宋佳宇，李昀照，李興春，李丹丹，王慶宏，史 權(quán)，陳春茂

1. 中國(guó)石油大學(xué)（北京）化學(xué)工程與環(huán)境學(xué)院，重質(zhì)油全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，油氣污染防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102249

2. 中國(guó)石油集團(tuán)安全環(huán)保技術(shù)研究院有限公司，石油石化污染物控制與處理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

全球氣候變化制約著人類(lèi)社會(huì)發(fā)展，如何轉(zhuǎn)化、利用與封存大氣中CO2已成為當(dāng)今社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn).土壤碳儲(chǔ)量超過(guò)全球陸地碳儲(chǔ)量的80%(約為2 300 Pg)，是陸地生態(tài)系統(tǒng)最大的碳庫(kù)，其碳收支的微小變化會(huì)顯著影響大氣CO2濃度[1-2]. 增加土壤碳儲(chǔ)量是經(jīng)濟(jì)可行和環(huán)境友好的固碳途徑之一，也是減緩全球氣候變化的重要舉措.

傳統(tǒng)的土壤有機(jī)質(zhì)形成理論認(rèn)為，植物來(lái)源的有機(jī)碳是土壤有機(jī)碳形成與穩(wěn)定的主要貢獻(xiàn)者[3]. 據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年植被捕獲的CO2約為570×108t[4]，通過(guò)植物固碳是實(shí)現(xiàn)土壤碳封存的關(guān)鍵. 2017年，Liang等[5]提出土壤微生物碳泵(microbial carbon pump，MCP)的概念，該概念強(qiáng)調(diào)土壤微生物同化合成作用對(duì)土壤碳庫(kù)積累有積極作用，微生物殘?bào)w碳作為土壤穩(wěn)定有機(jī)碳庫(kù)的重要組分，對(duì)土壤碳截獲與有機(jī)碳固存意義重大[6-7]. 此外，微生物作為土壤碳循環(huán)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[8]，利用其固定CO2是一種經(jīng)濟(jì)且無(wú)污染的方式，可為提升土壤固碳潛力與減少大氣CO2濃度提供新思路.

固碳微生物根據(jù)營(yíng)養(yǎng)方式不同可分為自養(yǎng)微生物與異養(yǎng)微生物. 自養(yǎng)微生物以CO2為唯一碳源，利用光合作用或化能合成作用將CO2轉(zhuǎn)化為自身細(xì)胞物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)光合CO2固定；異養(yǎng)微生物以有機(jī)碳化合物為碳源，通過(guò)自身代謝過(guò)程中的羧化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)碳固定[9]. 土壤固碳微生物大多為自養(yǎng)微生物，由于其分布廣泛、數(shù)量可觀且環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)而成為目前生物固碳的熱點(diǎn). 近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外針對(duì)固碳微生物的研究，主要集中在海洋[10]、稻田[11]、農(nóng)田[12]、濕地[13]等生境的碳儲(chǔ)量分布與評(píng)估、微生物固碳過(guò)程與固碳機(jī)理、微藻固碳與生物能源技術(shù)等方面，而針對(duì)石油烴等難降解有機(jī)物脅迫下的土壤中是否存在降污固碳微生物類(lèi)群及其互作響應(yīng)關(guān)系的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道.因此，開(kāi)展石油污染土壤降污固碳微生物研究對(duì)土壤有機(jī)碳固存和減緩全球氣候變化具有重要意義.

綜上，本研究以華北某油田石油污染土壤為對(duì)象，開(kāi)展石油烴降解與固碳微生物響應(yīng)關(guān)系分析，明確潛在降污固碳微生物關(guān)鍵屬，闡明石油烴降解與固碳功能基因互作關(guān)系；選用高通量測(cè)序技術(shù)分析石油污染脅迫下土壤微生物降污固碳代謝通路，為探究石油污染土壤微生物降污固碳協(xié)同作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 土壤樣品基礎(chǔ)信息

研究區(qū)域?yàn)槿A北某油田(38°43′00′′N(xiāo)、117°30′00′′E)，該油田勘探始于20世紀(jì)60年代，已進(jìn)入開(kāi)發(fā)中后期. 該區(qū)域?qū)儆诩撅L(fēng)半濕潤(rùn)氣候區(qū)，年均氣溫14.0 ℃，年降水量782.6 mm，土壤pH＞8，屬于弱堿性土壤且多為鹽堿地，土壤類(lèi)型以草甸土和濱海鹽土為主[14-15].

土壤樣品于2022年7月取自該油田開(kāi)發(fā)井場(chǎng)的表層(0～20 cm)土壤. 設(shè)定20 m×20 m的采樣區(qū)，利用五點(diǎn)采樣法等量采集各分點(diǎn)土壤，將各分點(diǎn)土壤混合均勻即為該樣點(diǎn)樣品. 用無(wú)菌鐵鏟鏟取約500 g土樣后裝入無(wú)菌密封袋，共計(jì)采集12個(gè)土壤樣品，去除動(dòng)植物殘?bào)w及礫石后裝入4 ℃冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步處理. 將混勻后樣品平均分為兩份，一份自然風(fēng)干后過(guò)2 mm篩并置于4 ℃冰箱保存，用于土壤理化指標(biāo)及總石油烴測(cè)定；另一份置于—80 ℃超低溫冰箱保存，用于土壤微生物多樣性及宏基因組測(cè)序. 土壤理化指標(biāo)、總石油烴測(cè)試、微生物多樣性及宏基因組測(cè)序前處理試驗(yàn)均在一周內(nèi)完成.

1.2 土壤理化指標(biāo)測(cè)試方法

本研究測(cè)定物理指標(biāo)包括微團(tuán)聚體及土壤含水率2種，化學(xué)指標(biāo)包括pH以及TP(總磷)、TN(總氮)、TOC(總有機(jī)碳)、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量. 每個(gè)樣品取3份作為平行樣品，土壤樣品理化指標(biāo)測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 土壤樣品理化指標(biāo)測(cè)試結(jié)果Table 1 Test results of physical and chemical index analysis of soil samples

1.3 土壤總石油烴測(cè)定方法

土壤總石油烴測(cè)定方法參照《土壤和沉積物 石油烴(C10-C40)的測(cè)定氣相色譜法》(HJ 1021—2019).稱取10.00 g土壤樣品于研缽中，加入適量硅藻土研磨至散粒狀，研磨后樣品利用快速溶劑萃取儀萃取(AES-350型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司)，萃取條件：壓力1 200 psi，萃取溫度100 ℃，靜態(tài)萃取5 min，淋洗體積60%，氮?dú)獯祾?0 s，循環(huán)2次，萃取劑為丙酮-正己烷混合溶劑(色譜純，體積比1∶1)，萃取液經(jīng)100 mL超純水洗滌兩次后保留上層有機(jī)相，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉(優(yōu)級(jí)純)脫水后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1.00 mL(RV 10型，德國(guó)IKA公司)，即得待測(cè)樣品.

選用氣相色譜儀〔7890A型，安捷倫科技(中國(guó))有限公司〕測(cè)定待測(cè)樣品TPH（total petroleum hydrocarbon，總石油烴），檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器，色譜柱采用毛細(xì)管色譜柱〔DB-5MS型，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；柱長(zhǎng)30 mm，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚0.25 μm〕. 儀器條件：進(jìn)樣口溫度300 ℃，檢測(cè)器溫度325 ℃，柱溫320 ℃. 升溫程序：初始50 ℃保持2 min，以40 ℃/min升溫至230 ℃，以20 ℃/min升溫至320 ℃保持20 min；氣體流量分別為99.999%的高純氮?dú)?.5 mL/min、99.99%的高純氫氣30 mL/min和空氣300 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL.

土壤樣品按照總石油烴含量由低到高依次編號(hào)為S1～S12，總石油烴含量見(jiàn)表2.

表2 土壤樣品總石油烴含量Table 2 Total petroleum hydrocarbon content in soil samples

1.4 土壤樣品微生物分子生物學(xué)指標(biāo)測(cè)試方法

1.4.1 土壤樣品DNA提取

根據(jù)DNeasy?96 PowerSoil?Pro QIAcube?HT Kit說(shuō)明書(shū)提取土壤微生物群落總DNA，利用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop2000型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司)和1%的瓊脂糖凝膠測(cè)定DNA濃度和純度.

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用qPCR(Real-time Quantitative PCR, qPCR)測(cè)定樣品中石油烴降解功能基因alkB、PAH-RHDα GN、PAH-RHDα GP及固碳功能基因cbbL、cbbM、aclB、fhs的豐度，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù). qPCR體系包含2×SYBR Green Mix 7.5 μL，正向和反向引物各0.7 μL，模板DNA 1 μL，加無(wú)菌ddH2O至15 μL. 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸35 s，45個(gè)循環(huán). 選擇經(jīng)過(guò)測(cè)序、序列比對(duì)后的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，紫外檢測(cè)儀(NanoDrop ND-1000型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司)檢測(cè)濃度后以10倍梯度稀釋進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制(共6個(gè)梯度，每孔上樣量為2 μL)，梯度拷貝數(shù)數(shù)量級(jí)依次為107、106、105、104、103、102. 擴(kuò)增得到的熔解曲線均為單峰，說(shuō)明引物特異性良好，擴(kuò)增效率為95%～110%，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均大于0.990. 石油烴降解及固碳功能基因引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表3.

表3 石油烴降解及固碳功能基因的引物設(shè)計(jì)Table 3 Primers design of functional genes for petroleum hydrocarbon degradation and carbon fixation

1.4.3 微生物多樣性及宏基因組測(cè)序

微生物多樣性測(cè)序采用引物338F(5'-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3')對(duì)16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增. PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，引物338F和806R各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA溶液0.2 μL，模板DNA 10 ng，加無(wú)菌ddH2O至20 μL. 擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，29個(gè)循環(huán)，72 ℃最終延伸10 min. 采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(美國(guó)Axygen公司)切膠純化回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收后的擴(kuò)增產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè). 選擇Miseq PE300平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行微生物多樣性測(cè)序.

宏基因組測(cè)序利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)土壤DNA，采用非接觸式超聲波破碎儀(M220型，美國(guó)Covaris公司)將DNA片段化，篩選約400 bp片段構(gòu)建宏基因組文庫(kù). 選用NEXTFLEXTM Rapid DNASeq試劑盒(美國(guó)Bioo Scientific公司)建庫(kù)后進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增，即得DNA片段序列. 選擇NovaSeq 6000平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行宏基因組測(cè)序.

微生物多樣性及宏基因組測(cè)序平臺(tái)均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供.

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

采用R 3.3.1完成物種群落組成制圖；采用Cytoscape 3.7.1繪制物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖；采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析；采用Origin 2022軟件繪制功能基因相關(guān)性與代謝通路圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 石油污染脅迫下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)是用于評(píng)價(jià)土壤微生物群落多樣性和豐富度的綜合性指標(biāo). 其中，Shannon-Wiener指數(shù)反映樣品群落多樣性變化情況，該指數(shù)越高，樣品群落多樣性越豐富. Sobs、Ace指數(shù)反映樣品群落豐富程度，其數(shù)值越高，對(duì)應(yīng)樣品物種數(shù)越多. 不同石油污染程度土壤樣品Alpha多樣性變化情況見(jiàn)表4. 由表4可知，所有樣品覆蓋度(Coverage)均在0.98以上，表明所得測(cè)序結(jié)果可以代表土壤樣品微生物群落的實(shí)際情況. Sobs及Ace指數(shù)隨土壤總石油烴含量的增加均呈先減少后增加再降低的趨勢(shì)，表明石油污染脅迫下，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，污染程度相對(duì)嚴(yán)重的土壤樣品微生物豐富度低于污染程度較輕的樣品，此外，總石油烴含量過(guò)高可能會(huì)對(duì)土壤微生物產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致微生物豐富度降低，該結(jié)論與Khan等[24-26]的研究結(jié)果一致. Shannon-Wiener指數(shù)并未隨總石油烴含量的升高呈現(xiàn)明顯變化規(guī)律.

表4 土壤樣品的Alpha多樣性指數(shù)Table 4 Alpha diversity index of soil samples

以97%相似性O(shè)TU(operational taxonomic units，操作分類(lèi)單元)代表序列進(jìn)行土壤微生物分類(lèi)學(xué)分析，抽平后共獲得4 906個(gè)OTU，包含58個(gè)門(mén)，168個(gè)綱，383個(gè)目，615個(gè)科，1 184個(gè)屬，2 241個(gè)種，將平均相對(duì)豐度小于1%的門(mén)水平物種歸入其他類(lèi)別(others)，土壤樣品門(mén)水平微生物群落結(jié)構(gòu)變化情況見(jiàn)圖1. 如圖1所示，石油污染土壤中相對(duì)豐度較高的門(mén)水平優(yōu)勢(shì)物種共6種，分別為變形菌門(mén)(Proteobacteria，占比為22.35%～65.7%)、放線菌門(mén)(Actinobacteriota，占比為5.24%～39.7%)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi，占比為4.61%～15.79%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes，占比為3.47%～15.94%)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteriota，占比為1.25%～15.63%)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidota，占比為0.80%～3.13%).

圖1 石油污染脅迫下土壤微生物門(mén)水平上的物種組成Fig.1 Species composition at the phylum level in oil-contaminated soils

上述優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均在石油污染土壤中普遍存在，并對(duì)脂肪烴、芳香烴和瀝青質(zhì)等[27-31]典型石油類(lèi)污染物具有較強(qiáng)的生物降解作用. 此外，亦發(fā)現(xiàn)上述菌門(mén)可通過(guò)卡爾文循環(huán)、還原乙酰輔酶A途徑、還原性三羧酸循環(huán)等常見(jiàn)的微生物固碳途徑實(shí)現(xiàn)光合碳固定[32-34].

綜上，石油污染脅迫下，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變. 變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為石油污染土壤優(yōu)勢(shì)菌門(mén).

2.2 石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳微生物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

為深入探究石油污染脅迫下土壤石油烴降解及固碳微生物潛在互作關(guān)系，基于2.1節(jié)結(jié)論，采用Spearman相關(guān)性分析對(duì)可能同時(shí)具備石油烴降解及固碳功能的6個(gè)門(mén)水平物種(變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén))中總豐度前40位的屬水平物種進(jìn)行篩選，保留相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值＞0.8、顯著性p值≤0.05的物種進(jìn)行后續(xù)研究.篩選后物種為變形菌門(mén)(占比為42.31%)、放線菌門(mén)(占比為34.62%)、酸桿菌門(mén)(占比為11.54%)、綠彎菌門(mén)(占比為7.69%)和厚壁菌門(mén)(占比為3.85%)5個(gè)門(mén)水平中的26種屬水平物種. 上述26種屬水平物種網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)屬性見(jiàn)表5，相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2.

圖2 石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳微生物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)(屬水平)Fig.2 Correlation network map of potential pollution-reducing and carbon-fixing microorganisms in oil-contaminated soil (genus level)

表5 石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳微生物網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)屬性Table 5 Attribute table of potential pollution-reducing and carbonfixing microbial network nodes in oil-contaminated soil

網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)屬性包括連通性、度中心性等，可反映節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)圖中的重要程度. 其中，連通性表示網(wǎng)絡(luò)中直接與該節(jié)點(diǎn)相連的節(jié)點(diǎn)數(shù)目，連通性越高表示該節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中越重要；度中心性是最直接度量節(jié)點(diǎn)中心性的指標(biāo)，其數(shù)值越大表明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要程度越高. 根據(jù)表5所示連通性及度中心性結(jié)果可知，類(lèi)諾卡氏菌屬(Nocardioides)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬(Pseudomonas)及鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)為關(guān)鍵屬.

類(lèi)諾卡氏菌屬對(duì)石油烴類(lèi)污染物具有較高的降解能力[35]，亦為我國(guó)黃土高原地區(qū)的優(yōu)勢(shì)固碳微生物[36]，可通過(guò)3-羥基丙酸雙循環(huán)與還原性三羧酸循環(huán)實(shí)現(xiàn)大氣CO2的固定[37]；鏈霉菌屬作為石油烴專(zhuān)性降解菌能夠?qū)崿F(xiàn)石油烴的高效降解[38]，周盛等[39]在我國(guó)南方地區(qū)農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn)其具有固定CO2的能力；假單胞菌屬可參與烷烴及芳香烴的好氧與厭氧降解過(guò)程[40-43]，在活性污泥、沼液及農(nóng)田土壤中具有潛在固碳功能[7]，此外，王小利等[44]發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬和假單胞菌屬也是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)碳固定途徑的標(biāo)志性微生物；鞘脂單胞菌屬是多環(huán)芳烴降解微生物的關(guān)鍵菌種之一[45]，在我國(guó)北方草原與森林地區(qū)土壤中具有一定的固碳潛力且為優(yōu)勢(shì)固碳屬[36]. 由此猜測(cè)，類(lèi)諾卡氏菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬及鞘脂單胞菌屬可能為石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳關(guān)鍵屬，有待進(jìn)一步深入論證.

石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳微生物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2. 本相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)共包含26個(gè)節(jié)點(diǎn)和46條連線，其中，正相關(guān)連線數(shù)為39，負(fù)相關(guān)連線數(shù)為7.基于表6所示結(jié)果，本研究后續(xù)重點(diǎn)圍繞4種關(guān)鍵屬水平物種進(jìn)行討論. 相關(guān)性分析結(jié)果表明，假單胞菌屬豐度與鏈霉菌屬(r=—0.818，p=0.001)、類(lèi)諾卡氏菌屬(r=—0.811，p=0.001)豐度均呈極顯著負(fù)相關(guān)，鏈霉菌屬豐度與類(lèi)諾卡氏菌屬(r=0.895，p＜0.001)豐度呈極顯著正相關(guān)，鞘脂單胞菌屬豐度與鏈霉菌屬(r=0.895，p＜0.001)、類(lèi)諾卡氏菌屬(r=0.916，p＜0.001)豐度均呈極顯著正相關(guān). Weiss等[46]認(rèn)為，物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)中存在正相關(guān)關(guān)系的微生物可能為共生微生物，存在負(fù)相關(guān)關(guān)系的微生物可能為拮抗微生物. 據(jù)此，石油污染土壤中假單胞菌屬與鏈霉菌屬、類(lèi)諾卡氏菌屬可能以競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系共存，類(lèi)諾卡氏菌屬、鞘脂單胞菌屬、鏈霉菌屬可能以互利共生關(guān)系共存.

表6 石油烴降解及固碳功能基因豐度Table 6 Abundance of functional genes for petroleum hydrocarbon degradation and carbon fixation

綜上，石油污染土壤中潛在降污固碳微生物多以互利共生方式共存，類(lèi)諾卡氏菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬及鞘脂單胞菌屬可能為石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳關(guān)鍵屬.

2.3 石油烴降解及固碳功能基因的響應(yīng)關(guān)系分析

目前，已知的自養(yǎng)微生物固碳途徑主要有7條：卡爾文循環(huán)、還原性三羧酸循環(huán)、還原乙酰輔酶A途徑、3-羥基丙酸雙循環(huán)、3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)、二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)以及反向甘氨酸裂解途徑[47-48]. 其中，卡爾文循環(huán)是自然界中最重要的微生物光合碳固定途徑，還原乙酰輔酶A途徑相比卡爾文循環(huán)更經(jīng)濟(jì)快速，還原性三羧酸循環(huán)耗能更低[49-50].土壤微生物不同功能基因通過(guò)編碼特定功能蛋白參與微生物的生理生化過(guò)程，不同代謝過(guò)程的功能基因具有特異性. 卡爾文循環(huán)關(guān)鍵酶RubisCO酶編碼基因?yàn)閏bbL和cbbM基因，還原性三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶ATP-檸檬酸裂解酶編碼基因?yàn)閍clB基因，還原乙酰輔酶A途徑關(guān)鍵酶甲酰四氫葉酸合成酶編碼基因?yàn)閒hs基因[47-48,51].

為明確石油污染脅迫下土壤微生物石油烴降解與固碳功能基因間的響應(yīng)關(guān)系，本研究對(duì)這兩類(lèi)功能基因進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析. 選擇烷烴單加氧酶基因(alkB)[52-53]及芳香烴環(huán)羥基化雙加氧酶基因(PAH-RHDα)[54-55]代表典型石油烴降解功能基因，選擇cbbL、cbbM基因、aclB基因和fhs基因代表固碳功能基因，分析結(jié)果見(jiàn)圖3，基因豐度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6.

如表6所示，固碳基因cbbM、aclB、fhs均呈現(xiàn)較高豐度，表明石油污染土壤微生物具備利用卡爾文循環(huán)、還原性三羧酸循環(huán)及還原乙酰輔酶A途徑3種方式實(shí)現(xiàn)碳固定的潛力. 此外，cbbM基因豐度普遍高于其余固碳功能基因豐度，表明卡爾文循環(huán)可能為石油污染脅迫下土壤微生物最主要的固碳途徑.

由圖3可知，烷烴降解功能基因alkB豐度與固碳功能基因cbbL(r=0.846，p=0.001)、aclB(r=0.825，p=0.001)、fhs(r=0.853，p＜0.001)的豐度均呈極顯著正相關(guān)；芳烴降解功能基因PAH-RHDα GP豐度與固碳功能基因cbbL豐度(r=0.825，p=0.001)呈極顯著正相關(guān)，與fhs(r=0.706，p=0.010)、aclB(r=0.650，p=0.022)豐度均呈顯著正相關(guān). 由此可知，烷烴降解與還原乙酰輔酶A途徑關(guān)系更為密切，芳烴降解與卡爾文循環(huán)關(guān)系更為密切.

基于2.2節(jié)結(jié)果，石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳微生物的4種關(guān)鍵屬隸屬于變形菌門(mén)及放線菌門(mén)(見(jiàn)圖2)，其中，變形菌門(mén)主要通過(guò)卡爾文循環(huán)、還原乙酰輔酶A途徑、還原性三羧酸循環(huán)實(shí)現(xiàn)空氣中CO2的固定[32]；放線菌門(mén)主要通過(guò)卡爾文循環(huán)、還原乙酰輔酶A途徑實(shí)現(xiàn)光合碳固定[32-34]. 此外，厲舒禎等[56-58]等在上述兩個(gè)門(mén)水平物種中均發(fā)現(xiàn)存在alkB、PAH-RHDα等石油烴降解功能基因.

綜上，石油污染土壤石油烴降解功能基因豐度與固碳功能基因豐度呈正相關(guān)，推測(cè)石油污染脅迫下土壤微生物降解石油烴與固碳存在協(xié)同作用關(guān)系.

2.4 石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳微生物代謝通路分析

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/keeg)[59]由日本京都大學(xué)生物信息學(xué)中心的Kanehisa實(shí)驗(yàn)室建立，是國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究者常用的生物體內(nèi)代謝分析與代謝網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)庫(kù)之一. 本研究選取石油烴降解和固碳功能基因豐度較高的6個(gè)土壤樣品(S1、S3、S4、S10、S11、S12，見(jiàn)表4)進(jìn)行宏基因組測(cè)序，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋上述樣品功能基因組成及代謝通路.

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)為生物代謝通路分析數(shù)據(jù)庫(kù)，包括細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類(lèi)疾病、新陳代謝和機(jī)體系統(tǒng)6類(lèi)一級(jí)代謝通路. 土壤樣品微生物一級(jí)代謝通路相對(duì)豐度見(jiàn)表7. 由表7可知，新陳代謝通路相對(duì)豐度最高，占比均高于76.00%，故后續(xù)重點(diǎn)分析該通路，并選取新陳代謝二級(jí)代謝通路中能量代謝及外源物質(zhì)生物降解分別代表微生物固碳途徑[60]和有機(jī)污染物去除過(guò)程[61-62]. 能量代謝及外源物質(zhì)生物降解功能注釋見(jiàn)圖4.

圖4 能量代謝和外源物質(zhì)生物降解功能注釋Fig.4 Functional annotation of energy metabolism and xenobiotics biodegradation

表7 6個(gè)土壤樣品中一級(jí)代謝通路的相對(duì)豐度Table 7 Relative abundance of primary metabolic pathways of six samples

如圖4所示，樣品中均注釋到與石油烴降解及固碳相關(guān)的代謝通路，且固碳代謝通路的相對(duì)豐度(平均占比為10.60%)顯著高于石油烴降解代謝通路(平均占比為1.78%)，表明上述兩種代謝通路在石油污染土壤中同時(shí)存在且微生物碳代謝更為活躍. 從外源物質(zhì)生物降解通路角度分析，注釋到苯甲酸鹽降解(平均相對(duì)豐度為8.12%)、氨基苯甲酸酯降解(平均相對(duì)豐度為3.44%)、苯乙烯降解(平均相對(duì)豐度為1.87%)等多條與苯環(huán)結(jié)構(gòu)物質(zhì)代謝相關(guān)通路，表明石油污染脅迫下土壤微生物具備多環(huán)芳烴類(lèi)有機(jī)污染物的降解能力. 從能量代謝通路角度分析，注釋到原核生物碳固定及光合生物碳固定2條與固碳代謝相關(guān)通路，其中，原核生物碳固定占比均大于14.00%(S1、S3、S4、S10、S11、S12分別為15.32%、14.37%、14.73%、17.14%、17.02%、15.67%)，光合生物碳固定占比均大于5.00%(S1、S3、S4、S10、S11、S12分別為5.88%、6.21%、5.62%、6.36%、6.31%、6.54%). 據(jù)此，推測(cè)石油污染脅迫下土壤微生物可能兼具石油烴降解與光合碳固定的能力.

目前，對(duì)于石油污染土壤碳循環(huán)已有相關(guān)研究，如Li等[63]發(fā)現(xiàn)石油污染程度顯著影響土壤微生物碳循環(huán)基因與其他功能基因間的互作關(guān)系；Chen等[60]對(duì)頁(yè)巖氣開(kāi)采區(qū)表層土壤的微生物固碳途徑研究結(jié)果表明該區(qū)域潛在的固碳途徑為還原性三羧酸循環(huán).然而，目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)石油污染土壤微生物降污固碳協(xié)同作用機(jī)制鮮有報(bào)道，故后續(xù)亟待圍繞石油污染脅迫下土壤微生物石油烴降解與光合碳固定代謝通路互作機(jī)制等開(kāi)展相關(guān)研究.

3 結(jié)論

a) 石油污染脅迫下土壤微生物群落豐富度和多樣性隨總石油烴含量的增加呈先減少后增加再減少的趨勢(shì)，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)(占比為22.35%～65.7%)、放線菌門(mén)(占比為5.24%～39.7%)、綠彎菌門(mén)(占比為4.61%～15.79%)、厚壁菌門(mén)(占比為3.47%～15.94%)、酸桿菌門(mén)(占比為1.25%～15.63%)和擬桿菌門(mén)(占比為0.80%～3.13%).

b) 根據(jù)物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，猜測(cè)類(lèi)諾卡氏菌屬、鏈霉菌屬、假單胞菌屬及鞘脂單胞菌屬為石油污染脅迫下土壤降污固碳關(guān)鍵屬. 其中，假單胞菌屬與鏈霉菌屬、類(lèi)諾卡氏菌屬以競(jìng)爭(zhēng)方式共存；類(lèi)諾卡氏菌屬、鞘脂單胞菌屬、鏈霉菌屬以互利共生方式共存.

c) 根據(jù)功能基因相關(guān)性分析結(jié)果，猜測(cè)石油烴降解及固碳功能基因可能存在協(xié)同作用，alkB豐度與cbbL(r=0.846，p=0.001)、aclB(r=0.825，p=0.001)、fhs(r=0.853，p＜0.001)的豐度均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；PAH-RHDαGP豐度與cbbL豐度(r=0.825，p=0.001)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與fhs(r=0.706，p=0.010)、aclB(r=0.650，p=0.022)豐度均呈顯著正相關(guān).

d) KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋結(jié)果表明，石油污染脅迫土壤中同時(shí)存在石油烴降解和固碳代謝通路，且固碳代謝通路相對(duì)豐度顯著高于石油烴降解代謝通路.