜圖為參照?qǐng)D譜進(jìn)行全譜峰匹配，經(jīng)過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了13個(gè)共有峰，1號(hào)峰為黃芩苷、2號(hào)峰為山柰酚-3--葡萄糖苷、3號(hào)峰為槲皮素、4號(hào)峰為漢黃芩素、5號(hào)峰為甘草素、6號(hào)峰為千層紙素A、7號(hào)峰為芍藥苷、8號(hào)峰為吳茱萸次堿、9號(hào)峰為小檗堿、10號(hào)峰為巴馬汀、11號(hào)峰為枸橘苷、12號(hào)峰為橙皮苷、13號(hào)峰為柴胡皂苷d。15批加味左金丸樣品的指紋疊加圖譜，見(jiàn)圖9，各批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.972、0.977、0.979、0.981、0.991、0.984、0.992、0.991、0.992、0.985、0.982、0.984、0.990、0.979、0.988。結(jié)果顯示，15批加味左金丸與對(duì)照譜圖的相似度均在0.95以上，這表明15批次加味左金丸質(zhì)量的穩(wěn)定性和均一性良好。

1-黃芩苷 2-山柰酚-3-O-葡萄糖苷 3-槲皮素 4-漢黃芩素 5-甘草素 6-千層紙素 A 7-芍藥苷 8-吳茱萸次堿 9-小檗堿 10-巴馬汀 11-枸橘苷 12-橙皮苷 13-柴胡皂苷d

4 討論

為了對(duì)加味左金丸的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行深入的研究，本研究采用具有強(qiáng)大分離鑒定能力的高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)于加味左金丸的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分析。實(shí)驗(yàn)中供試品的提取方式采用藥典中的方法，但是本研究對(duì)于提取溶劑和提取時(shí)間也進(jìn)一步進(jìn)行了確認(rèn)，因?yàn)樘幚磉^(guò)程中溶劑會(huì)有變化和時(shí)間也會(huì)產(chǎn)生誤差，因此分別考察了該樣品處理方式的耐用性范圍。本研究主要對(duì)于色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行了較為系統(tǒng)、全面的優(yōu)化，以便提高質(zhì)譜的分離鑒定能力。首先對(duì)于色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，在流動(dòng)相考察中，分別考察了乙腈水溶液、甲醇水溶液、甲醇乙腈水溶液、乙腈甲酸水溶液、甲醇甲酸水溶液、乙腈乙酸銨水溶液，甲醇乙酸水溶液，綜合分離度和分離的峰個(gè)數(shù)確定了乙腈甲醇甲酸水溶液體系。在色譜柱考察中，不僅僅對(duì)于不同廠家的C18柱進(jìn)行了考察，而且對(duì)于其他類(lèi)型的填料也進(jìn)行了考察，由于是UPLC體系，體積流量不能太高，樣品必須進(jìn)行濾過(guò)，進(jìn)樣量也要進(jìn)行優(yōu)化，以免超載進(jìn)樣。其次對(duì)于質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，由于中成藥中成分較為復(fù)雜，有些酸性成分在負(fù)離子模式的響應(yīng)更好，因此采用了正、負(fù)離子模式同時(shí)進(jìn)行采樣，同時(shí)對(duì)于二級(jí)質(zhì)譜的碰撞能量進(jìn)行了優(yōu)化，以便得到更多的碎片峰信息，有利于質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析。

圖9 15批加味左金丸指紋圖譜

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)共鑒定了92個(gè)化學(xué)成分，主要包括16個(gè)有機(jī)酸類(lèi)成分、34個(gè)黃酮類(lèi)成分、17個(gè)生物堿類(lèi)成分、21個(gè)萜類(lèi)成分與4個(gè)其他類(lèi)成分。加味左金丸具有平肝降逆、疏郁止痛的功效，研究證明復(fù)方中君藥黃連中的生物堿具有抗氧化和消炎的作用[36-37]，復(fù)方中君藥吳茱萸中的生物堿具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜安神的作用[38]，臣藥黃芩中的黃酮具有抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜和解熱的作用[39]。加味左金丸中多個(gè)成分共同發(fā)揮作用，使其臨床廣泛用于胃炎、食管炎與慢性結(jié)腸炎等疾病的治療。基于化學(xué)成分的研究，為了更好地控制該中成藥的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)建立了該中成藥的液相指紋圖譜，對(duì)于多批次的樣品進(jìn)行了測(cè)定，也通過(guò)數(shù)據(jù)表明樣品質(zhì)量的穩(wěn)定性。

本研究首次對(duì)加味左金丸中多種化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的分離和鑒定，基本闡明了該中成藥中的化學(xué)成分的種類(lèi)，并對(duì)各個(gè)成分進(jìn)行了藥材來(lái)源的歸屬，為加味左金丸的藥效的基礎(chǔ)研究提供參考。當(dāng)然，在整個(gè)研究過(guò)程中，有一些化學(xué)成分還未鑒定，需要后續(xù)做進(jìn)一步的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical components and chromatographic fingerprints of Jiawei Zuojin Pill based on UPLC-Q-TOF/MS

CHEN Hui-peng1, WANG Yin1, YU Hui-min2, ZHOU Hong-zu3

1. Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Shenzhen 518116, China 2. School of Medicine, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China 3. Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, China

To qualitatively analyze the main chemical constituents of traditional Chinese medicine compound Jiawei Zuojin Pill (加味左金丸) by using UPLC-Q-TOF/MS technology.The separation was performed on ACQUITY Premier BEH C18column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm), and the gradient elution of acetonitrile-methanol-0.1% formic acid was used as mobile phase at a flow rate of 0.3 mL/min. The data was collected by the positive and negative ion modes using Q-TOF/MS and ESI source. The main chemical constituents of Jiawei Zuojin Pill were identified according to the exact molecular mass, the cleavage fragments of MS/MS, the literature data, and the reference control. And chromatographic fingerprints of different batches of Jiawei Zuojin Pill were established.A total of 92 chemical components were identified in Jiawei Zuojin Pill, including 16 organic acids, 34 flavonoids, 17 alkaloids, 21 terpenoid and four other components. The HPLC fingerprint of Jiawei Zuojin Pill was established with 13 common peaks, which were baicalin, astragalin, quercetin, wogonin, liquiritigenin, oroxylin A, paeoniflorin, rutecarpine, berberine, palmatine, poncirin, hesperidin, saikosaponin d. And the precision, stability and reproducibility of the HPLC fingerprint were acceptable. The components in different batches of Jiawei Zuojin Pill were basically similar.This study showed that UPLC-Q-TOF/MS technology provided a rapid and accurate method for the identification of chemical constituents in Jiawei Zuojin Pill. The HPLC fingerprint could provide an important basis for the quality control and pharmacodynamic material basis study of Jiawei Zuojin Pill.

HPLC-MS; Jiawei Zuojin Pill; fragmentation patterns; fingerprint; baicalin; astragalin; wogonin; liquiritigenin; oroxylin A; paeoniflorin; rutecarpine; berberine;saikosaponin d

R284.1

A

0253 - 2670(2023)14 - 4442 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.005

2023-01-19

深圳市基礎(chǔ)研究專(zhuān)項(xiàng)（自然科學(xué)基金）基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目（JCYJ20220531102208019）；2022年深圳市藥學(xué)會(huì)醫(yī)院藥學(xué)研究基金（恒瑞基金）（SZ2022A25）；深圳大學(xué)聚徒＋創(chuàng)研項(xiàng)目（2022年度）

陳會(huì)朋（1988—），男，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴帍?fù)方研究。Tel: 13410898605 E-mail: 372677278@qq.com

余惠旻，男，博士，副研究員，主要從事中藥及其復(fù)方的現(xiàn)代藥理研究。E-mail: yuhuimin@szu.edu.cn

周紅祖，女，主任中藥師，中藥特色技術(shù)傳承人（粵中醫(yī)辦函[2016]54號(hào)），主要從事中藥學(xué)基礎(chǔ)及中藥藥理、鑒定研究。E-mail: zhouhzu@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]