曾強 張宇 陳輝 石珂 周麗

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是主要肺癌類型[1-2]。富含亮氨酸的α-2糖蛋白1(leucine-rich-alpha2-glycoprotein 1,LRG1)能促進胃癌細胞的體內(nèi)外增殖和血管生成[3],促進黑色素瘤細胞遷移、侵襲和黏附[4],并可增強NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲能力[5]。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(runt-related transcription factor 1,RUNX1)具有明顯致癌活性[6],可促進大腸癌細胞增殖[7],下調(diào)RUNX1可顯著誘導NSCLC細胞DNA損傷和凋亡[8],骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是RUNX1的下游靶點,RUNX1可直接結(jié)合OPN啟動子,上調(diào)其表達,進而促進頭頸部鱗狀細胞癌的腫瘤進展和轉(zhuǎn)移[9],作為與多種類型的癌癥進展、生長、遷移、侵襲和血管生成相關(guān)的關(guān)鍵因子[10],在NSCLC細胞中過度表達,也是其患者的獨立預后標志物,而敲除OPN可降低NSCLC細胞的遷移和侵襲力[11],LRG1可通過誘導RUNX1的表達促進大腸癌細胞增殖[12],因而預測LRG1可能通過RUNX1/OPN信號調(diào)節(jié)非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本文通過體外培養(yǎng)人NSCLC細胞系A(chǔ)549對此進行驗證。

材料與方法

一、材料

NCI-H838細胞、NCI-H1650細胞、DMEM高糖(含丙酮酸鈉、谷氨酰胺,含雙抗)培養(yǎng)基(SNM-002D)購自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司;人Ⅱ型肺泡上皮細胞(CP-H209)、A549細胞(CL-0016)、Ham’s F-12K培養(yǎng)基(PM150910)、人Ⅱ型肺泡上皮細胞完全培養(yǎng)基(CM-H209)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;LRG1 siRNA(序列信息:LRG1 siRNA-1-F:5′-CCGGGCAATTAGAACGGCTACATCTGGATCCAGATGTAGCCGTTCTAATTGCTTTTTG-3′,R:5′-AATTCAAAAAGCAATTAGAACGGCTACATCTGGATCCAGATGTAGCCGTTCTAATTGC-3′;LRG1 siRNA-2-F:5′-CCGGCAGCCGACACCGTGCACCTGGGGATCCCCAGGTGCACGGTGTCGGCTGTTTTTG,R:5′-AATTCAAAAACAGCCGACACCGTGCACCTGGGGATCCCCAGGTGCACGGTGTCGGCTG-3′)、RUNX1過表達質(zhì)粒(序列信息:F:5′-CCGGAATTCATGCGTATCCCCGTAG-3′,R:5′-CCGCTCGAGGTAGGGCCTCCACACG-3′)、空載質(zhì)粒購自上海生工生物工程股份有限公司; EdU細胞增殖檢測試劑盒、0.1%結(jié)晶紫水溶液、ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測試劑盒、一步法實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗、兔抗人E-cadherin一抗、兔抗人β-tubulin一抗、兔抗人N-cadherin一抗、兔抗人caspase-3一抗、兔抗人GAPDH一抗、兔抗人Bax一抗、兔抗人Bcl-2一抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗人LRG1一抗、兔抗人OPN一抗、兔抗人RUNX1一抗購自美國Abcam公司等。PT-3502C全波長酶標儀購自北京普天新橋技術(shù)有限公司;NIB900-FL科研級倒置熒光顯微鏡、NIB400實驗室級倒置生物顯微鏡購自上海悌可光電科技有限公司;ForeQuant F4/F6qRT-PCR儀購自美國美谷分子公司;CC-SC雙垂直電泳槽、VE-186轉(zhuǎn)印電泳槽、DYY-11B電泳儀購自南京普陽科學儀器研究所等。

二、方法

1.各細胞中LRG1、RUNX1與OPN表達檢測:qRT-PCR實驗使用39.7 ℃水浴快速凍融購買的人Ⅱ型肺泡上皮細胞(人Ⅱ型肺泡上皮細胞完全培養(yǎng)基)與人NSCLC細胞系A(chǔ)549(含10%血清的Ham’s F-12K培養(yǎng)基)、NCI-H838(含10%血清的DMEM高糖培養(yǎng)基)、NCI-H1650(含10%血清的DMEM高糖培養(yǎng)基),復蘇培養(yǎng)后收集傳代后的各種細胞,以高效RIPA裂解液提出其中總蛋白后測出其濃度,根據(jù)測量結(jié)果每組取含20 μg總蛋白的樣品液,于100 ℃沸水中煮沸變性、跑電泳、濕轉(zhuǎn),使于膠中分離開的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,分別截下含有目的蛋白LRG1、RUNX1、OPN、GAPDH,孵育脫脂牛奶封閉后進行抗原抗體反應,接著滴加化學發(fā)光試劑顯色,攝取各蛋白條帶圖像,運用Image J軟件分析得到各組蛋白相對表達量。實驗重復6次。

以Trizol提取收集的上述4種傳代細胞總RNA,使用一步法反轉(zhuǎn)錄qRT-PCR試劑盒并參照其說明書指導做實時熒光定量PCR擴增,所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt算法做分析,得出LRG1、RUNX1與OPN mRNA相對表達,實驗重復6次。GAPDH為內(nèi)參,各基因引物序列:LRG1上游引物:5′-GTTGGAGACCTTGCCACCT-3′,下游引物:5′-GCTTGTTGCCGTTCAGGA-3′;GAPDH上游引物:5′-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3′,下游引物:5′-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3′;RUNX1上游引物:5′-CTGCCCATCGCTTTCAAGGT-3′,下游引物:5′-GCCGAGTAGTTTTCATCATTGCC-3′;OPN上游引物:5′-TTGCAGTGATTTGCTTTTGC-3′,下游引物:5′-GTCAATGGAGTCCTGGCTGT-3′。

2.分組轉(zhuǎn)染細胞及收集標本:取無菌的12孔板,接種傳代的A549細胞無菌培養(yǎng)24小時,隨機分為對照組、LRG1敲低組、陰性對照組、RUNX1過表達組、LRG1敲低+RUNX1過表達組,使用脂質(zhì)體2000分組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,LRG1敲低組轉(zhuǎn)染LRG1 siRNA,陰性對照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒,RUNX1過表達組轉(zhuǎn)染LRG1 siRNA陰性對照和RUNX1過表達質(zhì)粒,LRG1敲低+RUNX1過表達組轉(zhuǎn)染LRG1 siRNA和RUNX1過表達質(zhì)粒。具體轉(zhuǎn)染步驟參照脂質(zhì)體2000說明書指導進行,轉(zhuǎn)染24小時后收集各組細胞作標本備用。實驗重復6次。

3.各組細胞LRG1、RUNX1與OPN表達檢測:取出1.2.2中收集的各組細胞,采用qRT-PCR和免疫印跡實驗分別檢測其中LRG1、RUNX1、OPN mRNA與蛋白表達,具體方法步驟按照1.2.1進行。

4.各組細胞增殖、凋亡檢測:以EdU染色檢測各組細胞增殖:取無菌的12孔板,接種傳代的A549細胞無菌培養(yǎng)24小時,遵照1.2.2中方法步驟分組進行細胞轉(zhuǎn)染,24小時后加入適量EdU試劑繼續(xù)培養(yǎng),12小時后清洗、固定細胞,參照EdU細胞增殖檢測試劑盒說明指導于熒光顯微鏡下進行染色后觀察,每孔任選3個視野攝取圖像,細胞計數(shù)后計算各組細胞EdU陽性率=EdU陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

5.流式細胞實驗檢測各組細胞凋亡:取1.2.2中收集的各組細胞,以PBS緩沖液清洗后,加入1 ml PBS緩沖液重懸計數(shù),每組取5×106個細胞,離心后加入PBS緩沖液及ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測試劑盒中的ANNEXIN V- FITC、PI,避光反應15分鐘后采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

6.各組細胞遷移侵襲檢測:劃痕實驗檢測各組細胞遷移:取無菌的12孔板,接種傳代的A549細胞無菌培養(yǎng)24小時,遵照1.2.2中方法步驟分組進行細胞轉(zhuǎn)染,24小時后在每孔中央劃一條直線,洗去劃痕中細胞后于光學顯微鏡下觀察并拍照,所得圖像采用Image Pro Plus軟件測量劃痕寬度L0,繼續(xù)培養(yǎng)24小時后再次于光學顯微鏡下觀察、拍照、測量劃痕寬度L1,計算各組細胞遷移率=L0-L1/L0×100%。

Transwell實驗檢測各組細胞侵襲:取1.2.2中收集的各組細胞,以PBS緩沖液清洗后,加入1 ml不含血清的Ham’s F-12K培養(yǎng)基重懸計數(shù),取無菌的Transwell培養(yǎng)板以基底膠包被后于上室中接種1.2.2中5×105個/ml的各組細胞,同時于下室加適量含血清的Ham’s F-12K培養(yǎng)基,無菌培養(yǎng)細胞24小時,以棉簽清除上室細胞后清洗、固定下室細胞,加入0.1%結(jié)晶紫水溶液沒過細胞,染色5分鐘后清洗,于光學顯微鏡下觀察拍照,計數(shù)所得圖像中各組細胞。

7.檢測各組細胞凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志蛋白表達:取出1.2.2中收集的各組細胞,采用免疫印跡實驗分別檢測其中Bcl-2、caspase-3、Bax、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達,具體方法步驟按照1.2.1中進行。實驗重復6次。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié)果

1.人Ⅱ型肺泡上皮細胞與人NSCLC細胞系A(chǔ)549、NCI-H838、NCI-H1650中LRG1、RUNX1與OPN表達:與人Ⅱ型肺泡上皮細胞相比,人NSCLC細胞系A(chǔ)549、NCI-H838、NCI-H1650中LRG1、RUNX1與OPN mRNA與蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 免疫印跡檢測各細胞LRG1、RUNX1與OPN蛋白表達

表1 各細胞中LRG1、RUNX1與OPN mRNA相對表達水平(n=6)

2.各組A549細胞中LRG1、RUNX1與OPN表達檢測結(jié)果:與對照組相比,LRG1敲低組細胞LRG1、RUNX1與OPN mRNA與蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);RUNX1過表達組細胞LRG1 mRNA與蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),RUNX1與OPN mRNA與蛋白表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);陰性對照組細胞LRG1、RUNX1與OPN mRNA與蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與LRG1敲低組相比,LRG1敲低+RUNX1過表達組細胞LRG1 mRNA與蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),RUNX1與OPN mRNA與蛋白表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表2。

注:A:對照組;B:LRG1敲低組;C:陰性對照組;D:RUNX1過表達組;E:LRG1敲低+RUNX1過表達組

表2 各組A549細胞LRG1、RUNX1與OPN mRNA與蛋白相對表達水平(n=6)

3.各組A549細胞增殖與凋亡情況檢測結(jié)果比較:與對照組[(41.26±3.89)%、(7.43±0.95)%]相比,LRG1敲低組EdU陽性率[(10.02±1.67)%]降低(P<0.05),細胞凋亡率[(51.82±11.46)%]升高(P<0.05);RUNX1過表達組EdU陽性率[(78.16±8.01)%]升高(P<0.05),細胞凋亡率[(1.13±0.28)%]降低(P<0.05);陰性對照組EdU陽性率[(42.93±4.32)%]與細胞凋亡率[(7.54±0.71)%]均無顯著差異(P>0.05)。與LRG1敲低組相比,LRG1敲低+RUNX1過表達組EdU陽性率[(38.14±4.10)%]升高(P<0.05),細胞凋亡率[(9.17±2.20)%]降低(P<0.05)。見圖3。

注:A:對照組;B:LRG1敲低組;C:陰性對照組;D:RUNX1過表達組;E:LRG1敲低+RUNX1過表達組

4.各組A549細胞遷移與侵襲情況檢測結(jié)果:對照組[(75.12±7.03)%、(191.57±32.62)個]相比,LRG1敲低組細胞遷移率[(29.78±4.59)%]與侵襲數(shù)[(65.24±8.39)個]均降低(P<0.05),RUNX1過表達組細胞遷移率[(96.67±10.12)%]與侵襲數(shù)[(316.35±40.63)個]均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),陰性對照組細胞遷移率[(76.31±12.45)%]與侵襲數(shù)[(197.20±36.12)個]均無明顯差異(P>0.05);與LRG1敲低組相比,LRG1敲低+RUNX1過表達組細胞遷移率[(68.25±9.04)%]與侵襲數(shù)[(178.95±30.48)個]均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

注:A:對照組;B:LRG1敲低組;C:陰性對照組;D:RUNX1過表達組;E:LRG1敲低+RUNX1過表達組

5.各組A549細胞凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志蛋白表達結(jié)果比較:與對照組相比,LRG1敲低組細胞Bcl-2、N-cadherin蛋白表達降低,caspase-3、Bax、E-cadherin蛋白表達升高;RUNX1過表達組細胞Bcl-2、N-cadherin蛋白表達升高,caspase-3、Bax、E-cadherin蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);陰性對照組細胞Bcl-2、caspase-3、Bax、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達無明顯差異(P>0.05);與LRG1敲低組相比,LRG1敲低+RUNX1過表達組細胞Bcl-2、N-cadherin蛋白表達升高,caspase-3、Bax、E-cadherin蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5、表3。

注:A:對照組;B:LRG1敲低組;C:陰性對照組;D:RUNX1過表達組;E:LRG1敲低+RUNX1過表達組

表3 各組A549細胞Bcl-2、caspase-3、Bax、N-cadherin、E-cadherin蛋白相對表達水平(n=6)

討論

NSCLC病人生存期有所延長,但因病情的反復復發(fā)及癌細胞的遠處轉(zhuǎn)移,每年死于NSCLC的病患數(shù)還是越來越多[13-14]。LRG1具有顯著致癌作用的癌基因,在包括NSCLC在內(nèi)的腫瘤中表達顯著增加[3,15],敲除LRG1基因可降低胰腺癌細胞活力,抑制其遷移、侵襲和血管生成[16]。有研究顯示,LRG1可誘導NSCLC細胞增殖,促進其遷移、侵襲和血管生成,靶向LRG1在NSCLC治療中具有潛在的應用前景[5],結(jié)果顯示,相比正常人Ⅱ型肺泡上皮細胞,人NSCLC細胞系A(chǔ)549、NCI-H838、NCI-H1650中LRG1表達升高,轉(zhuǎn)染LRG1 siRNA可降低A549細胞EdU陽性率、遷移率、侵襲數(shù)、細胞LRG1、RUNX1與OPN mRNA及蛋白表達、細胞Bcl-2、N-cadherin蛋白表達,升高其凋亡率、細胞caspase-3、Bax、E-cadherin蛋白表達,表明LRG1介導NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲過程,敲低LRG1可抑制其增殖、遷移和侵襲,對NSCLC起到顯著的抗癌功效。

RUNX1/OPN信號在腫瘤成瘤性、生長、轉(zhuǎn)移及血管生成過程中發(fā)揮著重要作用,RUNX1的高表達與膠質(zhì)瘤病人預后不良密切相關(guān)[17],而OPN是調(diào)控多種腫瘤間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子[18]。本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染RUNX1過表達質(zhì)?？缮逜549細胞EdU陽性率、遷移率、侵襲數(shù)、細胞LRG1、RUNX1與OPN mRNA及蛋白表達、細胞Bcl-2、N-cadherin蛋白表達,降低其凋亡率、細胞caspase-3、Bax、E-cadherin蛋白表達,表明上調(diào)RUNX1表達可促進NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲,且LRG1可促進RUNX1表達,進而誘導大腸癌細胞凋亡,因而推測下調(diào)RUNX1/OPN通路表達可能是敲低LRG1降低NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲能力的分子機制,結(jié)果顯示,RUNX1與OPN在人NSCLC細胞系A(chǔ)549、NCI-H838、NCI-H1650中高表達,轉(zhuǎn)染LRG1 siRNA敲低LRG1可降低A549細胞RUNX1與OPN mRNA及蛋白表達,表明RUNX1/OPN信號參與介導LRG1對NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲過程,敲低LRG1同時過表達RUNX1,相比只敲低LRG1,可升高A549細胞EdU陽性率、遷移率、侵襲數(shù)、細胞RUNX1與OPN mRNA及蛋白表達、細胞Bcl-2、N-cadherin蛋白表達,降低其凋亡率、細胞caspase-3、Bax、E-cadherin蛋白表達,表明過表達RUNX1可減弱敲低LRG1對NSCLC細胞間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化、增殖、遷移和侵襲的抑制作用,逆轉(zhuǎn)其抗癌功效,揭示LRG1是通過RUNX1/OPN軸調(diào)節(jié)NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲的。

綜上所述,敲低LRG1可下調(diào)RUNX1與OPN的表達,減弱NSCLC細胞增殖及間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化,降低其遷移和侵襲能力,并誘導NSCLC細胞大量凋亡,起到顯著的抗癌功能,下調(diào)RUNX1/OPN通路是其分子機制之一,本研究有助于全面深入闡釋NSCLC發(fā)病機制,為其臨床治療提供了新的有應用前景的作用靶點。