趙丹睿 張鳳吉 劉懿瑩 吳一箐 趙夯 廖?？?潘文浩 程建華* 童志前*

（溫州醫(yī)科大學(xué)精神醫(yī)學(xué)學(xué)院，老年研究院，附屬第一醫(yī)院，浙江省阿爾茨海默病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甌江實(shí)驗(yàn)室，溫州 325035）

抑郁癥是一種臨床癥狀表現(xiàn)為情緒低落［1］、快感缺失的常見(jiàn)情感障礙類(lèi)疾?。?］。2020年全球重度抑郁癥患者約為1.93億人，受新冠疫情影響全球預(yù)計(jì)新增5 300萬(wàn)重度抑郁癥患者［3］。中國(guó)重度抑郁癥的終身患病率達(dá)3.3%［4］。抑郁的發(fā)生有多種學(xué)說(shuō)。基于“單胺假說(shuō)”的5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）再攝取抑制劑是臨床使用最廣泛的抗抑郁藥物［5］，然而單胺假說(shuō)無(wú)法解釋藥物作用潛伏期的出現(xiàn)［6］。臨床一線(xiàn)抗抑郁藥物的治療無(wú)效率也達(dá)33%~66%［7］；同時(shí)還出現(xiàn)藥物抵抗、性功能障礙、低鈉血癥等副作用［8］。近幾十年來(lái)，炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是重度抑郁發(fā)生的關(guān)鍵原因［9］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，外周炎癥因子，如IL-1β與IL-6，可穿過(guò)血腦屏障［10］，從而誘發(fā)抑郁［11-12］。

低濃度氣態(tài)甲醛重復(fù)暴露誘發(fā)小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為［13］；液態(tài)甲醛注射的小鼠也出現(xiàn)抑郁及焦慮樣行為［13］。以上研究表明，甲醛可誘發(fā)小鼠抑郁樣行為。離體實(shí)驗(yàn)顯示甲醛可直接刺激免疫細(xì)胞釋放大量的炎癥因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α［14］。以上研究說(shuō)明，甲醛參與炎癥因子的生成。目前，注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）被廣泛用來(lái)構(gòu)建抑郁模型［15］，外周腹腔注射LPS具有操作便捷、安全性較高，且可產(chǎn)生中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。但單次注射LPS誘發(fā)的抑郁樣行為僅持續(xù)24 h左右［16］，而重復(fù)多次注射LPS可制備出慢性抑郁小鼠模型，癥狀持續(xù)較為持久［17］，且該模型與臨床抑郁患者的癥狀更為相似。雖然外周注射LPS誘發(fā)慢性抑郁的機(jī)制不清，但研究表明LPS可上調(diào)血液中的氨基脲敏感胺氧化酶（semicarbazidesensitive amine oxidase，SSAO，一種甲醛生成酶）的活力［18］。這提示，LPS可能激活SSAO產(chǎn)生甲醛，而甲醛直接刺激炎癥因子釋放，誘發(fā)抑郁。

近20年來(lái)，光生物調(diào)節(jié)作用（photobiomodulation，PBM）療法逐步被用于臨床治療抑郁等心理疾病［19］。如紅光（red light，RL）/近外紅光（near-infrared，NIR）具有抗炎作用［20］，可減少小鼠抑郁樣行為［20-21］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，630 nm紅光照射作為一種非侵入性手段，可以有效激活甲醛脫氫酶（formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)DH），并消除小鼠腦中蓄積的甲醛［22］?；A(chǔ)和臨床結(jié)果都顯示，紅光具有良好的穿透性，紅光照射未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，是一種潛在的臨床治療抑郁的方法。

基于上述研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)探索甲醛是否是LPS誘發(fā)抑郁發(fā)生的關(guān)鍵觸發(fā)因子，630 nm紅光療法是否對(duì)慢性抑郁模型小鼠的抑郁樣行為具有改善效應(yīng)，從而為臨床使用紅光療法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性C57BL/6J小鼠，9周齡，無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)。動(dòng)物進(jìn)入動(dòng)物房后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后分籠喂養(yǎng)，每籠4只，室內(nèi)溫度為（25±2）℃，12 h光照周期，照明時(shí)間模擬白晝（每日7:30~19:30），每周兩次更換墊料，并及時(shí)予以充足的飼料及水。全部實(shí)驗(yàn)根據(jù)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)指導(dǎo)原則進(jìn)行，倫理批號(hào)：xmsq20022-1135。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

Mouse IL-1β ELISA Kit，碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：PI301。Rabbit Mouse IL-6 ELISA Kit，碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)PI326。Mouse TNF-α ELISA Kit，碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)PT512。小鼠氨基脲敏感胺氧化酶（SSAO）酶聯(lián)試劑盒/Mouse SSAO ELISA kit，北京奇松生物科技有限公司，貨號(hào)：QS451642-96T。Mouse IL-1β ELISA Kit，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)E-EL-M0037c。Mouse TNF-α ELISA Kit，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)E-EL-M3063。LPS（reagent grade），碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)ST1470。Na-FA熒光探針，濟(jì)南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)成像中心贈(zèng)送。甲醛，美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司，貨號(hào)F1635。DMSO，北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)D8731。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)耗材

一次性丁腈手套，Biosharp，貨號(hào)BC010-L。1.5 ml EP管，Labselect，貨號(hào)MCT-001-150。15 ml離心管，Labselect，貨號(hào)CT-002-15A。30 ml離心管，Labselect，貨號(hào)CT-002-50A。200 μl黃色袋裝吸頭，Biosharp，貨號(hào)BS-200-T。1 000 μl藍(lán)色袋裝吸頭，Biosharp，貨號(hào)BS-1000-T。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

移液槍?zhuān)聡?guó) Eppendorf公司，型號(hào)31110008。酶標(biāo)儀，美國(guó) Molecular DEVICES公司，型號(hào)Spectra Max i3x。多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司，型號(hào)Synergy Neo2。超低溫冰箱，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，型號(hào)905。渦旋振蕩器，海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)VORTEX-5。凈化工作臺(tái)，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司，型號(hào)SW-CJ-2FD。微量高速冷凍離心機(jī)，瑞沃德生命科技有限公司，型號(hào)M1324R。超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司，型號(hào)SCIENTZ-IID。紅光治療儀（專(zhuān)利號(hào)：ZL 2015 1 0354267.5.）［22］。小動(dòng)物活體光學(xué)成像，PerkinElmer，型號(hào)IVIS Spectrum。

1.4 小鼠分組

將雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3組：a. 溶劑對(duì)照組（Con組，僅腹腔注射PBS）；b. LPS組，按濃度梯度進(jìn)行腹腔注射LPS；c. 630 nm紅光治療組，與LPS相同模式建立抑郁模型，并在LPS注射1周后使用630 nm LED-RL（0.5 mW/cm2）照射，每周持續(xù)5 d，每次30 min，與下一周照射之間間隔2 d。每組12只，分3籠飼養(yǎng)，每籠4只標(biāo)尾并記錄。腹腔注射時(shí)間均為早上9點(diǎn)，紅光治療時(shí)間為腹腔注射后4 h，即當(dāng)天的下午1點(diǎn)。每周最后一天進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行4周。

1.5 LPS誘導(dǎo)慢性抑郁模型的構(gòu)建

LPS腹腔注射是構(gòu)建抑郁樣模型的常見(jiàn)方法之一，具有操作簡(jiǎn)單快捷、致死率低等優(yōu)勢(shì)。外周注射LPS可參與中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)，由外周炎癥導(dǎo)致中樞神經(jīng)炎癥的發(fā)生以誘導(dǎo)抑郁模型的建立，符合由外周炎癥誘發(fā)抑郁的臨床疾病特征。由于單次注射LPS后，小鼠可出現(xiàn)急性抑郁樣行為，在24 h左右出現(xiàn)頂峰，后逐漸消退［16］，同時(shí)為避免LPS引發(fā)的敗血癥等不良反應(yīng)以及小鼠對(duì)相同濃度LPS產(chǎn)生耐受性［23］，本實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)多次注射濃度梯度LPS的方式來(lái)構(gòu)建持續(xù)慢性L(fǎng)PS抑郁模型［17］。實(shí)驗(yàn)共注射4周LPS。前2周每周的第3~5天連續(xù)注射3 d（0.208/0.415/0.83 mg/kg），與下一周注射之間間隔4 d；后2周每周的第3~6天連續(xù)注射4 d（0.208/0.415/0.83/0.83 mg/kg），與下一周注射之間間隔3 d。

1.6 抑郁樣行為學(xué)評(píng)價(jià)

1.6.1 糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)（sucrose preference test，SPT）

糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)可以客觀反映抑郁癥動(dòng)物快感缺失表現(xiàn)［13］。造模前給小鼠雙瓶供水24 h（1%濃度葡萄糖150 ml與清水150 ml），12 h時(shí)將清水與1%葡萄糖溶液交換位置以消除小鼠對(duì)于瓶子位置的偏愛(ài)。禁水禁食24 h后再度給予水150 ml與1%濃度葡萄糖150 ml并持續(xù)24 h。24 h糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)前后雙瓶分別稱(chēng)重并計(jì)算糖水偏愛(ài)系數(shù)，糖水偏愛(ài)系數(shù)為糖水?dāng)z入量/（糖水?dāng)z入量+清水?dāng)z入量）×100%。

1.6.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)小鼠自發(fā)活動(dòng)行為的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)［13］。實(shí)驗(yàn)裝置為小鼠曠場(chǎng)反應(yīng)箱規(guī)格為50 cm×50 cm×40 cm（長(zhǎng)×寬×高），利用行為學(xué)軟件框出中間區(qū)域，小鼠可在箱內(nèi)自由活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，開(kāi)啟攝像，將小鼠按同一個(gè)方向置于曠場(chǎng)箱底部中央?yún)^(qū)域，使其適應(yīng)1 min后正式記錄軌跡5 min，進(jìn)入中間區(qū)域、中心區(qū)停留時(shí)間等數(shù)據(jù)均由軟件設(shè)置。對(duì)下一只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，先去除排泄物，用75%酒精擦拭裝置箱，再以干凈紙巾擦干，避免實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)原有動(dòng)物氣味對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

1.6.3 強(qiáng)迫游泳測(cè)試（forced swimming test，F(xiàn)ST）

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是有效評(píng)估小鼠絕望行為的行為學(xué)檢測(cè)方法［13］。準(zhǔn)備高50 cm、直徑20 cm的圓柱形玻璃水箱，注水至小鼠在游泳期間無(wú)法用腳或尾巴接觸水箱底部且確保老鼠不能逃脫的高度。溫度計(jì)測(cè)量水溫（23~25°C），使用淺色分隔板分離各個(gè)水箱以確保小鼠之間無(wú)法互相觀望。實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間6 min，記錄后4 min小鼠在水中總不動(dòng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即取出小鼠放在吸水紙上吸干后放回鼠籠。

1.6.4 懸尾實(shí)驗(yàn)（tail suspension test，TST）

懸尾實(shí)驗(yàn)是有效評(píng)估小鼠絕望行為的行為學(xué)檢測(cè)方法［13］。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先在小鼠尾巴距尾尖2 cm處（防止小鼠順膠布攀爬）粘一條膠布，用架子夾住膠布，并懸掛至距桌面30 cm高處，開(kāi)啟行為學(xué)檢測(cè)軟件并攝像記錄，總懸掛時(shí)間為6 min，記錄后4 min內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間（不動(dòng)狀態(tài)即小鼠停止掙扎不動(dòng)或無(wú)任何活動(dòng)）。實(shí)驗(yàn)完成后仔細(xì)清理懸尾箱，并用75%的酒精來(lái)擦拭懸尾箱底及內(nèi)壁，避免遺留氣味對(duì)下次實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。

1.7 甲醛檢測(cè)及甲醛相關(guān)酶檢測(cè)

1.7.1 整腦甲醛熒光成像

小鼠腹腔內(nèi)注射5 μmol/L的Na-FA（甲醛熒光探針），30 min后用1.25%三溴乙醇溶液麻醉，將小鼠頸椎脫臼處死，取出腦組織，PBS沖洗表面血液及雜質(zhì)。將同組的腦組織置于同一玻璃器皿中，不同組之間進(jìn)行區(qū)分標(biāo)記，吸干腦組織周?chē)趾蠓湃氤上癜迪淦脚_(tái)。以上步驟均在冰上避光操作。選擇激發(fā)和發(fā)射濾片（λex/λem=430 nm/540 nm），調(diào)整軟件進(jìn)行成像［22］。

1.7.2 血液與腦組織內(nèi)甲醛定量檢測(cè)（Na-FA熒光定量法）

a. 樣本制備

第2、3、4周行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后12 h將每組3~6只小鼠稱(chēng)重，根據(jù)小鼠體重腹腔注射對(duì)應(yīng)體積的3%三溴乙醇麻醉液（0.1 ml，5 g）。待小鼠肌肉松弛、反射消失后，剪去胡須及眼周毛發(fā)眼球取血，將血液收集到EP管中，冰上快速剝離腦組織，取出皮層、海馬、中腦備用。組織樣本保存于-80℃低溫冰箱。小鼠腦組織稱(chēng)重后，按1∶9的比例加入PBS，并用超聲波破碎儀破碎至勻漿至無(wú)明顯塊狀組織為止，在此期間設(shè)置低溫高速離心機(jī)，使其預(yù)冷至4℃后將組織勻漿離心（12 000 r/min×30 min）后取上清，并將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中。

b. 操作步驟

使用黑色96孔板，每空分別加入40 μl小鼠組織樣本或甲醛標(biāo)準(zhǔn)品、120 μl PBS、40 μl Na-FA工作液。在室溫環(huán)境中孵育30 min后檢測(cè)熒光強(qiáng)度（λex/λem=440 nm/543 nm）。根據(jù)甲醛標(biāo)準(zhǔn)品熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并計(jì)算小鼠組織樣本甲醛濃度［22］。

1.7.3 血清SSAO檢測(cè)

根據(jù)SSAO試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)品和樣本孔中每孔50 μl標(biāo)準(zhǔn)品或待檢樣品，后依次按照說(shuō)明加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μl、底物50 μl、終止液50 μl，15 min內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（A）值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，按照曲線(xiàn)方程計(jì)算各樣本中SSAO的濃度。

1.8 小鼠腦組織相關(guān)炎癥因子檢測(cè)

1.8.1 腦組織IL-1β活性檢測(cè)

根據(jù)Mouse IL-1β ELISA Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。小鼠大腦皮層樣本以原液作為樣品進(jìn)行檢驗(yàn)；海馬樣本用樣品分析緩沖液1∶1稀釋?zhuān)⒂脴?biāo)準(zhǔn)平稀釋液補(bǔ)至200 μl，即50 μl原液加入50 μl樣品分析緩沖液，后加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)瓶稀釋液體；中腦樣本以樣品分析緩沖液1∶1稀釋。每孔依次按說(shuō)明加入樣品或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（100 μl/孔）、生物素化抗體100 μl/孔、辣根過(guò)氧化物酶（100 μl/孔）、顯色劑TMB溶液（100 μl/孔）、終止液（50 μl/孔），每次加入前均洗板5次。最后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)公式計(jì)算待測(cè)樣本中的IL-1β活性。

1.8.2 腦組織TNF-α活性檢測(cè)

根據(jù)Mouse TNF-α ELISA Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)操作同上。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)分析多組之間比較采用One-way ANOVA分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS注射第一周誘發(fā)抑郁樣行為并伴隨腦甲醛蓄積和炎癥反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1a。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射LPS 1 h后，小鼠腦部甲醛即整體升高（圖1b），一周后行為學(xué)結(jié)果表明LPS實(shí)驗(yàn)組小鼠即出現(xiàn)抑郁樣行為：LPS組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中總運(yùn)動(dòng)距離、中心區(qū)運(yùn)動(dòng)距離顯著減少（圖1c，d），懸尾不動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著差異（圖1e），強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增加（圖1f），糖水偏好系數(shù)顯著降低（圖1g）。

注射LPS 1周后，皮層甲醛含量無(wú)明顯變化（圖1h），海馬、中腦中的甲醛含量均顯著上升（圖1i，j）。第1周LPS組血液中SSAO含量較Con組顯著上升（圖1k）。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，皮層、海馬、中腦中TNF-α因子也均較Con組顯著上升（圖1l~n），IL-6在中腦中顯著上升（圖1o）。

以上結(jié)果表明，LPS一周即誘發(fā)腦部特別是中腦甲醛蓄積、炎癥因子增加，并出現(xiàn)抑郁樣行為。

2.2 630 nm紅光照射改善第二、三周LPS誘發(fā)的炎癥反應(yīng)、甲醛蓄積、抑郁樣行為

每周各組藥物及紅光治療方案見(jiàn)圖2a，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第二周起，每周第2~6天進(jìn)行紅光照射治療，每周間隔2 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射LPS兩周后，較Con組，LPS組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中總運(yùn)動(dòng)距離、中心區(qū)運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著降低（圖2b，c）。較LPS組，紅光治療組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中總運(yùn)動(dòng)距離、中心區(qū)運(yùn)動(dòng)時(shí)間均顯著升高（圖2b，c）。較Con組，LPS組懸尾不動(dòng)時(shí)間無(wú)明顯變化，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間顯著增長(zhǎng)；較LPS組，紅光治療組懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中總不動(dòng)時(shí)間顯著減少（圖2d，e）。小鼠運(yùn)動(dòng)路線(xiàn)圖見(jiàn)圖2f。

注射LPS 3周后，較Con組，LPS組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中總運(yùn)動(dòng)距離、中心區(qū)運(yùn)動(dòng)距離顯著減少。較LPS組，紅光治療組總運(yùn)動(dòng)距離顯著增加，中心區(qū)運(yùn)動(dòng)距離無(wú)顯著變化（圖2g，h）。較Con組，LPS組懸尾不動(dòng)時(shí)間顯著增加，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著差異；較LPS組，紅光治療組懸尾不動(dòng)時(shí)間顯著減少（圖2i），強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著差異（圖2j）。小鼠運(yùn)動(dòng)路線(xiàn)圖見(jiàn)圖2k。較Con組，LPS組糖水偏好系數(shù)顯著降低，紅光治療組則無(wú)顯著差異（圖2l）。

中腦甲醛檢測(cè)中，第2周LPS組中腦甲醛顯著低于Con組，紅光治療組中腦甲醛則無(wú)明顯差異（圖2m）。第3周的甲醛相關(guān)檢測(cè)中，LPS組小鼠中腦甲醛含量較Con組顯著上升（圖2n）。

以上結(jié)果表明，重復(fù)濃度梯度注射LPS小鼠持續(xù)表現(xiàn)抑郁樣行為，中腦甲醛發(fā)生波動(dòng)變化并最終蓄積，紅光照射則顯著改善小鼠抑郁樣行為，維持中腦甲醛正常代謝。

Fig. 1 LPS-injected mice showed formaldehyde (FA) accumulation, inflammation reaction, and depressive-like behaviors in the first week

Fig. 2 Red light treatment alleviated the depressive behaviors in LPS-injected mice in 2nd and 3rd week

Fig. 3 Red light treatment inhibited neuroinflammation and alleviated depressive behaviors in LPS-injected mice in the 4th week by scavenging FA in the hippocampus and midbrain

Fig. 4 The correlation between the levels of IL-1β, TNF-α, or FA and indexes of depressive-like behaviors

Fig. 5 Mechanism of red light-alleviated depression-like behaviors in LPS-induced chronic depression model mice by scavenging midbrain FA levels

2.3 630 nm紅光照射改善第四周LPS誘發(fā)炎癥反應(yīng)、甲醛蓄積、抑郁樣行為

第4周行為學(xué)檢測(cè)表明，較Con組，LPS組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中總運(yùn)動(dòng)距離、中心區(qū)運(yùn)動(dòng)距離顯著降低。較LPS組，紅光治療組總運(yùn)動(dòng)距離、中心區(qū)運(yùn)動(dòng)距離均無(wú)顯著差異（圖3a，b）。小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡見(jiàn)圖3c。較Con組，LPS組懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增加；紅光治療組懸尾、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間較LPS組顯著減少（圖3d，e）。

注射LPS 4周后，甲醛相關(guān)檢測(cè)中，LPS組小鼠海馬甲醛含量呈上升趨勢(shì)，中腦甲醛含量較Con組顯著上升，紅光治療組小鼠較LPS組在海馬、中腦中甲醛含量均顯著下降（圖3f，g）。

LPS組小鼠血液中SSAO含量顯著下降，紅光治療組較LPS則無(wú)顯著差異（圖3h）。

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS組小鼠海馬IL-1β顯著升高，紅光治療組小鼠則較LPS組顯著下降（圖3i）。較Con組，LPS組中腦IL-1β、TNF-α、IL-6因子均顯著上升；較LPS組，紅光治療組中腦中IL-1β、TNF-α因子均較LPS組顯著下降（圖3j~l）。

以上結(jié)果表明，第4周LPS注射小鼠持續(xù)表現(xiàn)抑郁樣行為，紅光治療顯著消除中腦甲醛蓄積，并抑制神經(jīng)炎癥發(fā)生，改善小鼠抑郁樣行為。

2.4 LPS誘發(fā)蓄積的甲醛和炎癥因子、抑郁樣行為正相關(guān)

對(duì)甲醛與TNF-α、IL-1β進(jìn)行回歸分析發(fā)現(xiàn)，中腦甲醛含量與TNF-α、IL-1β水平正相關(guān)（圖4a，b），這提示了中腦甲醛蓄積與神經(jīng)炎癥發(fā)生高度相關(guān)。中腦甲醛含量與小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中心區(qū)運(yùn)動(dòng)距離（圖4c）、懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間（圖4d）負(fù)相關(guān)，這提示了中腦甲醛蓄積與小鼠抑郁樣行為高度相關(guān)。同時(shí)，中腦IL-1β水平與小鼠曠場(chǎng)中心區(qū)運(yùn)動(dòng)距離也成負(fù)相關(guān)（圖4e），這提示了中腦炎癥反應(yīng)水平與小鼠抑郁樣行為高度相關(guān)。對(duì)中腦甲醛含量的進(jìn)一步分析中，在LPS重復(fù)注射的1~4周內(nèi)，LPS組中腦甲醛含量在第1周急性升高，并在第3、4周蓄積；紅光治療組中腦甲醛含量則均與Con無(wú)明顯差異（圖4f）。

以上結(jié)果提示，在LPS誘導(dǎo)的小鼠慢性抑郁模型中，中腦內(nèi)源甲醛蓄積是抑郁發(fā)生的促發(fā)因素，誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生并導(dǎo)致小鼠抑郁樣行為。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要聚焦兩個(gè)尚未闡明的問(wèn)題：一是甲醛與SSAO在小鼠慢性抑郁模型中的變化及作用機(jī)制；二是630 nm紅光是否通過(guò)清除甲醛蓄積改善抑郁樣行為。結(jié)果表明，LPS通過(guò)激活SSAO急性生成大量甲醛，并主要蓄積于中腦，急性升高的內(nèi)源甲醛激活腦膠質(zhì)細(xì)胞等生成IL-1β、TNF-α等炎癥因子，產(chǎn)生神經(jīng)炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致抑郁樣行為的發(fā)生，630 nm紅光照射則通過(guò)激活FDH清除急性升高的甲醛，穩(wěn)定內(nèi)源甲醛代謝，抑制神經(jīng)炎癥發(fā)生，改善抑郁癥狀（圖5）。這提示蓄積的腦內(nèi)源甲醛可能是治療抑郁的新靶點(diǎn)，消除腦內(nèi)源甲醛可減輕其產(chǎn)生的一系列神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激等反應(yīng)，而納米紅光可清除甲醛蓄積，對(duì)抑郁具有改善作用。

3.1 甲醛可能是觸發(fā)抑郁發(fā)生的關(guān)鍵分子

現(xiàn)有的抑郁癥的相關(guān)研究并未過(guò)多關(guān)注SSAO以及甲醛的變化。研究表明，腹腔注射的LPS僅有極少量能夠穿透血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）［24］，重復(fù)多次外周注射LPS即使破壞BBB，也并不會(huì)增加對(duì)中樞對(duì)LPS的攝取。這說(shuō)明外周注射的LPS并不直接在腦區(qū)內(nèi)發(fā)揮作用來(lái)誘發(fā)抑郁行為。進(jìn)一步分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，外周注射LPS主要引起腦毛細(xì)血管后小靜脈因SSAO/血管黏附分子1（VAP-1）導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞的黏附，而中性粒細(xì)胞并未進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)［25-26］。而大量證據(jù)表明外周注射LPS后激活了大腦免疫反應(yīng)［27-28］，誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子在腦中的表達(dá)［29］?，F(xiàn)有研究表明，LPS誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)炎癥與外周炎癥機(jī)制不同，SSAO可能在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要作用，且神經(jīng)炎癥的發(fā)生可能與SSAO的脫氨基產(chǎn)物甲醛［30］有關(guān)。而LPS可誘導(dǎo)SSAO活性上升，其分解單胺等底物產(chǎn)生的甲醛等產(chǎn)物水平急劇上升［18］。SSAO分解內(nèi)源甲胺脫氨基生成甲醛，是內(nèi)源甲醛的重要來(lái)源，同時(shí)生成過(guò)氧化氫、一氧化氮（NO）等產(chǎn)物［31］，作為一種生理性小分子物質(zhì)［32］，甲醛可穿過(guò)BBB［33］，并在腦區(qū)參與神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激［14，34］等反應(yīng)，從而影響認(rèn)知及空間記憶。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)整腦甲醛熒光成像顯示注射LPS 1 h后中腦內(nèi)甲醛含量顯著上升（圖1b），且甲醛與炎癥因子的回歸分析（圖4a，b）顯示中腦甲醛含量與炎癥因子濃度呈正相關(guān)，均支持了上述觀點(diǎn)。另外，甲醛暴露不僅將增強(qiáng)小鼠前額葉皮層的氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)IL-17、IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)小鼠大腦的神經(jīng)炎癥［35］，LPS注射且甲醛暴露小鼠的巨噬細(xì)胞模型中促炎細(xì)胞因子釋放增加、NO分泌升高［14］，均證實(shí)過(guò)量甲醛對(duì)于腦膠質(zhì)細(xì)胞的刺激不但可促進(jìn)炎癥因子的釋放，還消除IL-1β的神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)而加劇神經(jīng)炎癥的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，中腦中甲醛含量與IL-1β、TNF-α水平呈正相關(guān)，內(nèi)源甲醛蓄積參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

3.2 慢性抑郁小鼠血漿SSAO的變化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)血清SSAO酶的檢測(cè)中，雖然第1周LPS組SSAO含量顯著上升，但在第4周的血漿SSAO含量檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)LPS組血漿SSAO含量較Con組顯著下降。同時(shí)，臨床研究也發(fā)現(xiàn)抑郁患者血清SSAO活性的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過(guò)治療干預(yù)的重度抑郁患者SSAO活性顯著降低［36］，在大鼠急慢性炎癥模型中同樣發(fā)現(xiàn)了SSAO活性的下降［37］。由于SSAO此前并未在抑郁癥、神經(jīng)炎癥等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，因此相關(guān)機(jī)制并不明了。目前可能針對(duì)抑郁及炎癥模型中SSAO活性及含量降低可能的解釋有：a. SSAO活性下降是對(duì)單胺含量下降的適應(yīng)性結(jié)果［36］；b. SSAO在炎癥發(fā)生早期發(fā)揮作用，而隨著膜結(jié)合形式的VAP-1在介導(dǎo)中性粒細(xì)胞外滲后失活或脫落［37］。然而由于缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)支持，上述假說(shuō)仍無(wú)從證實(shí)?？梢钥隙ǖ氖?，大量研究表明，在炎癥早期SSAO/VAP-1在外周炎癥部位被激活［38］，并介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的黏附、外滲，在側(cè)腦室注射LPS誘發(fā)的神經(jīng)炎癥中，腦后微血管SSAO/VAP-1同樣被激活［18，25］。本實(shí)驗(yàn)中整腦甲醛熒光成像同樣表明，在實(shí)驗(yàn)組注射LPS 1 h及1周后，整腦中，作為SSAO代謝產(chǎn)物之一的甲醛含量上升，佐證了LPS單次注射后SSAO活性急性上升，并參與LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)性炎癥的觀點(diǎn)［39］。并且它的產(chǎn)物——甲醛是誘發(fā)炎癥因子上升的觸發(fā)因素。

3.3 炎癥因子參與抑郁機(jī)制的多條通路

近來(lái)，神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是抑郁癥的特征性反應(yīng)之一［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子激活的犬尿氨酸通路對(duì)5-HT、下丘腦-垂體-腎上腺素（hypothalamus-pituitary-adrenocortical，HPA）軸活性、海馬神經(jīng)發(fā)生的影響［40］。一方面，TNF-α通過(guò)激活吲哚胺2,3-雙加氧酶，分解生成5-HT的底物色氨酸代謝為犬尿氨酸［41］，從而減少5-HT生成，表現(xiàn)抑郁癥狀［42］。另一方面，炎癥因子已被證實(shí)可直接刺激位于中腦的下丘腦，并過(guò)度激活HPA軸，促進(jìn)糖皮質(zhì)激素的大量釋放［43］，IL-1β可誘導(dǎo)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的過(guò)度釋放從而促進(jìn)糖皮質(zhì)激素受體抵抗［12］，進(jìn)而損害HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。同時(shí)糖皮質(zhì)激素的促炎特性也得到越來(lái)越多證據(jù)的支持［44］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，中腦、海馬甲醛蓄積導(dǎo)致TNF-α、IL-1β、IL-6的上升，參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

3.4 630 nm紅光調(diào)節(jié)甲醛代謝抑制神經(jīng)炎癥

630 nm紅光照射作為一種新型PBM治療方法已經(jīng)被用于挽救認(rèn)知與記憶［22，45］。前期研究已表明，使用波長(zhǎng)630 nm的LED-RL（0.5 mW/cm2）能穿透小鼠的頭骨和腹部，其中顱骨的穿透率是49%，腹部的穿透率為43%，且無(wú)明顯熱效應(yīng)［22］。目前PBM治療抑郁的最佳參數(shù)尚未明確，雖然近外紅光顯示有更強(qiáng)的穿透力，但其對(duì)大腦的熱效應(yīng)明顯，不利于臨床治療使用［46］。另外，近紅外光的臨床試驗(yàn)中，有頭痛、眼疲勞、睡眠不安和失眠等不良反應(yīng)的發(fā)生［47］。

現(xiàn)有對(duì)紅光治療抑郁的研究，主要是其對(duì)線(xiàn)粒體電子傳遞鏈的末端酶細(xì)胞色素c的影響。紅光可通過(guò)提高細(xì)胞色素c的活性，促使NO從雙核中心解離，增加線(xiàn)粒體膜電位，進(jìn)而促進(jìn)ATP的釋放，增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)和代謝能力［20］。本研究主要探究紅光激活甲醛脫氫酶，降解甲醛，減輕神經(jīng)炎癥的通路。在本研究中630 nm紅光改善小鼠抑郁樣行為的機(jī)制主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面。一是，630 nm紅光照射直接激活FDH及時(shí)清除急性上升的甲醛［22］。本實(shí)驗(yàn)治療組結(jié)果表明，激活FDH不僅在抑郁癥病程早期避免了高濃度甲醛的蓄積，避免參與誘發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)、影響神經(jīng)細(xì)胞代謝產(chǎn)生神經(jīng)毒性，同時(shí)也改善了抑郁癥病程后期因LPS重復(fù)注射導(dǎo)致甲醛反復(fù)升高而造成的腦部甲醛異常蓄積的狀況。二是，630 nm紅光照射激活細(xì)胞色素c［19］，挽救了因內(nèi)源甲醛被神經(jīng)元細(xì)胞分解代謝而產(chǎn)生的甲酸鹽對(duì)細(xì)胞色素c的抑制作用［48］，避免糖酵解持續(xù)升高導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞毒性［49］。本研究發(fā)現(xiàn)630 nm紅光治療照射1周后即改善小鼠抑郁樣行為，因此在抑郁癥早期干預(yù)中可能更具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

單次LPS外周腹腔注射激活SSAO導(dǎo)致小鼠腦部甲醛急性上升，重復(fù)多次LPS外周注射導(dǎo)致小鼠中腦、海馬甲醛蓄積，甲醛作為抑郁發(fā)生的促發(fā)因素參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)、產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導(dǎo)致小鼠抑郁樣行為。630 nm紅光照射消除甲醛蓄積，并抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，改善小鼠抑郁樣行為。因此，紅光療法，一種無(wú)創(chuàng)物理療法，有可能成為臨床抑郁干預(yù)的新策略。