李有麗　吉訓(xùn)志　秦曉威　魚歡　張昂　宗迎　賀書珍

關(guān)鍵詞：斑蘭葉；揮發(fā)性成分；2-乙酰-1-吡咯啉；激素；微量元素

中圖分類號：S573.9 文獻標識碼：A

斑蘭葉，學(xué)名香露兜（Pandanus amaryllifoliusRoxb.），別稱香蘭葉、板蘭葉、七蘭葉、碧血樹等，是露兜樹科（Pandanaceae）露兜屬（Pandanus）的一種多年生熱帶園藝作物[1]，也是露兜樹科中唯一葉片帶有芳香氣味的植物，被譽為“東方人的香草”，其葉片中主要特征揮發(fā)性物質(zhì)為2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline， 2AP），能散發(fā)出一種特殊香氣——粽香[2-4]。近年來，斑蘭葉作為一種新興農(nóng)業(yè)逐漸走入大眾視野，在海南是一種能與檳榔、椰子、橡膠“三棵樹”林下復(fù)合種植的優(yōu)勢作物[5]。斑蘭葉葉片中含有的較多角鯊烯、葉綠醇、亞油酸、草蒿腦等活性物質(zhì)，具有降低血壓血脂、殺菌、退熱、抗抑郁、驅(qū)蟲、增強細胞的活力及免疫力等作用[6-7]，在市場上有很大的利用價值與開發(fā)前景。

斑蘭葉的繁殖主要通過莖蔓扦插繁育和根蘗繁殖，其中根蘗苗繁殖具有簡單易行、繁苗速度快、繁殖系數(shù)大、保持優(yōu)良性狀等優(yōu)點[8]。但是組培苗煉苗移栽作為斑蘭葉組織培養(yǎng)最后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，該時期內(nèi)，組培苗對環(huán)境格外敏感，移栽苗質(zhì)量和栽培管理措施對后期植株的成活及產(chǎn)量產(chǎn)生直接影響，因此提高組培苗質(zhì)量至關(guān)重要。激素在植物生長發(fā)育和脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。據(jù)相關(guān)研究表明，NAA 和IBA 被廣泛應(yīng)用并且在培養(yǎng)基中添加可以促進植物壯苗生根[9-10]。同時，魚歡等[11]、譚明欣等[12]也進一步表明適宜的IBA 濃度和處理時間可以促進根蘗苗生根及干物質(zhì)積累。此外，微量元素對香稻香氣濃度有直接影響，其中鋅作為一些酶的組成成分，是影響香稻香氣形成的重要元素[13]。鑭作為稀土元素之一，對生命活動有重要的調(diào)節(jié)作用。黃錦霞等[14]研究表明，基施鋅肥能顯著增加不同品種香稻籽粒2-AP 含量。在基肥施用氯化鋅、氯化鑭或齊穗期噴施氯化鋅能顯著或極顯著地提高香稻培雜軟香和桂香占糙米的香氣含量[15]。并且施用碳酸氫銨+過磷酸鈣+氯化鉀能顯著提高香稻籽粒2AP含量[16]。以上研究主要針對香稻。然而目前有關(guān)斑蘭葉的研究主要集中于斑蘭葉組培快繁技術(shù)、揮發(fā)性成分的分析鑒定與評價等方面[17-22]，有關(guān)栽培管理措施對斑蘭葉香氣品質(zhì)影響等方面的研究較少。因此為探究不同激素和微量元素處理對斑蘭葉移栽成活率和香氣的影響，本研究在培育斑蘭葉組培苗的基礎(chǔ)上，通過施用不同類型的肥料，初步探討NAA、IBA、鋅元素、鑭元素、組合肥（碳酸氫銨+過磷酸鈣+氯化鉀）與斑蘭葉組培移栽苗揮發(fā)性香氣成分之間的變化趨勢，并篩選出最佳的施肥配方，以期為斑蘭葉組培苗的大規(guī)模煉苗移栽和增香提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究所選試驗材料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所組織培養(yǎng)室提供，所選取的斑蘭葉培養(yǎng)條件、形狀大小基本一致，具有6～10 cm 完整根系和2～6 片開展葉。

1.1.2 試劑 無水乙醇、無水硫酸鈉為分析純，購自西隴科學(xué)股份有限公司；硫酸鋅、氯化鑭、碳酸氫銨、過磷酸鈣、氯化鉀購自西隴科學(xué)股份有限公司；2AP、葉綠醇、角鯊烯標準品購自上海源葉生物科技有限公司；C7～C40 正構(gòu)烷烴混標標準品為色譜純，購自上海安譜實驗科技有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 Aglient-7890B/5977B氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；S600超聲波清洗機（東莞市墨潔超聲波設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗地點位于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所3號大棚（ 18?15?N ，110?13?E）。采用盆栽試驗，共設(shè)7 個處理，每處理重復(fù)10 次。將組培苗根部按不同試驗設(shè)計方案（表1）浸泡1 d 后，用噴壺保證葉片濕潤，置于25～28 ℃溫度下煉苗，煉苗完成后移栽至裝有基質(zhì)的花盆中，保證基質(zhì)濕度在80%～85%之間，待基質(zhì)濕度降低時，澆灌不同處理的溶液保持基質(zhì)濕度在70%～80%之間，培養(yǎng)2 個月后，待測。

1.2.2 樣品預(yù)處理 采摘不同處理的斑蘭葉后，用浸濕無水乙醇的紗布擦凈葉面雜質(zhì)，分別稱取4 g 剪碎的斑蘭葉于50 mL 的離心管中，加入12 mL 的無水乙醇并用玻璃棒使樣品浸沒，在400 W、40 KHz、50 ℃下超聲萃取60min，吸取萃取液，無水硫酸鈉干燥后，經(jīng)0.22 μm 有機相針式過濾器（尼龍）過濾至進樣瓶中，于4 ℃冰箱保存待測。

1.2.3 氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）測定 色譜條件：DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，進樣口溫度250 ℃，初始溫度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升溫至100 ℃，然后以6 ℃/min 升溫至250 ℃，保持5 min，載氣為高純氦氣（99.999%），流量1 mL/min，不分流經(jīng)樣。質(zhì)譜條件：離子源為EI；電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃，進樣口溫度250 ℃，掃描質(zhì)量范圍30～450 amu。

1.2.4 揮發(fā)性成分定性分析 結(jié)合質(zhì)譜和保留指數(shù)（retention index， RI）對斑蘭葉揮發(fā)性香氣成分進行定性，其中質(zhì)譜分析結(jié)果在NIST2017 譜庫進行檢索，比對定性：并且使用C7～C40 正構(gòu)烷烴混標，以相同條件進行GC-MS 分析，利用其保留時間按照線性方程計算各揮發(fā)性成分的保留指數(shù)（RI）[23]，參照文獻定性分析。

1.2.5 揮發(fā)性成分定量分析 精密吸取2-乙酰-1-吡咯啉標準品、葉綠醇標準品、角鯊烯標準品以及甲醇按照50、100、150、300、500 μg/mL 的溶液濃度梯度分別進行配置，按照樣品的色譜條件，標準品梯度濃度由低到高的順序依次進樣，每個濃度進樣3次，以各組分梯度濃度為橫坐標，3 次測定峰面積的平均值為縱坐標，得到各組分的定量線性關(guān)系。利用峰面積按照線性方程計算2AP、葉綠醇、角鯊烯含量，同時再根據(jù)2AP 含量對其他香氣物質(zhì)進行半定量[24]。計算公式：

X_i=（Ai/A_s）×C_s

式中，X_i 為待測物質(zhì)含量；A_i 為待測物的峰面積；A_s為2AP 的峰面積；C_s為樣品中2AP 含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個處理進行3 次重復(fù)，采用Excel 軟件對揮發(fā)性成分相對含量進行計算統(tǒng)計整理，數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式展示。使用SPSS 軟件單因素方差分析（one-way ANOVA）進行不同處理揮發(fā)性成分的差異性分析，采用Origin、R 語言作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑蘭葉組培苗揮發(fā)性成分種類分析

不同激素和微量元素處理下的斑蘭葉組培苗揮發(fā)性成分定性與半定量結(jié)果如圖1、表2 所示，共檢測鑒定出揮發(fā)性物質(zhì)21 種，包括醇類（6 種）、吡咯類（1 種）、酯類（6 種）、酮類（1 種）、呋喃類（2 種）、呋喃酮類（1 種）、酸類（1 種）、烯烴類（2 種）、酚類（1 種）9 類。烯烴類所占比例最高（占總含量的56.26%），其次為呋喃酮類（占14.00%），醇類（占13.77%），吡咯類（占6.74%），呋喃類（占3.66%），酯類（占3.22%），其余酮類、酸類、酚類所占總含量均低于2%。對于不同肥效處理下的斑蘭葉組培苗，其揮發(fā)性成分種類組成無顯著差異，但揮發(fā)性成分相對含量差異顯著（P<0.05），揮發(fā)性成分含量由高到低依次為：烯烴類>呋喃酮類>醇類>吡咯類>呋喃類>酯類>酮類>酸類>酚類，其中，角鯊烯、3-甲基-2-（5H）-呋喃酮、葉綠醇、2-乙酰-1-吡咯啉、新植二烯、2，3-二氫苯并呋喃在不同處理下?lián)]發(fā)性香氣成分含量均有較高的積累，構(gòu)成了斑蘭葉的主要香氣物質(zhì)。

2.2 斑蘭葉組培苗揮發(fā)性成分組成分析

如圖2A 所示，不同處理下斑蘭葉組培苗的角鯊烯、葉綠醇、2AP 均存在顯著差異。在T6 處理下，2-乙酰-1-吡咯啉、葉綠醇含量為最高，而T1 處理3 種物質(zhì)含量均為最低。此外，不同處理下的2AP 平均含量為48.07 μg/g，T₆處理最高，2AP含量為72.03 μg/g，與T7 相比，提高了55.71%；其余處理方式無顯著差異。不同處理下斑蘭葉組培苗中的葉綠醇含量為49.83～111.08 μg/g，T₆能顯著提高葉綠醇的含量，與T7 相比，提高了44.55%；而T₁顯著降低了葉綠醇的含量，其余處理無顯著性差異。斑蘭葉組培苗中角鯊烯等烯烴類物質(zhì)含量最高，占總含量的56.26%，不同激素和微量元素處理下的斑蘭葉組培苗中的角鯊烯含量具有差異，就顯著性而言，不同處理下角鯊烯均有顯著差異，其中T₄、T₇角鯊烯顯著高于其他處理。就含量而言，T₄ 的角鯊烯含量最高為535.76 μg/g，其次為T₇、T₃、T₆、T₅、T₂，而T₁的角鯊烯含量最低，僅為205.92 μg/g。

由圖2B 可知，不同處理方式對斑蘭葉組培苗葉片中3-甲基-2（5H）-呋喃酮含量均有顯著影響。與常規(guī)處理相比，T₁至T₆中的3-甲基-2（5H）-呋喃酮含量均高于T₇，其中T₁最低，T₆ 含量最高，與T₇相比，提高了52.71%。

由圖2C 可以看出，不同激素和微量元素處理下斑蘭葉組培苗中的新植二烯差異顯著，并且變化規(guī)律與3-甲基-2（5H）-呋喃酮相似。T₆、T₅、T₂、T₃中新植二烯最高為61.05 μg/g，比T7 提高了55.61%。

2.3 斑蘭葉組培苗揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析

本研究對不同物質(zhì)處理下的斑蘭葉組培苗中9 類揮發(fā)性香氣種類和21 種揮發(fā)性香氣含量進行PCA 分析，由圖3 可知，9 類揮發(fā)性香氣種類對主成分1（PC1）的方差貢獻率為98.7%，對主成分2（PC2）的方差貢獻率為1.1%，累計貢獻率達99.8%（圖3A）；21 種揮發(fā)性香氣含量對主成分1（PC1）方差貢獻率達98.1%，對主成分2（PC2）達1.7%，總方差貢獻率達99.8%（圖3B），說明PCA 分析可以解釋不同激素和微量元素處理下斑蘭葉組培苗之間的變異信息。從圖3 可以看出，不同處理變量的揮發(fā)性種類和揮發(fā)性含量變化相似，并且不同肥效處理下?lián)]發(fā)性香氣成分差異較大?？傮w上可以分為3 類，T₂、T₆屬于I 類；T₁、T₅ 屬于II 類；T₃、T₄、T₇屬于III 類。其中T₂ 和T₇ 之間間隔最遠，說明施加碳酸氫銨+過磷酸鈣+氯化鉀組合肥的處理與常規(guī)清水處理之間差異明顯。此外，不同處理變量在PC1 的載荷系數(shù)大，同時載荷系數(shù)符號都為正，因此不同處理變量與PC1 正向都有較大的關(guān)系，得分均為正。其中I類中揮發(fā)性成分主要以3-甲基-2（5H）-呋喃酮為主的呋喃類、葉綠醇為主的醇類、2AP 為主的吡咯類等化合物相關(guān)；II 類中含有較高含量的角鯊烯、2AP、2，3-二氫苯并呋喃、丙醇、異丁醇、L-乳酸乙酯、（±）-α-羥基-γ-丁內(nèi)酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯亞麻酸乙酯、丙酮醇等物質(zhì)；III類的特征性揮發(fā)性物質(zhì)主要以角鯊烯為主。

2.4 斑蘭葉組培苗揮發(fā)性成分差異分析

聚類熱圖顯示不同肥效處理下的揮發(fā)性成分含量差異較大（圖4），這與PCA 所得結(jié)論一致。不同顏色代表不同處理的揮發(fā)性物質(zhì)含量平均值，通過顏色深淺可以直觀看出不同處理下斑蘭葉組培苗揮發(fā)性成分含量的差異。由圖4 可知，烯烴類、呋喃酮類、醇類、吡咯類、呋喃類對斑蘭葉組培苗的揮發(fā)性成分有較大的貢獻。結(jié)合聚類分析展示不同處理間的相似性，可大致分為三大類，T₁ 聚為一類；T₆聚為一類；其余處理歸為第三類。其中T₆中的2AP、新植二烯、葉綠醇、3-甲基-2-（5H）呋喃酮、2，3-二氫苯并呋喃、丙醇、2，4-二叔丁基苯酚、棕櫚酸乙酯、亞麻酸乙酯、（±）-a-羥基-γ-丁內(nèi)酯、亞油酸乙酯含量較高；T₁中的顏色均較淺，揮發(fā)性香氣成分都比較少。因此通過聚類熱圖可直觀看出不同生長激素和微量元素會對其揮發(fā)性成分含量產(chǎn)生影響，并且在斑蘭葉組培苗生長過程中，通過采用T₆處理可促進斑蘭葉組培苗揮發(fā)性成分的積累，而在T1 處理下的斑蘭葉組培苗揮發(fā)性成分含量積累均較少。

3討論

本研究通過對不同激素及微量元素處理下的斑蘭葉組培苗揮發(fā)性香氣成分進行分析測定，共鑒定出21 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醇類化合物6 種、酯類化合物6 種、呋喃類化合物2 種及其余化合物1 種。這與郭培培等[25]的研究結(jié)果類似。本研究檢測到斑蘭葉組培移栽苗中含有較高含量的角鯊烯、葉綠醇、2-乙酰-1-吡咯啉、新植二烯、3-甲基-2（5H）呋喃酮、2，3-二氫苯并呋喃等功能性物質(zhì)，為斑蘭葉組培苗主要的揮發(fā)性成分。前人研究表明，植物中角鯊烯來源豐富，具有促進血液循環(huán)、抗腫瘤、提高免疫力等功效的作用[26]。本研究中，斑蘭葉組培苗的角鯊烯平均含量為（355.26±7.16）μg/g，高于花生油[27]、葵花籽油[28]、油茶籽油[29]中角鯊烯含量。此外，葉綠醇在植物代謝途徑中具有重要作用，可以促進糖脂代謝、脂肪細胞分化，對畜牧產(chǎn)品中的功能性物質(zhì)含量具有直接影響[30]， 在本研究中葉綠醇含量為49.83～111.08 μg/g。2AP 作為斑蘭葉特征性風味的重要來源，其2AP 含量是香稻的10 倍以上，非香稻的100 倍[31]。本研究檢測到的2AP 平均含量為48.07 μg/g，并且在鋅+組合肥處理下顯著提高特征性物質(zhì)2AP 的含量，與其他處理相比，提高了25.53%～125.42%，該結(jié)果與大多數(shù)學(xué)者研究結(jié)果一致。

此外，相關(guān)文獻顯示，與常規(guī)施肥（尿素+過磷酸鈣+氯化鉀）相比，組合肥（碳酸氫鈣+過磷酸鈣+氯化鉀）具有肥效長、利用率高、更加方便的優(yōu)點[32]，但本研究結(jié)果能否達到節(jié)約高效的目的有待進一步深入研究。本研究的熱圖和聚類分析說明，不同激素及微量元素處理下的斑蘭葉組培苗揮發(fā)性成分均存在差異，經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，T₆ 處理能顯著提高特征性物質(zhì)2AP 的含量，同時該處理下斑蘭葉組培苗中葉綠醇、2AP、2，3-二氫苯并呋喃、3-甲基-2（5H）呋喃酮、新植二烯等揮發(fā)性成分含量均為最高。因此，采用鋅+組合肥的施肥配方能促進揮發(fā)性香氣的積累，為最佳處理方法。而所謂“最佳配方”只是作為參考，后期應(yīng)結(jié)合施肥方式、施肥量、施肥時期以及其他自然因素等諸多因素來進一步研究。本研究結(jié)果中有關(guān)栽培方式的內(nèi)容也對斑蘭葉組培苗煉苗栽培及增香方面具有指導(dǎo)意義，可以為斑蘭葉的擴大種植及增香提供參考。