唐鈺梅，任來峰，黃翔，李強(qiáng)，程樂

(1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2.山西省腫瘤醫(yī)院免疫室，山西 太原 030003；3. 山西省婦女兒童保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，山西 太原 030000)

0 引言

無齒蛋白同源物(denticleless protein homolog，DTL)又名維甲酸調(diào)節(jié)的核基質(zhì)相關(guān)蛋白(retinoic acid regulated nuclear matrix associated protein，RAMP)，是一種DCX (DDB1-CUL4-X-box)E3 泛素-連接酶復(fù)合物的底物識(shí)別受體，參與識(shí)別多種DNA復(fù)制和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如CDT1、p21等，并介導(dǎo)他們的多泛素化降解，維持基因組穩(wěn)定性[1-2]。DTL已被發(fā)現(xiàn)在某些癌癥如宮頸癌、胃癌等中表達(dá)顯著增高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞快速增殖，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。在T47D細(xì)胞、HBC4細(xì)胞中敲除DTL基因會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂失敗，使細(xì)胞停滯于G2/M期，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[5-6]。DTL是維甲酸誘導(dǎo)的NT2細(xì)胞神經(jīng)分化過程中差異調(diào)控的下調(diào)基因，主要位于細(xì)胞核[5]。在DNA雙鏈斷裂發(fā)生時(shí)DTL從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到染色質(zhì)損傷位點(diǎn)，調(diào)控?fù)p傷修復(fù)[7]。

亞細(xì)胞定位是研究生物大分子的重要技術(shù)手段，用來判定生物大分子發(fā)揮生物學(xué)功能的場(chǎng)所以及是否能夠發(fā)揮正確的功能。特定的蛋白質(zhì)只有在特定位置上與特定的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，才能發(fā)揮正確的生物學(xué)功能，一旦某些蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)生改變，不僅影響其功能，甚至?xí)绊懠?xì)胞的增殖、分化及死亡，因此對(duì)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的研究具有重要意義[8]。

細(xì)胞增殖是指細(xì)胞在細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白激酶及表觀遺傳調(diào)控等其他機(jī)制充分的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行分裂、增殖和分化[9-10]。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞增殖主要包括有絲分裂和減數(shù)分裂兩種，受到細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶及其調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的嚴(yán)格調(diào)控。細(xì)胞周期調(diào)控是疾病和再生的關(guān)鍵因素，關(guān)鍵調(diào)控因子的異常表達(dá)與癌癥患者的不良預(yù)后和較短的生存期相關(guān)。腫瘤也是一種分化異常的疾病，在腫瘤細(xì)胞中惡性程度高，意味著該腫瘤細(xì)胞分化程度低，增殖速度快，與正常細(xì)胞的形態(tài)、代謝、功能的差別顯著，容易發(fā)生侵襲、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。此外，在男性生殖細(xì)胞中不同細(xì)胞也具有不同的增殖速率，其細(xì)胞增殖速率及細(xì)胞分化程度由低到高依次為精子、次級(jí)精母細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、精原細(xì)胞。

綜上，DTL在細(xì)胞增殖和分化調(diào)控中起著重要作用，因此，本研究通過在多種組織、細(xì)胞中，進(jìn)行免疫熒光(immunofluorescence，IF)和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)DTL的亞細(xì)胞定位，并通過分步提取細(xì)胞成分和蛋白質(zhì)印跡(Western blotting，WB)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探討DTL亞細(xì)胞定位改變對(duì)細(xì)胞增殖和分化的潛在調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人胚腎HEK293T細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)武漢BOSTER公司。人輸尿管上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1細(xì)胞株、人胃癌MKN28/MGC803細(xì)胞株、人結(jié)直腸癌HCT116/HT29細(xì)胞株購(gòu)自湖南豐暉生物公司。小鼠精原細(xì)胞GC-1 spg、小鼠精母細(xì)胞GC-2 spd細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所。人膀胱癌移行細(xì)胞T24細(xì)胞株購(gòu)自吉?jiǎng)P基因(上海)。

1.1.2 抗體和試劑

本研究主要使用以下抗體：兔抗DTL單抗(Abcam，ab72264，IHC/IF 1∶100稀釋，WB 1∶500稀釋)、兔抗R-CY3二抗(Sigma，A05455，IHC/IF 1∶2000稀釋)、鼠抗α-Tubulin單抗(Sigma，T6074，WB 1∶50000稀釋)、兔抗H3單抗(武漢三鷹，17168-I-qp，WB 1∶500稀釋)，HRP標(biāo)記的抗兔、鼠二抗 (Sigma，A05455，A4416，WB 1∶2000稀釋)。

本研究主要使用以下試劑：4%多聚甲醛購(gòu)自默克公司，抗熒光淬滅封片劑DAPI購(gòu)自Vector Laboratories，免疫組織化學(xué)試劑盒(二抗、非特異性阻斷劑H2O2、DAB顯色劑)購(gòu)自基因科技有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)基、SDS樣品緩沖液購(gòu)自BOSTER公司，胎牛血清、PVDF膜購(gòu)自Sigma公司，雙抗購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.3 臨床標(biāo)本來源

收集2012—2022年山西省腫瘤醫(yī)院病理科存檔的非腫瘤患者肝穿及肝細(xì)胞癌病理活檢石蠟標(biāo)本各10例，結(jié)直腸癌及癌旁病理活檢石蠟標(biāo)本各10例，肺癌及非腫瘤病理活檢石蠟標(biāo)本各10例，膀胱癌及癌旁病理活檢石蠟標(biāo)本各10例，胃癌及癌旁病理活檢石蠟標(biāo)本各10例，所有患者均在山西省腫瘤醫(yī)院行手術(shù)治療，且術(shù)前均未行放療、化療。收集山西省兒童醫(yī)院、山西省婦幼保健院患者睪丸組織病理切片5例，本研究獲得山西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)、山西省兒童醫(yī)院、山西省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(202225，202053)，參與者提供了參與本研究的書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

所有細(xì)胞均培養(yǎng)在37 ℃條件下含5% CO2的培養(yǎng)箱中，HT29細(xì)胞在McCoy’s 5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)，SV-HUC-1細(xì)胞、T24細(xì)胞在1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其余細(xì)胞均在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所有培養(yǎng)基含有10%胎牛血清和1%雙抗。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行鋪板，將細(xì)胞鋪在含蓋玻片的24孔板中，待生長(zhǎng)至60%～70%時(shí)收樣。

1.2.2 IF染色

對(duì)于細(xì)胞IF染色，將爬片用PBS清洗1次，4%多聚甲醛固定10 min，然后用含0.3% Triton X-100的PBS通透10 min，封閉液封閉40 min，一抗孵育30 min(37 ℃)，后與熒光二抗孵育30 min(37 ℃)。在固定、通透、抗原修復(fù)和抗體孵育后，均用PBS充分清洗3次，每次5 min。最后，使用DAPI染細(xì)胞核，并將爬片安裝在載玻片上。

對(duì)于組織石蠟標(biāo)本，在65 ℃烤箱中烤片40 min后，置于二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，再用0.3%Triton X-100通透10 min，于檸檬酸鹽緩沖液 (pH 6.0)中高壓加熱抗原修復(fù)2 min，然后用3%過氧化氫浸泡10 min去除內(nèi)源性過氧化酶，封閉液封閉30 min后加入一抗，4 ℃孵育過夜，最后加入免疫組化試劑盒里的二抗，37 ℃孵育30 min，使用DAPI染細(xì)胞核并快速封片，在通透、抗原修復(fù)和抗體孵育后，均用PBS充分清洗3次，每次5 min。

1.2.3 細(xì)胞核質(zhì)分離和WB

對(duì)于全細(xì)胞提取，細(xì)胞在1×SDS樣品緩沖液裂解，獲得T24和HT29細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液。使用Méndez和Stillman的方法分步提取細(xì)胞[11]，獲得T24和HT29細(xì)胞的分步提取液，細(xì)胞質(zhì)提取液為S1，游離染色質(zhì)為S2，結(jié)合染色質(zhì)為P3，隨后加入SDS裂解液，并在100 ℃下煮沸7 min使其變性。然后，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。為了檢測(cè)DTL蛋白的表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)蛋白α-Tubulin、細(xì)胞核蛋白H3作為內(nèi)參。將PVDF膜用溶于TBST緩沖液的5%脫脂牛奶封閉，并在4 ℃下與在封閉緩沖液中稀釋的一抗孵育過夜，然后用TBST緩沖液洗滌3次。隨后，將膜與HRP標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h，洗滌后加入發(fā)光液，并通過成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。

1.2.4 IHC染色

對(duì)于組織石蠟標(biāo)本的IHC染色，DAB顯色之前所有步驟同IF染色，之后用 PBS洗去二抗，加入DAB顯色液顯色4～5 min，當(dāng)組織呈現(xiàn)褐色時(shí)立即用自來水清洗，放入蘇木素染色液中染色1 min，自來水清洗后瀝干水分，放入分化液中分化20 s，自來水沖洗后反藍(lán)，最后進(jìn)行脫水、透明，中性樹脂快速封片。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察和分析

使用奧林巴斯熒光顯微鏡(BX51)觀察，CellSens Entry軟件保存圖像，Ipwin32軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 DTL在細(xì)胞分裂期與分裂間期的亞細(xì)胞定位

為了探討DTL在細(xì)胞中的表達(dá)定位，使用IF對(duì)T24細(xì)胞進(jìn)行DTL染色(紅)和細(xì)胞核DAPI染色(藍(lán))，并使用Ipwin32軟件將兩者染色合并(Merge)，用圓圈圈出有絲分裂期的細(xì)胞。在T24細(xì)胞有絲分裂間期DTL染色與細(xì)胞核染色I(xiàn)F共定位，即DTL主要表達(dá)于細(xì)胞核，而在T24細(xì)胞有絲分裂的前、中、后期，DTL的表達(dá)位于染色質(zhì)周圍(圖1A)。為進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，在兩種正常細(xì)胞293T、SV-HUC-1和一種胃癌細(xì)胞MKN28進(jìn)行同樣的DTL染色與細(xì)胞核染色，同樣發(fā)現(xiàn)在有絲分裂時(shí)，DTL的表達(dá)位于染色質(zhì)周圍(圖1B)。

A T24細(xì)胞；B 293T、SV-HUC-1、MKN28細(xì)胞圖1 DTL在培養(yǎng)細(xì)胞的有絲分裂期的亞細(xì)胞定位(40×)

2.2 DTL在不同細(xì)胞有絲分裂間期的亞細(xì)胞定位

探索DTL在細(xì)胞中的表達(dá)定位時(shí)，發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的有絲分裂間期DTL染色結(jié)果也存在明顯差異。在有絲分裂間期的正常細(xì)胞293T、SV-HUC-1細(xì)胞，DTL的表達(dá)主要位于細(xì)胞核，而在胃癌MKN28細(xì)胞、MGC803細(xì)胞、膀胱癌T24細(xì)胞，核質(zhì)均表達(dá)，且在胃癌MGC803細(xì)胞質(zhì)表達(dá)更高，而在結(jié)直腸癌HT29的有絲分裂間期，DTL僅在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)(圖2A)。此外，在T24細(xì)胞與HT29細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)分離，采用WB檢測(cè)DTL的表達(dá)，同樣證實(shí)DTL在T24細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均表達(dá)，而在HT29細(xì)胞中僅在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)(圖2B)。為進(jìn)一步探究DTL在其他類型細(xì)胞有絲分裂間期的亞細(xì)胞定位，在小鼠精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中同樣進(jìn)行了DTL與細(xì)胞核染色，分析DTL亞細(xì)胞定位的表達(dá)差異，DTL在小鼠精母細(xì)胞表達(dá)主要位于細(xì)胞核，而DTL的表達(dá)在小鼠精原細(xì)胞表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)(圖2C)。

A 不同細(xì)胞的IF圖片(40×)；B WB檢測(cè)DTL的表達(dá)；C 小鼠生殖細(xì)胞的IF圖片(40×)圖2 DTL在培養(yǎng)細(xì)胞的有絲分裂間期的亞細(xì)胞定位

2.3 DTL在不同組織的亞細(xì)胞定位改變

進(jìn)一步分析不同組織中的DTL表達(dá)。通過IF染色，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸、肺、膀胱的正常組織中，DTL的表達(dá)主要位于細(xì)胞核，結(jié)直腸、肺、膀胱的癌組織中，DTL的表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)(圖3A)。為了排除實(shí)驗(yàn)方法的干擾，通過IHC在肝、胃的癌組織和正常組織中進(jìn)行了DTL染色，進(jìn)一步證實(shí)DTL表達(dá)在正常組織中主要位于細(xì)胞核，在癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，且DTL在癌組織表達(dá)量明顯高于正常組織(圖3B)。最后，在睪丸組織中進(jìn)行IF染色，在精原細(xì)胞中，DTL主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，且越靠近組織中央，細(xì)胞越趨于精子細(xì)胞，DTL在細(xì)胞核中表達(dá)越明顯，在精子細(xì)胞時(shí)完全核表達(dá)，并且表達(dá)量明顯增多(圖3C)。

A 癌和非癌組織的IF圖片；B 癌和非癌組織的IHC圖片；C 人睪丸組織的IF圖片圖3 不同組織中DTL的亞細(xì)胞定位(20×)

3 討論

DTL在 DNA 復(fù)制、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖中起重要作用。研究顯示，DTL在癌組織中的表達(dá)往往高于正常組織[3-5]。本研究中，通過IF與IHC在結(jié)直腸、肝、胃和膀胱組織同樣證實(shí)了相比正常組織，DTL在腫瘤組織中表達(dá)明顯升高。DTL表達(dá)與癌癥中的細(xì)胞周期和DNA復(fù)制相關(guān)途徑有關(guān)，是細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)因子，通過識(shí)別多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白來維持細(xì)胞周期的順利進(jìn)行，抑制DTL的表達(dá)也會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[1-5]。

特定的蛋白質(zhì)只有在特定位置才能發(fā)揮正確的生物學(xué)功能[9]，如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5的定位在細(xì)胞核中，在NIH3T3細(xì)胞周期中亞細(xì)胞定位從以核為主轉(zhuǎn)變?yōu)榘|(zhì)為主，阻止細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5遷移出細(xì)胞核會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期抑制[12]。Merlin蛋白是一種經(jīng)典的腫瘤抑制蛋白，Merlin與細(xì)胞遷移和黏附有關(guān)，這一功能反映在它在質(zhì)膜和已知相互作用伙伴的亞細(xì)胞定位上[13]。DTL作為核基質(zhì)相關(guān)蛋白，其亞細(xì)胞定位主要位于細(xì)胞核中，在細(xì)胞分裂期，DTL定位到染色質(zhì)周圍[6-7]。本實(shí)驗(yàn)采用IF染色在不同細(xì)胞中觀察DTL的亞細(xì)胞定位，首次發(fā)現(xiàn)DTL在不同細(xì)胞和組織中的亞細(xì)胞定位會(huì)發(fā)生改變，在正常細(xì)胞和精子細(xì)胞中，DTL表達(dá)主要位于細(xì)胞核，而在某些分化程度低的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞、精原細(xì)胞中，DTL則主要位于細(xì)胞質(zhì)。這些結(jié)果表明，DTL的質(zhì)核轉(zhuǎn)位可能與細(xì)胞分化程度相關(guān)。此外，根據(jù)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞、精原細(xì)胞與精子細(xì)胞的特性，腫瘤細(xì)胞增殖速度明顯比正常細(xì)胞快，而精原細(xì)胞同樣在進(jìn)行減數(shù)分裂從而產(chǎn)生精子細(xì)胞，精子細(xì)胞不進(jìn)行分裂。以上提示DTL的亞細(xì)胞定位變化可能參與細(xì)胞分化和增殖調(diào)控。

腫瘤細(xì)胞、精原細(xì)胞與正常細(xì)胞、精子細(xì)胞之間增殖速度具有明顯差異是否與DTL亞細(xì)胞定位的轉(zhuǎn)變具有相關(guān)性需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。通過在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)檢索DTL蛋白，分析DTL的序列發(fā)現(xiàn)第197—203基因序列是DTL的核定位信號(hào)，因此，阻斷DTL的核轉(zhuǎn)移信號(hào)是否影響細(xì)胞增殖，影響DTL的生物學(xué)功能，進(jìn)而影響胚胎的發(fā)育、精子的發(fā)生以及腫瘤的發(fā)生、增殖、浸潤(rùn)，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其確切的生物學(xué)意義和具體的機(jī)制。

4 結(jié)論

DTL亞細(xì)胞定位在不同類型細(xì)胞和組織也會(huì)發(fā)生變化，且質(zhì)核轉(zhuǎn)位可能與細(xì)胞分化程度、增殖速度相關(guān)。這項(xiàng)工作為了解DTL的亞細(xì)胞定位及其在細(xì)胞增殖、分化中的潛在作用，以及DTL在癌細(xì)胞與正常細(xì)胞、生殖細(xì)胞的表達(dá)差異提供了新的見解，但其確切的生物學(xué)意義和具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。