張露丹，龍玉嬌，王瑞灃，曹亞男，范小勇，鄒 坤，王 慧*

?化學(xué)成分 ?

貓爪草中的1個新呋喃倍半萜

張露丹1，龍玉嬌1，王瑞灃1，曹亞男1，范小勇2，鄒 坤1，王 慧1*

1. 三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

研究貓爪草的化學(xué)成分及其體外抗結(jié)核桿菌活性。綜合運用正相硅膠柱色譜、大孔樹脂柱色譜、薄層色譜和高效液相色譜等多種色譜技術(shù)對貓爪草醇提物進行分離純化，根據(jù)化合物的理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)鑒定其結(jié)構(gòu)，并采用微量肉湯二倍稀釋法對所得到的單體化合物進行體外抗結(jié)核桿菌活性評價。從貓爪草醇提物中分離鑒定了11個單體化合物，分別為(5)-5-[5-(furan-3-yl)-2-methyl-5-oxopentyl]-3-methylfuran-2(5)-one（1）、棕櫚酸乙酯（2）、鄰苯二甲酸二丁酯（3）、反式-4-羥基-2-壬烯酸（4）、亞油酸甲酯（5）、亞油酸乙酯（6）、亞油酸（7）、1--(9, 12-octadecadienoyl) glycerol（8）、煙酰胺（9）、腺苷（10）和鄰苯二甲酸二甲酯（11）。體外抗結(jié)核桿菌實驗結(jié)果表明，化合物1、2、4～8和10對牛型分枝桿菌BCG有較弱抑制活性，其最低抑菌濃度均為100 μg/mL?；衔?為新的呋喃倍半萜，命名為貓爪草呋喃倍半萜A，化合物4、8～11為首次從該植物中分離得到。化合物1、2、4～8和10對牛型分枝桿菌BCG有較弱抑制活性。

貓爪草；貓爪草呋喃倍半萜A；結(jié)核桿菌；煙酰胺；反式-4-羥基-2-壬烯酸；腺苷

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是一種古老的、經(jīng)空氣傳播的慢性感染性疾病，由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起，最常見的患病部位是肺部（即肺結(jié)核）。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World health organization，WHO）最新數(shù)據(jù)顯示，2021年全球約有1060萬個結(jié)核病新發(fā)病例，導(dǎo)致約160萬人死亡，目前全球約有1/4的人口感染Mtb，結(jié)核病是嚴重危害人類健康的傳染性疾病之一，是全球單一傳染病致死的十大死亡原因之一[1]。

貓爪草是毛茛科毛茛屬一年生草本植物小毛茛Thunb.的干燥塊根，始載于《中藥材手冊》，1977年開始收載于《中國藥典》，現(xiàn)被列為國家重點發(fā)展的3類中藥材之一[2]。貓爪草的塊根為主要入藥部分，民間用其治療淋巴結(jié)核。臨床上貓爪草也用于治療結(jié)核病、腫瘤和咽炎[3]。國內(nèi)已有貓爪草膠囊獲得生產(chǎn)批準，還有益肺止咳膠囊、仙魚湯、養(yǎng)金護肺湯等包含貓爪草在內(nèi)的復(fù)方藥劑[4]。經(jīng)文獻調(diào)研，國內(nèi)外學(xué)者已從貓爪草中分離鑒定出有機酸類、酯類、黃酮類、生物堿類、糖苷類等多種化學(xué)成分，且對貓爪草及其制劑進行了抗結(jié)核活性和臨床療效的研究[5-12]。

本研究前期采用微量肉湯二倍稀釋法評價了貓爪草醇提物石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取部位的體外抗結(jié)核桿菌活性，結(jié)果表明其萃取部位均對牛型分枝桿菌BCG均具有一定抑制活性，最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）分別為200、100和200 μg/mL。為明確其抗結(jié)核桿菌活性成分，本課題組對貓爪草醇提物石油醚、醋酸乙酯及正丁醇萃取部位化學(xué)成分進行了系統(tǒng)分離，共分離得到11個化合物，分別鑒定為(5)-5-[5-(furan- 3-yl)-2-methyl-5-oxopentyl]-3-methylfuran-2(5)-one（1）、棕櫚酸乙酯（ethyl palmitate，2）、鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，3）、反式-4-羥基-2-壬烯酸（-4-hydroxy-2-nonenoic acid，4）、亞油酸甲酯（methyl linoleate，5）、亞油酸乙酯（ethyl linoleate，6）、亞油酸（linoleic acid，7）、1--(9,12- octadecadienoyl) glycerol（8）、煙酰胺（niacinamide，9）、腺苷（β-adenosine，10）和鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，11），結(jié)構(gòu)見圖1?；衔?為新的呋喃倍半萜，命名為貓爪草呋喃倍半萜A；化合物4、8～11為首次從該植物中分離得到。對單體化合物進行體外抗結(jié)核桿菌活性評價，實驗結(jié)果顯示，化合物1、2、4～8和10對牛型分枝桿菌BCG有較弱抑制活性，其MIC均為100 μg/mL。

圖1 化合物1～11的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；LC-2010型高效液相色譜儀（北京清博華科技有限公司）；分析型色譜柱YMC-Pack ODA-A（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本 YMC 公司）；半制備型色譜柱Daisogel-10μ-100A（250 mm×10 mm，10 μm，日本DAISO公司）；半制備型色譜柱Positisil ODS-P（250 mm×10 mm，5 μm，北京英萊克科技發(fā)展有限公司）；AV 400型核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司）；solariX型FT-ICR MS/MRMS（德國布魯克道爾頓公司）；Acquity QDa型質(zhì)譜檢測器（美國Waters公司）；Chirascan型圓二色光譜儀（英國應(yīng)用光物理公司）；GLH-100C型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（德國BINDER公司）；Haier HR40-ⅡA2型生物安全柜（上海恒勤儀器設(shè)備有限公司）；UV-5900型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；TOMY SX-700型蒸汽滅菌器（北京久航潤達科技有限公司）；200～300、300～400目正相柱色譜硅膠、薄層色譜硅膠板GF254（青島海洋化工有限公司）；HP-20大孔吸附樹脂（日本三菱公司）；色譜甲醇、色譜乙腈（美國TEDIA公司）；石油醚、醋酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、濃硫酸（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；正丁醇、無水乙醇（國藥集團）；α-萘酚（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；Middlebrook 7H9培養(yǎng)基（美國BD公司）；甘油（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；聚山梨酯80（生工生物工程股份有限公司）；DMSO、異煙肼、乙胺丁醇（美國Sigma-Aldrich公司）；利福平（常州制藥廠有限公司）。

藥材于2021年5月購買自云南省，經(jīng)三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院王玉兵教授鑒定為小毛茛Thunb.的干燥塊根。標本（RT20210001）存放于三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室。

標準菌株牛型分枝桿菌BCG由上海公共衛(wèi)生臨床中心提供。

2 提取與分離

貓爪草干燥塊根2.19 kg，粉碎后加95%乙醇2.5 L，冷浸提取4次，每次24 h，合并提取液，減壓濃縮得濃縮液。濃縮液用水分散后，依次用石油醚、醋酸乙酯及正丁醇各1.5 L萃取4次，各部分萃取液減壓濃縮至干，得到石油醚萃取部位（18.7 g），醋酸乙酯萃取部位（3.9 g）及正丁醇萃取部位（20.6 g）。

石油醚部位（18.7 g）經(jīng)正相硅膠柱色譜（200～300目）分離，石油醚-丙酮（100∶0→1∶2）梯度洗脫，得到122個流分。TLC及HPLC分析后，合并Fr. 66～71（236.4 mg），經(jīng)半制備型HPLC分離純化（甲醇-水47∶53，3 mL/min），得到化合物1（2.2 mgR＝25.7 min）。合并Fr. 25～30（R1，4.6 g），經(jīng)正相硅膠柱色譜（300～400目）進一步分離，石油醚-醋酸乙酯（50∶1→1∶1）梯度洗脫，得到106個流分，TLC及HPLC分析后，合并亞流分Fr. R1-7～11（143.2 mg），經(jīng)半制備HPLC分離純化（乙腈-水73∶27，3 mL/min），得到化合物2（6.4 mg，R＝29.7 min）；合并亞流分Fr. R1-39～42（401.4 mg），經(jīng)半制備HPLC分離純化（甲醇-水66∶34，3 mL/min），得到化合物3（4.5 mg，R＝39.8 min）。合并Fr. 52～60（R2，2.9 g），經(jīng)正相硅膠柱色譜（300～400目）進一步分離，二氯甲烷-甲醇（100∶0→2∶1）梯度洗脫，得到96個流分，TLC及HPLC分析后，合并亞流分Fr. R2-67～73（197.1 mg），經(jīng)半制備HPLC分離純化（乙腈-0.1%乙酸水29∶71，3 mL/min），得到化合物4（4.3 mg，R＝21.9 min）。

醋酸乙酯部位（R3，3.9 g）經(jīng)正相硅膠柱色譜（200～300目）分離，石油醚-醋酸乙酯（100∶0→1∶3）梯度洗脫，得到200個流分。TLC及HPLC分析后，合并Fr. R3-33～40（176.5 mg），經(jīng)半制備HPLC分離純化（乙腈-水79∶21，3 mL/min），得到化合物5（11.6 mg，R＝67.5 min）和6（17.6 mg，R＝80.2 min）；合并Fr. R3-79～80（115.3 mg），經(jīng)半制備HPLC分離純化（乙腈-水75∶25，3 mL/min），得到化合物7（48.4 mg，R＝38.8 min）；合并Fr. R3-135～148（65.7 mg），經(jīng)半制備HPLC分離純化（乙腈-水65∶35，3 mL/min），得到化合物8（13.5 mg，R＝57.4 min）。

正丁醇部位（R4，20.6 g）經(jīng)HP-20大孔吸附樹脂柱色譜分離，純水洗脫至Molish試劑對洗脫液無紫環(huán)反應(yīng)，后續(xù)以（30%、60%、100%）乙醇-水梯度洗脫，得到26個流分。經(jīng)TLC及HPLC分析后，合并Fr. R4-5～6（583.2 mg），經(jīng)半制備HPLC分離純化（甲醇-0.1%乙酸水4∶96，3 mL/min），得到化合物9（2.9 mg，R＝17.2 min）和10（21.6 mg，R＝62.6 min）；合并Fr. R4-20～26（313.3 mg），經(jīng)半制備HPLC分離純化（甲醇-0.1%乙酸水28∶72，3 mL/min），得到化合物11（4.9 mg，R＝37.2 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色油狀物，HR-ESI-MS給出準分子離子峰/: 263.127 7 [M＋H]+（理論值263.127 8）；285.109 7 [M＋Na]+（理論值285.109 7）；547.230 1 [2M＋Na]+（理論值547.230 2），由此可知，化合物1的分子式為C15H18O2，不飽和度為7。從碳譜和氫譜數(shù)據(jù)（表1）可知，化合物含有3個碳碳雙鍵和2個羰基碳，由此推測，該化合物含有2個環(huán)系。

結(jié)合1H-NMR、13C-NMR和HSQC譜可知，該化合物有2個CH3，3個CH2，6個CH以及4個季碳。1H-NMR譜中，低場區(qū)給出5個質(zhì)子信號H8.05 (1H, brs, H-4), 7.45 (1H, t,= 1.6 Hz, H-1), 7.04 (1H, 的質(zhì)子；高場區(qū)在H2.77 (2H, t,= 7.2 Hz, H2-6), 1.88 (1H, m, H-7a), 1.78 (1H, m, H-8), 1.64 (1H, m, H-10a), 1.57 (1H, m, H-7b) 和1.52 (1H, m, H-10b) 處給出6個連在脂肪碳上的質(zhì)子信號；在H1.92 (3H, t,= 1.6 Hz, Me-15) 處給出1個連在烯碳上的甲基質(zhì)子信號和H1.02 (3H, d,= 7.2 Hz, Me-9) 處1個連在次甲基上的甲基質(zhì)子信號。

表1 化合物1的核磁數(shù)據(jù)(400/100 MHz, CDCl3)

Table 1 NMR data of compound 1 (400/100 MHz, CDCl3)

碳位δCδH 1144.47.45 (1H, t, J = 1.6 Hz) 2108.86.76 (1H, d, J = 1.6 Hz) 3127.8 4147.28.05 (1H, brs) 5195.0 637.92.77 (1H, t, J = 7.2 Hz) 2.77 (1H, t, J = 7.2 Hz) 7a30.71.88 (1H, m) 7b 1.57 (1H, m) 830.01.78 (1H, m) 920.11.02 (3H, d, J = 7.2 Hz) 10a40.91.64 (1H, m) 10b 1.52 (1H, m) 1179.74.98 (1H, m) 12149.17.04 (1H, t, J = 1.6 Hz) 13130.0 14174.4 1510.81.92 (3H, t, J = 1.6 Hz)

1H-1H COSY譜（圖2）中，H7.45 (1H, t,＝1.6 Hz, H-1) 和6.76 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2) 存在明顯相關(guān)；H2.77 (2H, t,= 7.2 Hz, H2-6) 和1.88 (1H, m, H-7a) 以及1.57 (1H, m, H-7b) 存在明顯相關(guān)；H1.78 (1H, m, H-8) 和1.57 (1H, m, H-7b), 1.52 (1H, m, H-10b), 1.02 (3H, d,= 7.2 Hz, Me-9) 均存在明顯相關(guān)；H1.52 (1H, m, H-10b) 和4.98 (1H, m, H-11) 存在明顯相關(guān)；H4.98 (1H, m, H-11) 和7.04 (1H, t,= 1.6 Hz, H-12) 存在明顯相關(guān)。HMBC譜（圖2）中H8.05 (1H, brs, H-4) 和c 144.4 (C-1), 127.8 (C-3), 108.8 (C-2) 存在明顯相關(guān)；H7.45 (1H, t,＝1.6 Hz, H-1) 和C147.2 (C-4), 127.8 (C-3), 108.8 (C-2) 存在明顯相關(guān)；H6.76 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2) 和c 144.4 (C-1), 147.2 (C-4) 存在明顯相關(guān)，提示分子中存在呋喃環(huán)單元；HMBC譜（圖2）中H7.04 (1H, t,= 1.6 Hz, H-12) 和C79.7 (C-11) 存在明顯相關(guān)；H2.77 (2H, t,= 7.2 Hz, H2-6) 和Ct,= 1.6 Hz, H-12), 6.76 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2) 和4.98 (1H, m, H-11)，推測為連在烯碳或者連氧碳上195.0 (C-5), 30.7 (C-7) 存在明顯相關(guān)；H1.92 (3H, t,= 1.6 Hz, Me-15) 和C174.4 (C-14), 149.1 (C-12), 130.0 (C-13) 存在明顯相關(guān)，提示該甲基連在C-13位；H1.02 (3H, d,= 7.2 Hz, Me-9) 和C40.9 (C-10), 30.7 (C-7), 30.0 (C-8) 存在明顯相關(guān)，提示該甲基連在C-8位；H1.64 (1H, m, H-10a), 1.52 (1H, m, H-10b) 和C79.7 (C-11) 存在明顯相關(guān)；H1.64 (1H, m, H-10a) 和C149.1 (C-12) 存在明顯相關(guān)。NOESY譜（圖3）中，H1.02 (3H, d,= 7.2 Hz, Me-9) 和H1.57 (1H, m, H-7b), 1.52 (1H, m, H-10b)存在明顯相關(guān)，表明其位于同側(cè)；而H1.02 (3H, d,= 7.2 Hz, Me-9) 和H4.98 (1H, m, H-11) 沒有明顯相關(guān)，表明其位于異側(cè)。

圖2 化合物1的主要HMBC和1H-1H COSY相關(guān)

圖3 化合物1的主要NOESY相關(guān)

化合物1的絕對構(gòu)型通過圓二色散光譜（circular dichroism，CD）的量子化學(xué)計算所確定。黑色曲線部分為該化合物的實測CD曲線，黑色虛線分別對應(yīng)其2種互為鏡像的立體構(gòu)型的計算CD曲線。將實測CD曲線和計算CD曲線比對，根據(jù)匹配度確定該化合物的絕對構(gòu)型為11（圖4）。經(jīng)Sci-finder檢索，化合物1為新化合物，命名為貓爪草呋喃倍半萜A（ranunculifuran A）。

化合物2：白色固體。HR-ESI-MS/: 285.278 8 [M＋H]+（理論值285.278 8），確定分子式為C18H36O2，計算不飽和度為1。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 0.88 (3H, t,= 7.2 Hz, H-16), 1.26 (27H, m, H-4～15, 18), 1.61 (2H, m, H-3), 2.29 (2H, t,= 7.6 Hz, H-2), 4.13 (2H, dd,= 14.0, 7.2 Hz, H-17)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 14.3 (CH3), 14.4(CH3), 22.8 (C-15), 25.1 (C-3), 29.3～29.8 (C-4～13), 32.1 (C-14), 34.6 (C-2), 60.3 (C-17), 174.1 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)基本一致[13]，故鑒定化合物2為棕櫚酸乙酯。

圖4 化合物1的計算ECD曲線和實測ECD曲線

化合物3：無色油狀物。HR-ESI-MS/: 279.159 1 [M＋H]+（理論值279.159 1），確定分子式為C16H22O4，計算不飽和度為6。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 0.96 (6H, t,= 7.6 Hz, H-4′), 1.44 (4H, m, H-3′), 1.72 (4H, m, H-2′), 4.31 (4H, t,= 6.8 Hz, H-1′), 7.53 (2H, dd,= 5.6, 3.6 Hz, H-1, 2), 7.72 (2H, dd,= 5.6, 3.6 Hz, H-3, 6)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 13.9 (C-4′), 19.3 (C-3′), 30.7 (C-2′), 65.7 (C-1′), 129.0 (C-3, 6), 131.1 (C-4, 5), 132.5 (C-1, 2), 167.9 (C＝O)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)基本一致[14]，故鑒定化合物3為dibutyl phthalate。

化合物4：無色油狀物。ESI-MS/: 171.1 [M－H]?（理論值171.1），分子式C9H16O3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 0.89 (3H, t,= 6.0 Hz, H-9), 1.29～1.47 (6H, m, H-6～8), 1.57 (2H, m, H-5), 4.31 (1H, s, H-4), 6.04 (1H, s, H-2), 6.99 (1H, m, H-3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 14.2 (C-9), 22.7 (C-8), 25.1 (C-7), 31.8 (C-6), 36.6 (C-5), 71.2 (C-4), 120.2 (C-2), 152.1 (C-3), 171.5 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)基本一致[15]，故鑒定化合物4為-4-hydroxy- 2-nonenoic acid。

化合物5：無色油狀物。HR-ESI-MS/: 295.263 2 [M＋H]+（理論值295.263 2），確定分子式為C19H34O4，計算不飽和度為3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 0.88 (3H, t,= 6.8 Hz, H-18), 1.25～1.39 (14H, m, H-4～7, 15～17), 1.63 (2H, m, H-3), 2.04 (4H, dd,= 14.0, 7.2 Hz, H-8, 14), 2.30 (2H, t,= 7.6 Hz, H-2), 2.77 (2H, t,= 7.2 Hz, H-11), 3.66 (3H, s, -OCH3), 5.29～5.40 (4H, m, H-9, 10, 12, 13)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 14.2 (C-18), 22.7 (C-17), 25.1 (C-3), 25.8 (C-11), 27.3 (C-8), 27.3 (C-14), 29.2 (C-6), 29.3 (C-5), 29.3 (C-4), 29.5 (C-15), 29.7 (C-7), 31.7 (C-16), 34.2 (C-2), 51.6 (C-OCH3), 128.0 (C-12), 128.2 (C-10), 130.2 (C-9), 130.4 (C-13), 174.5 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)基本一致[16]，故鑒定化合物5為methyl linoleate。

化合物6：無色油狀物。HR-ESI-MS/: 309.278 8 [M＋H]+（理論值309.278 8），確定分子式為C20H36O2，計算不飽和度為3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 0.88 (3H, t,= 6.8 Hz, H-18), 1.25 (3H, t,= 7.2 Hz, H-20), 1.27～1.34 (14H, m, H-4～7, 15～17), 1.61 (2H, m, H-3), 2.04 (4H, dd,= 14.0, 7.2 Hz, H-8, 14), 2.28 (2H, t,= 7.2 Hz, H-2), 2.76 (2H, t,= 7.2 Hz, H-11), 4.11 (2H, dd,= 14.0, 7.2 Hz, H-19), 5.35 (4H, m, H-9, 10, 12, 13)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 14.2 (C-18), 14.4 (C-20), 22.7 (C-17), 25.1 (C-16), 25.7 (C-6), 27.3 (C-7), 27.3 (C-15), 29.2 (C-8), 29.2 (C-14), 29.3 (C-5), 29.5 (C-11), 29.7 (C-4), 31.6 (C-3), 34.5 (C-2), 60.3 (C-19), 128.0 (C-10), 128.1 (C-12), 130.2 (C-9), 130.3 (C-13), 174.1 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[17]，故鑒定化合物6為ethyl linoleate。

化合物7：無色油狀物。HR-ESI-MS/: 281.247 6 [M＋H]+（理論值為281.247 5），確定分子式為C18H32O2，計算不飽和度為3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 0.89 (3H, t,= 6.8 Hz, H-18), 1.25～1.39 (14H, m, H-4～7, 15～17), 1.65 (2H, m, H-3), 2.05 (4H, dd,= 13.6, 6.8 Hz, H-8, 14), 2.35 (2H, t,= 7.6 Hz, H-2), 2.77 (2H, t,= 6.8 Hz, H-11), 5.35 (4H, m, H-9, 10, 12, 13)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 14.2 (C-18), 22.7 (C-17), 24.8 (C-3), 25.8 (C-11), 27.3 (C-6), 27.3 (C-14), 29.2 (C-5), 29.2 (C-6), 29.3 (C-4), 29.5 (C-15), 29.7 (C-7), 31.7 (C-16), 34.2 (C-2), 128.0 (C-12), 128.2 (C-10), 130.1 (C-9), 130.3 (C-13), 180.7 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[18]，故鑒定化合物7為linoleic acid。

化合物8：無色油狀物。HR-ESI-MS/: 355.284 3 [M＋H]+（理論值355.284 3），確定分子式為C21H38O4，計算不飽和度為3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 0.88 (3H, t,= 6.8 Hz, H-18), 1.26～1.36 (14H, m, H-4～7, 15～17), 1.62 (2H, m, H-3), 2.04 (4H, dd,= 13.6, 6.8 Hz, H-8, 14), 2.34 (2H, t,= 7.6 Hz, H-2), 2.76 (2H, t,= 6.4 Hz, H-11), 3.59 (1H, dd,= 11.6, 6.0 Hz, H-3′b), 3.69 (1H, dd,= 11.6, 4.0 Hz, H-3′a), 3.91 (1H, m, H-2′), 4.11～4.20 (2H, m, H-1′), 5.28～5.41 (4H, m, H-9, 10, 12, 13)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 14.2 (C-18), 22.7 (C-17), 25.0 (C-3), 25.7 (C-11), 27.3 (C-8), 27.3 (C-14), 29.2 (C-6), 29.3 (C-5), 29.5 (C-4), 29.7 (C-15), 31.6 (C-16), 34.3 (C-2), 63.4 (C-3′), 65.3 (C-1′), 70.4 (C-2′), 128.0 (C-10), 128.2 (C-12), 130.1 (C-9), 130.4 (C-13), 174.5 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)基本一致[19]，故鑒定化合物8為1-- (9,12-octadecadienoyl) glycerol。

化合物9：無色針狀結(jié)晶（甲醇）。ESI-MS/: 123.1 [M＋H]+（理論值123.1），分子式C6H6N2O。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.55 (1H, ddd,= 8.0, 4.8, 0.8 Hz, H-5), 8.29 (1H, dt,= 8.0, 2.0 Hz, H-4), 8.69 (1H, dd,= 4.8, 1.6 Hz, H-6), 9.02 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 125.1 (C-5), 131.4 (C-3), 137.4 (C-4), 149.5 (C-2), 152.8 (C-6), 169.8 (C＝O)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)基本一致[20]，故鑒定化合物9為煙酰胺。

化合物10：白色固體粉末。ESI-MS/: 268.1 [M＋H]+（理論值268.1），分子式C10H13N5O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 3.61 (2H, m, H-5′), 3.96 (1H, m, H-4′), 4.14 (1H, m, H-3′), 4.59 (1H, m, H-2′), 5.88 (1H, d,= 6.0 Hz, H-1′), 8.14 (1H, s, H-2), 8.36 (1H, s, H-8)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 61.7 (C-5′), 70.6 (C-3′), 73.5 (C-2′), 85.9 (C-4′), 88.0 (C-1′), 119.3 (C-5), 140.0 (C-8), 149.1 (C-4), 152.4 (C-2), 156.1 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)基本一致[21]，故鑒定化合物10為β-adenosine。

化合物11：淡黃色油狀物。ESI-MS/: 195.1 [M＋H]+（理論值195.1），分子式C10H10O4。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 3.92 (6H, s, -OCH3), 7.55 (2H, dd,= 6.0, 3.6 Hz, H-3, 4), 7.73 (2H, dd,= 6.0, 3.6 Hz, H-2, 5)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 52.8 (-OCH3), 129.0 (C-3, 6), 131.3 (C-4, 5), 132.0 (C-1, 2), 168.2 (C＝O)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)基本一致[22]，故鑒定化合物11為dimethyl phthalate。

4 體外抗結(jié)核桿菌活性

采用微量肉湯二倍稀釋法考察貓爪草醇提物石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取部位，以及所有化合物對BCG的抑制活性。試驗菌株BCG培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用培養(yǎng)物和培養(yǎng)基稀釋成菌懸液供檢測用。試驗在96孔平底細胞培養(yǎng)板中進行，設(shè)置空白、陽性對照、陰性對照和給藥組，各萃取部位、單體化合物和陽性對照藥平行檢測3次。加200 μL無菌蒸餾水到微板的外圍孔中，于第2列孔中加200 μL Middlebrook 7H9肉湯，繼續(xù)向第2列孔中注入2 μL各化合物溶液、陽性藥物（利福平、異煙肼、乙胺丁醇）、陰性對照物（DMSO），剩余孔中都增補100 μL Middlebrook 7H9肉湯，留1行作空白對照，不加任何物質(zhì)只加培養(yǎng)基，對每列進行系列二倍稀釋，100 μL菌懸液加到所有檢測孔中。被檢測化合物溶液的最終質(zhì)量濃度200～0.78 μg/mL，陽性藥物質(zhì)量濃度50～0.1 μg/mL。平板套上封閉的塑料袋在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育7～9 d，而后觀察濁度。無混濁現(xiàn)象的最低濃度定義為MIC。

體外抗結(jié)核桿菌活性實驗結(jié)果顯示貓爪草醇提物石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取部位對牛型分枝桿菌BCG有不同程度的抑制活性，其MIC分別為200、100和200 μg/mL；化合物1、2、4～8和10對牛型分枝桿菌BCG有較弱抑制活性，其MIC均為100 μg/mL；陽性對照藥利福平、異煙肼和乙胺丁醇的MIC分別為0.2、0.4、12.5 μg/mL。

5 討論

貓爪草有機酸部位是其抗結(jié)核有效部位之一，且貓爪草中有機酸的含量較高，其中長鏈脂肪酸占大多數(shù)[23-25]。本研究從貓爪草中分離鑒定了11個化合物，包括1個呋喃倍半萜、5個長鏈有機酸類化合物、2個鄰苯二甲酸酯、2個生物堿和1個非長鏈有機酸，其中化合物1為新的呋喃倍半萜，將其命名為貓爪草呋喃倍半萜A；化合物4、8～11均為首次從貓爪草中分離得到。

人型分枝桿菌H37Rv、H37Ra和牛型分枝桿菌BCG被廣泛用作研究結(jié)核致病性機制的參比菌株[26]。本研究從貓爪草中分離鑒定的5個長鏈有機酸類化合物（化合物2、5～8）和1個非長鏈有機酸（化合物4）對牛型分枝桿菌BCG具有較弱抑制活性，其MIC均為100 μg/mL[27]?；衔?為棕櫚酸的衍生物，化合物5～8為亞油酸或其衍生物，據(jù)報道，亞油酸和棕櫚酸對結(jié)核分枝桿菌H37Rv及3種多藥耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株的MIC分別為50～100 μg/mL和25～50 μg/mL[28-29]，化合物2、5～8對結(jié)核分枝桿菌H37Rv以及耐藥結(jié)核分支桿菌是否具有抑制活性，其抗菌作用機制如何均有待進一步研究。

本研究成果豐富了貓爪草的化學(xué)成分多樣性，為貓爪草中抗結(jié)核桿菌活性先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了實驗依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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A new furanosesquiterpenoid from

ZHANG Lu-dan1, LONG Yu-jiao1, WANG Rui-feng1, CAO Ya-nan1, FAN Xiao-yong2, ZOU Kun1, WANG Hui1

1. Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development, College of Biological and Pharmaceutical Sciences, China Three Gorges University, Yichang 443002, China 2. Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, Shanghai 201508, China

To investigate the chemical constituents from Maozhaocao() and their activities against.Various chromatographic techniques, including silica gel column chromatography, macroporous resin column chromatography, TLC and HPLC, were used to separate and purify the ethanol extracts from. The structures of isolates were elucidated by physicochemical properties and spectral analyses. The activity of all compounds againstwas tested by microbroth double dilution method.Eleven compounds were isolated fromand identified as (5)-5-(5-(furan-3-yl)-2-methyl-5-oxopentyl)-3-methylfuran-2(5)-one (1), ethyl palmitate (2), dibutyl phthalate (3),-4-hydroxy-2-nonenoic acid (4), methyl linoleate (5), ethyl linoleate (6), linoleic acid (7), 1--(9,12-octadecadienoyl) glycerol (8), niacinamide (9), β-adenosine (10), dimethyl phthalate (11), respectively. Compounds 1, 2, 4—8 and 10 had mild inhibitory activities againstBCG, all with a minimum inhibitory concentration (MIC) value of 100 μg/mL, respectively.Compound 1 is a new furanosesquiterpenoid, named ranunculifuran A. Compounds 4, 8—11 were isolated fromfor the first time. Compounds 1, 2, 4—8 and 10 had mild inhibitory activities againstBCG.

; ranunculifuran A;; niacinamide;-4-hydroxy-2-nonenoic acid; β-adenosine

R284.1

A

0253 - 2670(2023)14 - 4413 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.001

2023-04-15

國家自然科學(xué)基金資助項目（22207063）；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計劃（D20015）；湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（Q20161207）；天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室（三峽大學(xué)）開放基金（2022NPRD07）

張露丹，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail: zhangld27@126.com

王 慧，博士，副教授，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail: alice0507@yeah.net

[責(zé)任編輯 王文倩]