顏淑慧，孟慶俊*，許 瑞，李晟楠，王立艷，焦 揚(yáng)，宋 超

1. 中國(guó)礦業(yè)大學(xué)環(huán)境與測(cè)繪學(xué)院，江蘇 徐州 221116

2. 扎賚諾爾煤業(yè)有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 滿洲里 021400

農(nóng)業(yè)廢棄秸稈和牛羊糞是目前常用的生物質(zhì)肥料[1]，廣泛應(yīng)用于土壤有機(jī)質(zhì)含量的提升. 這些生物材料含有大量的纖維素，自然條件下降解時(shí)間長(zhǎng)、難度高，不利于快速提升土壤肥力[2]；而且在北方高寒地區(qū)低溫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，造成堆肥反應(yīng)啟動(dòng)困難、堆肥周期長(zhǎng)、效率低[3]，纖維素類物質(zhì)未能得到及時(shí)有效的利用，導(dǎo)致病蟲害加劇，影響下一年作物生長(zhǎng)，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重弊端.

目前對(duì)纖維素類物質(zhì)的處理方法主要有物理、化學(xué)和生物降解法[2]. 微生物作為驅(qū)動(dòng)秸稈等生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的內(nèi)在動(dòng)力，通過能夠產(chǎn)生纖維素降解酶的細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物對(duì)纖維素類物質(zhì)進(jìn)行降解，同時(shí)具有溫和、污染小、成本低和環(huán)境友好的特點(diǎn)[4]，因而微生物降解技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用前景. 許多學(xué)者通過分離、純化篩選出單株纖維素降解菌. 例如：Khosravi等[5]從土壤和樹葉樣本中分離、純化出一株纖維素降解細(xì)菌，屬于短芽孢桿菌；李子婧等[6]從竹屑、枯枝爛葉、羊糞等廢棄物中篩選出一株高效纖維素降解真菌，菌種鑒定為長(zhǎng)枝木霉菌. 分離、純化所得的單菌株雖具有高效的纖維素降解能力，但是分泌的纖維素降解酶種類和產(chǎn)酶量有限，故單菌株的篩選僅為纖維素類物質(zhì)資源化利用提供了良好的菌種資源[7]. 纖維素類物質(zhì)的降解往往需要多種微生物共同協(xié)作完成. 因此，篩選低溫條件下高效降解纖維素復(fù)合菌系的研究和應(yīng)用已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn). 隨著對(duì)纖維素降解菌研究的不斷深入，如何使實(shí)驗(yàn)室理論研究更加貼合實(shí)際生產(chǎn)，從而走向生產(chǎn)開發(fā)實(shí)踐是當(dāng)前研究的難點(diǎn)[8].

從自然環(huán)境中直接篩選或者組配高效纖維素降解復(fù)合菌群是目前提高纖維素類物質(zhì)降解效率的有效途徑之一. 如黃青盈等[2]從食堂餐廚垃圾、廢水及被廢水污染的土壤中篩選出11株具有秸稈降解能力的菌株，經(jīng)過7 d的發(fā)酵降解，單一菌株最高秸稈降解率為21.64%，多種菌株混合處理秸稈的降解率可達(dá)23.86%. 張?chǎng)蔚萚9]從多年秸稈還田土壤、牛羊糞、森林腐殖質(zhì)中以玉米秸稈為碳源通過富集和溫度梯度馴化獲得的3個(gè)玉米秸稈低溫高效降解復(fù)合菌系，15 ℃培養(yǎng)20 d后玉米秸稈降解率分別為35.33%、33.34%和31.33%. 通過長(zhǎng)期的限制性繼代培養(yǎng)達(dá)到富集具有降解纖維素能力的微生物菌群，相對(duì)于以羧甲基纖維素鈉為底物而言，直接以玉米秸稈作為唯一碳源進(jìn)行富集培養(yǎng)，能更真實(shí)地模擬纖維素類物質(zhì)的降解情況，更可靠地鑒定纖維素降解菌系的作用效果. 通過溫度梯度馴化培養(yǎng)技術(shù)，使微生物對(duì)溫度這一環(huán)境因子的耐受范圍做出調(diào)整，逐漸產(chǎn)生一個(gè)新的最適生存范圍[10]. 因此，該文以5 ℃作為溫度梯度對(duì)適應(yīng)培養(yǎng)基條件的微生物進(jìn)行多層次遞進(jìn)式篩選，使適應(yīng)培養(yǎng)基條件的微生物盡可能多地在低溫條件下生存，通過多種微生物之間協(xié)作共同提高降解纖維素類物質(zhì)的能力.

目前通過技術(shù)手段篩選馴化出的低溫纖維素降解菌既有嗜冷菌(Psychrophiles)又有耐冷菌(Psychrotrophys)，最適生長(zhǎng)溫度為10～25 ℃[11]. 一般情況下秸稈還田時(shí)間為10—11月或6—7月，北方高寒地區(qū)夏季平均溫度15 ℃. 該文基于已有研究，以北方高寒草原地區(qū)礦區(qū)土壤中的土著微生物以及對(duì)纖維素具有較好降解作用的枯草芽孢桿菌[12]、細(xì)黃鏈霉菌[13]、哈茨木霉菌[14]作為菌源材料，以玉米秸稈作為碳源進(jìn)行富集培養(yǎng)和溫度梯度馴化，篩選出耐15 ℃低溫條件下高效降解纖維素的復(fù)合菌系，旨在提高纖維素類物質(zhì)利用效率，保護(hù)農(nóng)田耕地質(zhì)量，助力農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌源與秸稈樣品

枯草芽孢桿菌、細(xì)黃鏈霉菌、哈茨木霉菌購(gòu)于山東綠隴生物科技有限公司，另取內(nèi)蒙古草原地區(qū)礦區(qū)土壤作為土著微生物菌源.

該文以玉米秸稈中的纖維素類物質(zhì)作為纖維素降解菌的限制性碳源和降解對(duì)象，挑選粗細(xì)、大小適中的玉米秸稈，用流水沖洗干凈，在65 ℃的烘箱中烘至恒質(zhì)量，烘干后的玉米秸稈再剪成2～3 cm的小段，滅菌備用.

1.1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基(赫奇遜培養(yǎng)基)[15]：KH2PO41.0 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaNO32.5 g、CaCl20.1 g、FeCl30.01 g、蒸餾水1 000 mL.

產(chǎn)酶培養(yǎng)基[9]：蛋白胨0.5 g、(NH4)2SO42 g、K2HPO41 g、尿素0.6 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、MnSO4·7H2O 0.016 g、ZnSO4·7H2O 0.017 g、CaCl20.02 g、NaCl 0.2 g、蒸餾水1 000 mL.

各培養(yǎng)基皆于250 mL錐形瓶中加入90 mL培養(yǎng)液和1.0 g玉米秸稈，121 ℃滅菌20 min，備用.

1.2 試驗(yàn)方案

1.2.1 復(fù)合菌系的來源與馴化

1.2.1.1 菌源富集培養(yǎng)

將礦區(qū)土壤、3種纖維素降解菌劑、礦區(qū)土壤添加3種纖維素降解菌劑依次作為SL、MM、MS處理組，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù). 取各處理組10 g于90 mL蒸餾水中振蕩15 min[16]，記為菌源SL0、MM0、MS0. 靜置10 min后，各取10 mL懸濁液分別接種于90 mL的赫奇遜培養(yǎng)基中，于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 當(dāng)秸稈出現(xiàn)腐解現(xiàn)象(7 d)時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)接，如此轉(zhuǎn)接2次[9]. 通過富集培養(yǎng)獲得具有纖維素降解能力的微生物.

1.2.1.2 溫度梯度馴化

取上述富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液各10 mL分別接種于90 mL赫奇遜培養(yǎng)基中，于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 當(dāng)秸稈降解表現(xiàn)穩(wěn)定時(shí)(15 d)進(jìn)行轉(zhuǎn)接，每轉(zhuǎn)接一次溫度降低5 ℃，同時(shí)取出玉米秸稈測(cè)其降解率，直至降至15 ℃[9]. 15℃下培養(yǎng)至第15、30天分別測(cè)定玉米秸稈降解率，即為經(jīng)過富集培養(yǎng)和溫度梯度馴化過程所得的馴化后玉米秸稈的降解率. SL、MM、MS處理組通過溫度梯度馴化獲得耐15 ℃低溫的纖維素降解復(fù)合菌系，分別記為SL15、MM15、MS15.

取各菌源SL0、MM0、MS0懸濁液10 mL分別接種于90 mL赫奇遜培養(yǎng)基中，15 ℃下培養(yǎng)，15 d后測(cè)定玉米秸稈的降解率，即為未經(jīng)富集培養(yǎng)和溫度梯度馴化過程所得的未馴化時(shí)玉米秸稈降解率. 通過比較馴化篩選前后玉米秸稈中纖維素類物質(zhì)的降解率，闡明經(jīng)馴化篩選獲得的復(fù)合菌系在低溫條件下的纖維素降解能力.

1.2.2 粗酶液制備

取SL15、MM15、MS15培養(yǎng)液各10 mL分別接種于90 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于15 ℃下培養(yǎng)，在第3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天時(shí)取各復(fù)合菌系發(fā)酵液2 mL，于4 ℃、5 000 r/min下離心10 min，上清液即為粗酶液，用于酶活性的測(cè)定[17].

1.2.3 微生物組成多樣性分析

取菌源SL0、MM0、MS0以及馴化篩選獲得的復(fù)合菌系SL15、MM15、MS15各5 mL，4 ℃、5 000 r/min下離心10 min，棄上清液，取沉淀，反復(fù)多次確保已完全沉淀，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序，細(xì)菌PCR引物為338F(5'-ACTCCTACGG GAGGCAGCAG-3')、806R(5'-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3')，真菌PCR引物為ITS1(5'-CTTG GTCATTTAGAGGAAGTAA-3')、ITS2(5'-GCTG CGTTCTTCATCGATGC-3').

1.3 測(cè)試方法

1.3.1 玉米秸稈降解率的測(cè)定

將玉米秸稈用水洗凈，于65 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，采用式(1)[9]計(jì)算玉米秸稈降解率.

式中：W為玉米秸稈降解率，%；W0為接種前培養(yǎng)基中的玉米秸稈質(zhì)量，g；W1為培養(yǎng)結(jié)束烘干后降解剩余的玉米秸稈質(zhì)量，g.

1.3.2 酶活性的測(cè)定

1.3.2.1 濾紙酶活性測(cè)定

取粗酶液0.2 mL置于25 mL具塞刻度試管中，加入pH=4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液1.8 mL，以1 cm×6 cm的濾紙條作為酶解底物，50 ℃下水浴60 min. 加入3,5二硝基水楊酸(DNS)試劑3 mL，在沸水浴10 min后可與還原糖反應(yīng)生成棕紅色物質(zhì)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺成一定的比例關(guān)系.冷水沖試管，使反應(yīng)液迅速冷卻至室溫，定容至25 mL，于540 nm處測(cè)定吸光值. 酶活性空白對(duì)照組將粗酶液在100 ℃下進(jìn)行煮沸處理，使其失活后進(jìn)行濾紙酶活性測(cè)定[18].

1.3.2.2 內(nèi)切酶活性測(cè)定

取粗酶液0.2 mL置于25 mL具塞刻度試管中，加入羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)緩沖液1.8 mL，50 ℃下水浴30 min后，加入DNS顯色液3 mL以終止反應(yīng). 沸水浴10 min后，冷水沖試管，使反應(yīng)液迅速冷卻至室溫，定容至25 mL，于540 nm處測(cè)定吸光值[2].酶活性空白對(duì)照組處理同1.3.2.1節(jié).

酶活性單位(U/mL)定義為1 mL粗酶液在1 min內(nèi)催化底物水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量[2].

酶活性計(jì)算公式[18]：

式中：X為酶活性，U/mL；m為反應(yīng)過程中產(chǎn)生葡萄糖的含量，mg/mL；n為粗酶液稀釋倍數(shù)；V為反應(yīng)體系中粗酶液的體積，mL；T為反應(yīng)時(shí)間，min.

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值，采用Excel 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；采用Origin 2019b軟件進(jìn)行制圖；運(yùn)用SPSS 27.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)合鄧肯(Duncan)氏法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)；采用美吉生物云平臺(tái)(https://cloud.majorbio.com)進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 耐低溫纖維素降解復(fù)合菌系的篩選

由圖1可見，在溫度梯度馴化過程中各處理組從25 ℃降到15 ℃過程中玉米秸稈中纖維素類物質(zhì)降解率趨于平穩(wěn)，低溫(15 ℃)條件下馴化后復(fù)合菌系的纖維素類物質(zhì)降解效果能夠達(dá)到高溫(35 ℃)狀態(tài)下的降解效果.

圖1 不同溫度下各處理組玉米秸稈的降解率Fig.1 Degradation rate of maize straw in different treatment groups under different temperature

從圖2可以看出，在15 ℃下，未馴化的SL處理組對(duì)纖維素類物質(zhì)的降解率僅為10.54%，說明土壤中存在的耐15 ℃纖維素降解菌數(shù)量較少，自然條件下對(duì)玉米秸稈中纖維素類物質(zhì)的降解能力較低. 含有纖維素降解菌劑的MM和MS處理組在未經(jīng)馴化時(shí)對(duì)纖維素類物質(zhì)的降解率僅分別為16.60%、17.42%.各處理組經(jīng)馴化篩選后纖維素類物質(zhì)降解率皆顯著高于未馴化時(shí)的降解率. 由此可見，溫度梯度馴化對(duì)于低溫條件下纖維素類物質(zhì)的降解具有重要意義，獲得的復(fù)合菌系大大提高了纖維素類物質(zhì)的降解率.

圖2 15 ℃時(shí)不同處理?xiàng)l件下各處理組玉米秸稈降解率Fig.2 Degradation rate of maize straw in different treatment groups at 15 ℃

結(jié)合圖1和圖2分析發(fā)現(xiàn)，以土著微生物添加纖維素降解菌劑進(jìn)行生物加強(qiáng)的MS處理組經(jīng)篩選后具有最高的降解能力，說明將具有特定功能的微生物菌劑添加到土著微生物中，在增強(qiáng)纖維素降解能力的同時(shí)還可以活化土著微生物的降解能力[19]，因此其纖維素降解能力顯著高于土著微生物和纖維素降解菌劑的單獨(dú)作用. 同時(shí)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，降解率逐漸增加，說明復(fù)合菌系內(nèi)纖維素降解酶持續(xù)發(fā)揮作用，具有長(zhǎng)期高效降解纖維素類物質(zhì)的能力. 馴化篩選后的SL、MM和MS處理組培養(yǎng)至第15天時(shí)，纖維素類物質(zhì)降解率分別為22.33%、26.33%和29.23%. 經(jīng)過馴化篩選得到的3種耐低溫纖維素降解菌與目前相關(guān)報(bào)道[2,9]的纖維素降解菌的降解能力相近，因此其具有一定的應(yīng)用前景.

2.2 溫度梯度馴化后復(fù)合菌系酶活性動(dòng)態(tài)分析

根據(jù)纖維素酶的結(jié)構(gòu)特性和各組分功能將其分為3類，分別為外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，其協(xié)同作用可以將纖維素分解成葡萄糖等單糖[21]. 內(nèi)切葡聚糖酶通常用來表征纖維素樣品的糖化能力，是纖維素降解過程中的酶活性[2]. 濾紙酶活性能夠較真實(shí)地反映天然纖維素的情況[22]，以及3類纖維素酶組分協(xié)同水解纖維素的能力[23]. 故該文以濾紙酶活性、內(nèi)切酶活性來表征復(fù)合菌系的纖維素降解能力.

2.2.1 溫度梯度馴化后復(fù)合菌系濾紙酶活性特征

經(jīng)溫度梯度馴化后獲得的纖維素降解復(fù)合菌系SL15、MM15、MS15的濾紙酶活性結(jié)果如圖3所示. 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)合菌系濾紙酶活性普遍先升高后緩慢降低. 自第15天后，濾紙酶活性基本達(dá)到峰值并保持穩(wěn)定，此時(shí)復(fù)合菌系對(duì)纖維素的降解開始穩(wěn)定. 因此在溫度梯度馴化過程中，在第15天可以觀察到培養(yǎng)基顏色變深、玉米秸稈發(fā)生軟化、出現(xiàn)碎屑狀，進(jìn)而進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng). 發(fā)酵培養(yǎng)后期由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足導(dǎo)致部分微生物機(jī)體降低或停止細(xì)胞物質(zhì)合成，生化反應(yīng)能力降低，因此濾紙酶活性略有下降. 在發(fā)酵培養(yǎng)前期(0～9 d)，復(fù)合菌系SL15和MS15的酶活性較MM15增長(zhǎng)緩慢，推測(cè)原因可能為SL15和MS15中包含土壤中某些不具有纖維素降解能力的微生物，只是適應(yīng)篩選培養(yǎng)基的條件而被保留，在發(fā)酵培養(yǎng)前期要適應(yīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件，因此酶活性增長(zhǎng)較為緩慢.

圖3 復(fù)合菌系濾紙酶活性動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic change of filter paper enzyme activity of complex bacteria

復(fù)合菌系SL15、MM15和MS15的濾紙酶活性最高分別為4.031 2、4.459 1和4.692 5 U/mL. 在發(fā)酵培養(yǎng)后期MS15濾紙酶活性顯著高于SL15、MM15，說明在土著微生物中加入微生物菌劑會(huì)加速纖維素類物質(zhì)的降解，更快達(dá)到腐熟的條件，縮短堆肥發(fā)酵進(jìn)程[24].

2.2.2 溫度梯度馴化后復(fù)合菌系內(nèi)切酶活性特征

各復(fù)合菌系內(nèi)切酶活性如圖4所示. 在發(fā)酵產(chǎn)酶的30 d內(nèi)各復(fù)合菌系內(nèi)切酶活性變化規(guī)律一致，酶活性在(1.908 9±0.317 8) U/mL范圍內(nèi)波動(dòng). 各復(fù)合菌系SL15、MM15和MS15內(nèi)切酶活性在第18天達(dá)到峰值，分別為2.019 1、2.109 9和2.226 7 U/mL，MS15內(nèi)切酶活性顯著高于SL15、MM15. 在植物組織中，木質(zhì)素、纖維素和半纖維素以共價(jià)鍵形式結(jié)合，將纖維素分子包裹于其中形成堅(jiān)固的天然壁壘，一般微生物難以進(jìn)入其中分解纖維素[25]. 在降解前期木質(zhì)素降解微生物發(fā)揮作用，破壞了纖維素分子的天然壁壘，使纖維素降解微生物進(jìn)一步發(fā)揮作用，因此降解過程中內(nèi)切酶活性于第18天出現(xiàn)峰值.

圖4 復(fù)合菌系內(nèi)切酶活性動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of endoglucanase activity of complex bacteria

微生物體內(nèi)的生化反應(yīng)能夠在低溫下高效進(jìn)行是微生物能夠在低溫生存的前提. 隨著發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)生波動(dòng)的酶活性表明，在15 ℃下，經(jīng)富集和溫度梯度馴化后的復(fù)合菌系中微生物仍然能夠發(fā)揮正常的生化作用，參與纖維素降解的酶仍具有高效的酶活性，生產(chǎn)和保存適當(dāng)?shù)男玛惔x產(chǎn)物[26].

2.3 微生物群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成差異性分析

通過玉米秸稈中纖維素類物質(zhì)的降解率以及濾紙酶活性、內(nèi)切酶活性的變化可知，篩選所得的耐低溫降解復(fù)合菌系具有較強(qiáng)的纖維素降解能力. 為了進(jìn)一步明確各復(fù)合菌系的優(yōu)勢(shì)菌種和復(fù)合菌系相對(duì)于菌源微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，表明富集培養(yǎng)和溫度梯度馴化對(duì)菌源微生物的影響，需對(duì)菌源SL0、MM0、MS0和復(fù)合菌系SL15、MM15、MS15，進(jìn)行細(xì)菌和真菌微生物群落結(jié)構(gòu)組成多樣性分析.

綠色元素的設(shè)計(jì)主要是根據(jù)現(xiàn)有的自然材料資源、資源的可再生性、材質(zhì)加工的零損耗性、生產(chǎn)以后的零排放污染物、進(jìn)行綜合的構(gòu)想與設(shè)計(jì)。在設(shè)計(jì)中，要滿足人的生理需求與精神需求，同時(shí)還要尊重大自然的承受能力。科學(xué)和藝術(shù)給設(shè)計(jì)一個(gè)結(jié)實(shí)的結(jié)構(gòu)和美感的外形，技術(shù)與人性給設(shè)計(jì)一個(gè)尊重自然的機(jī)會(huì)和充滿和諧的品味空間。將綠色元素充分融合到小型代步工具的設(shè)計(jì)里面，結(jié)合并構(gòu)想，成為自己設(shè)計(jì)里的亮點(diǎn)。

2.3.1 菌源微生物群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成差異性分析

由菌源SL0、MM0、MS0的微生物多樣性分析(見圖5)發(fā)現(xiàn)，在門水平上菌源SL0微生物組成復(fù)雜，主要包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、擬桿菌門(Bacteroidota)以及子囊菌門(Ascomycota)，且放線菌門和子囊菌門為優(yōu)勢(shì)菌. 菌源MM0主要由變形菌門、厚壁菌門(Firmicutes)、子囊菌門組成. 菌源MS0結(jié)合了SL0和MM0的優(yōu)勢(shì)菌，放線菌門相對(duì)豐度明顯增加，而變形菌門的相對(duì)豐度有所減少，且出現(xiàn)了菌源SL0中的少量真菌.

圖5 門分類水平上菌源中細(xì)菌及真菌的群落組成Fig.5 Community composition of bacteria and fungi in the bacterial source at the phylum classification level

進(jìn)一步在屬水平上進(jìn)行Venn圖(見圖6)分析，統(tǒng)計(jì)樣本中所共有的和獨(dú)有的菌屬數(shù)目. 菌源SL0來自土壤，土壤中微生物種類繁多，與菌源MM0、MS0相比微生物多樣性更豐富.

圖6 不同菌源中細(xì)菌及真菌物種Venn圖Fig.6 Venn chart of bacteria and fungi species in different bacterial sources

2.3.2 復(fù)合菌系細(xì)菌微生物群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成差異性分析

基于門分類水平上(others相對(duì)豐度＜1%)的分析(見圖7)表明，各復(fù)合菌系的細(xì)菌群落主要隸屬3個(gè)門，分別為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，與國(guó)內(nèi)外經(jīng)多年研究[27-29]已知的具有纖維素分解功能細(xì)菌門類一致. 其中變形菌門是SL15復(fù)合菌系中最豐富的細(xì)菌類群，相對(duì)豐度為82.57%. 擬桿菌門在菌源MM0、MS0中相對(duì)豐度極小，而經(jīng)過溫度梯度馴化篩選后成為MM15和MS15復(fù)合菌系中最豐富的細(xì)菌類群，相對(duì)豐度分別為48.92%和50.46%，在SL15中為12.02%. 可見擬桿菌門不僅適應(yīng)培養(yǎng)基的條件而且在低溫條件下仍具有較強(qiáng)的纖維素降解能力. 放線菌門在菌源MS0、SL0中作為優(yōu)勢(shì)菌存在，在菌源MM0中也占有一定的比例，而經(jīng)過溫度梯度馴化后各復(fù)合菌系中放線菌門的相對(duì)豐度僅為2%左右，推測(cè)其原因?yàn)榉啪€菌的繁殖速度較細(xì)菌緩慢，降解能力不如真菌，盡管具有較強(qiáng)的抗環(huán)境脅迫能力，但是在有限的營(yíng)養(yǎng)和空間條件下，具有特定纖維素降解能力的細(xì)菌、真菌同樣適應(yīng)培養(yǎng)基條件，因此細(xì)菌、真菌大量繁殖影響了放線菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，抑制了其產(chǎn)酶能力.

圖7 門分類水平上復(fù)合菌系細(xì)菌的群落組成Fig.7 The community composition of complex bacteria at phylum level

復(fù)合菌系在屬水平上(others相對(duì)豐度＜5%)的細(xì)菌微生物群落組成見圖8. MM15細(xì)菌群落組成主要包括金黃桿菌屬(Chryseobacterium，占34.79%)、克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera，占15.48%)和鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium，占13.32%). MS15中優(yōu)勢(shì)菌屬主要有鞘氨醇桿菌屬(占47.75%)和布魯氏菌屬(Brucella，占17.79%). SL15細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中相對(duì)豐度較大的是假單胞菌屬(Pseudomonas，占25.03%)、鞘氨醇桿菌屬(占9.15%)和交替紅色桿菌屬(Altererythrobacter，占8.14%). 鞘氨醇桿菌在3種復(fù)合菌系中皆為優(yōu)勢(shì)菌屬，其原因?yàn)榍拾贝紬U菌營(yíng)養(yǎng)來源比較寬廣，代謝類型復(fù)雜多樣，適應(yīng)能力極強(qiáng)；對(duì)生存環(huán)境溫度沒有太大的需求，能在5～42 ℃的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)[30]，因此能很快適應(yīng)溫度梯度的變化，廣泛分布于復(fù)合菌系中. 鞘氨醇桿菌在復(fù)合菌系MS15中相對(duì)豐度最高，研究[31-32]表明，鞘氨醇桿菌不僅能夠分泌纖維素酶等直接對(duì)纖維素類物質(zhì)進(jìn)行降解，還可以利用乙酸、乳酸等中間產(chǎn)物調(diào)節(jié)發(fā)酵體系酸堿度維持中性水平來協(xié)調(diào)降解秸稈，并具有抵抗極端環(huán)境的能力，故馴化篩選過程中MS處理組玉米秸稈中纖維素類物質(zhì)降解率以及復(fù)合菌系MS15的濾紙酶活性和內(nèi)切酶活性顯著高于其余兩組.

圖8 屬分類水平上復(fù)合菌系細(xì)菌的群落組成Fig.8 The community composition of complex bacteria at genus level

進(jìn)一步在屬水平上進(jìn)行Venn圖(見圖9)分析，發(fā)現(xiàn)有29個(gè)屬為3個(gè)復(fù)合菌系所共有，稱為核心微生物(見圖10)，包括鞘氨醇桿菌屬、金黃桿菌屬、布魯氏菌屬、假單胞菌屬、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)以及無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)等，來自菌源中的變形桿門、厚壁菌門、擬桿菌門. 在各復(fù)合菌系中放線菌門相對(duì)豐度僅為2%左右，可能出現(xiàn)在共有菌屬中或者獨(dú)有菌屬中. 盡管放線菌門相對(duì)豐度低，但在對(duì)其他降解菌株生長(zhǎng)環(huán)境起到的調(diào)節(jié)作用以及與其他菌株存在潛在的協(xié)同作用等方面不容忽視.

圖9 復(fù)合菌系細(xì)菌物種Venn圖Fig.9 Venn chart of complex bacteria

圖10 復(fù)合菌系細(xì)菌共有屬Fig.10 Complex bacteria of bacteria common genus

與菌源相比，經(jīng)篩選后的SL15、MS15復(fù)合菌系中細(xì)菌多樣性有所減少，說明部分微生物在溫度梯度馴化篩選過程中淘汰了與玉米秸稈降解無(wú)關(guān)或不適應(yīng)培養(yǎng)基條件的菌屬，同時(shí)也富集了耐低溫的纖維素降解菌. 經(jīng)馴化篩選后MM15的細(xì)菌菌屬數(shù)量并無(wú)減少，推測(cè)其原因是，所加入的3種菌劑皆為具有纖維素降解能力的菌屬，且存在能夠適應(yīng)低溫條件或者馴化出耐低溫的菌屬，因此篩選前后菌屬數(shù)量保持一致.

2.3.3 復(fù)合菌系真菌微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成差異性分析

復(fù)合菌系SL15、MM15、MS15的真菌群落(見圖11)主要隸屬子囊菌門、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)兩個(gè)門. 與菌源中真菌微生物群落結(jié)構(gòu)組成比較發(fā)現(xiàn)，子囊菌門在復(fù)合菌系SL15、MM15、MS15中仍為優(yōu)勢(shì)菌，分別占真菌群落總數(shù)量的93.81%、96.59%、85.35%.菌源MM0、MS0中相對(duì)豐度極低的擔(dān)子菌門在復(fù)合菌系MM15、MS15中成為優(yōu)勢(shì)菌門，尤其是在復(fù)合菌系MS15中，其相對(duì)豐度達(dá)到14.65%. 擔(dān)子菌門是植物木質(zhì)部細(xì)胞壁成分(纖維素、半纖維素、木質(zhì)素)降解的特有微生物，特別是白腐菌對(duì)降解植物中芳香木質(zhì)素聚合物具有針對(duì)性[33]，進(jìn)而促進(jìn)了纖維素的降解. 這也是馴化篩選過程中MS處理組纖維素類物質(zhì)降解率最高的原因之一. 在菌源SL0中真菌微生物種類較多，在測(cè)序分析中有4.71%的真菌未被鑒定，但由于適應(yīng)環(huán)境條件和培養(yǎng)基條件得以保留，使SL15中擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度降低. 已有研究[34-35]也表明，自然資源中仍然有許多未被發(fā)現(xiàn)的微生物，可能具有重要的生物學(xué)功能.

圖11 門分類水平上復(fù)合菌系真菌的群落組成Fig.11 The community composition of complex fungus at phylum level

復(fù)合菌系在屬水平上的細(xì)菌微生物群落組成如圖12所示. 結(jié)果顯示，SL15組真菌微生物群落多樣性同樣強(qiáng)于MM15及MS15組，3組樣品中出現(xiàn)的unclassified_f_Nectriaceae、unclassified_o_Hypocreales、unclassified_c_Sordariomycetes為復(fù)合菌系的優(yōu)勢(shì)菌屬，分析可能是一些現(xiàn)階段未被發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)纖維素酶的新菌株.

圖12 屬分類水平上復(fù)合菌系真菌的群落組成Fig.12 The community composition of complex fungus at genus level

SL15、MM15和MS15真菌菌屬的數(shù)量(見圖13)相對(duì)較少且相差不大. 其中有5個(gè)真菌菌屬為3個(gè)菌系所共有，如圖14所示，共有屬包括g_unclassified_f_Nectriaceae(占44.89%)、g_unclassified_c_Sordariomycetes(占44.80%)、g_Apiotrichum(占6.20%)和g_unclassified_o_Hypocreales(占3.90%). 與菌源相比，3組復(fù)合菌系真菌多樣性明顯降低，除篩選過程淘汰掉與秸稈降解無(wú)關(guān)的部分菌屬外，真菌菌屬可能對(duì)溫度較為敏感，不易馴化出耐低溫的纖維素降解菌.

圖13 復(fù)合菌系真菌物種Venn圖Fig.13 Venn chart of complex fungus

圖14 復(fù)合菌系真菌共有屬Fig.14 Complex bacteria of fungi common genus

2.3.4 復(fù)合菌系優(yōu)勢(shì)菌群生態(tài)功能分析

變形菌門和厚壁菌門是纖維素降解菌群的主要門類，二者在纖維素降解的前、中、后期以此消彼長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化協(xié)同降解纖維素. 擬桿菌門對(duì)碳水化合物具有較好的降解能力[36]，能夠分解蛋白胨或葡萄糖，產(chǎn)生琥珀酸、乙酸、甲酸、乳酸和丙酸等秸稈中間代謝產(chǎn)物，具有降解纖維素的能力[37]，在前期和中期參與纖維素的降解[28]. 變形菌門中的無(wú)色桿菌屬和厚壁菌門中的類芽孢桿菌屬通過分泌葡萄糖苷酶、水解酶、過氧化氫酶等消耗中間代謝產(chǎn)物(如纖維二糖、木糖、醛糖)，促進(jìn)纖維素的持續(xù)降解[32]；變形菌門中的變形桿菌屬以及金黃桿菌屬中的大部分細(xì)菌均能夠產(chǎn)生較強(qiáng)活性金屬蛋白酶[38]，其對(duì)于農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥的有機(jī)物降解具有一定的作用.

與細(xì)菌相比，真菌的類群及數(shù)量相對(duì)較少，但真菌在土壤微環(huán)境中的作用十分重要. 木質(zhì)素降解也是能否有效利用纖維素的關(guān)鍵. 對(duì)木質(zhì)纖維素降解作用最為明顯的是真菌，從門水平來看，真菌群落微生物中的優(yōu)勢(shì)菌屬為子囊菌門. 研究[39]表明，子囊菌門在真菌群落中存在數(shù)量最多，大多數(shù)為腐生菌，含有纖維素和木質(zhì)素分解酶，可以將養(yǎng)分有效地分解為易吸收物質(zhì). 擔(dān)子菌門的真菌是少數(shù)具有降解木質(zhì)素所需的木質(zhì)纖維素分解酶的微生物[33].

細(xì)菌中的放線菌門對(duì)木質(zhì)纖維素也具有較好的降解作用，它們對(duì)木質(zhì)素的降解主要表現(xiàn)在初級(jí)代謝階段，在一定程度上使木質(zhì)素結(jié)構(gòu)改性，增加水溶性，從而提高對(duì)纖維素的降解[40]. 綜上，有些菌屬與纖維素降解沒有直接關(guān)系，只是因?yàn)檫m應(yīng)篩選的培養(yǎng)基而得以保留，或通過與纖維素降解菌之間發(fā)生協(xié)同作用，使得復(fù)合菌系能夠穩(wěn)定存在并且高效降解[29]. 添加外源纖維素降解菌劑不僅直接參與纖維素的降解，而且刺激了微生物群落的潛在功能和相互作用[41]，對(duì)于降解纖維素復(fù)合菌系的構(gòu)建也是十分重要的.

3 結(jié)論

a) 通過馴化篩選獲得了3個(gè)在低溫(15 ℃)條件下穩(wěn)定降解玉米秸稈中纖維素類物質(zhì)的復(fù)合菌系SL15(以礦區(qū)土壤為菌源)、MM15(以纖維素降解菌劑為菌源)和MS15(以礦區(qū)土壤添加纖維素降解菌劑為菌源)，15 ℃下降解率分別為22.33%、26.33%和29.23%，其中復(fù)合菌系MS15的濾紙酶活性、內(nèi)切酶活性最高分別可達(dá)4.692 5、2.226 7 U/mL.

b) 添加外源纖維素降解菌劑會(huì)對(duì)土著微生物形成協(xié)同增效，顯著增強(qiáng)分泌纖維素酶的能力，提高降解纖維素類物質(zhì)的能力.

c) 變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、子囊菌門和擔(dān)子菌門為各復(fù)合菌系的優(yōu)勢(shì)菌門，鞘氨醇桿菌屬、金黃桿菌屬、布魯氏菌屬等能夠協(xié)同降解纖維素類物質(zhì). 復(fù)合菌系MS15中鞘氨醇桿菌屬及擔(dān)子菌門中菌屬的大量存在顯著促進(jìn)了玉米秸稈中纖維素類物質(zhì)的降解率.