王猛 李曉琴 高斌

（北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，其占比約90%。根據(jù)最新全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，HCC已成為全球第六大最常診斷的癌癥和第三大癌癥死亡原因，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)［1-2］。在中國(guó)，HCC是中國(guó)第四大常見(jiàn)癌癥和第二大癌癥相關(guān)死亡原因［3］，嚴(yán)重威脅中國(guó)人民的生命和健康。流行病學(xué)調(diào)查顯示，慢性肝炎和肝硬化是全球范圍內(nèi)誘發(fā)HCC的主要風(fēng)險(xiǎn)因素［4］。除此之外，由代謝綜合征、肥胖、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝等風(fēng)險(xiǎn)因素誘發(fā)的HCC患病率正逐年增加，并在未來(lái)可能成為全球HCC發(fā)生的主要原因［5］。從分子角度，HCC是由多種基因組和表觀基因組改變的累積引起。其中常見(jiàn)的包括TERT啟動(dòng)子、AXIN1、TP53和CTNNB1的致癌突變，染色體1q、8q的擴(kuò)增，8p、22p的丟失等［6］。這些發(fā)生遺傳改變的基因往往與Wnt-β-catenin、細(xì)胞周期控制、AKT-mTOR、MAPK等通路有關(guān)［7］。突變特征分析也表明，一些誘發(fā)DNA突變的風(fēng)險(xiǎn)因素如飲酒、吸煙以及黃曲霉毒素B1暴露等，也與已知基因的致癌突變相關(guān)［8］。這似乎也表明，肝臟雖然可以在體內(nèi)起到解毒作用，但這些有毒代謝物也可以誘導(dǎo)相關(guān)基因的驅(qū)動(dòng)突變進(jìn)而損害肝細(xì)胞基因組，從而導(dǎo)致癌變。

目前用于HCC分型的系統(tǒng)主要基于腫瘤負(fù)荷，在臨床上，巴塞羅那臨床肝癌分期系統(tǒng)是迄今為止預(yù)測(cè)HCC預(yù)后和指導(dǎo)選擇治療干預(yù)措施最常用的模型［9］。而中國(guó)則根據(jù)本國(guó)國(guó)情及實(shí)踐積累，依據(jù)患者體力活動(dòng)狀態(tài)、肝腫瘤及肝功能情況，提出了中國(guó)肝癌分期系統(tǒng)，共分為四期［10］。但值得注意的是，這些分期系統(tǒng)雖然對(duì)治療方案的選擇和預(yù)后評(píng)估至關(guān)重要，但它們不足以描述影響預(yù)后和治療反應(yīng)的生物學(xué)和分子特征［11］。因此十分必要開(kāi)發(fā)一個(gè)HCC精確的分子分類系統(tǒng)。

隨著高通量技術(shù)的不斷發(fā)展和其成本的下降，癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、國(guó)際癌癥基因組聯(lián)盟（International Cancer Genome Consortium，ICGC）和腫瘤細(xì)胞系的百科全書（Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE）等國(guó)際合作項(xiàng)目已收集了同一癌癥患者隊(duì)列不同層次的組學(xué)數(shù)據(jù)。這為癌癥分子分型提供重要依據(jù)，并能夠很好地反映不同亞型下癌癥生物學(xué)背景的差異，對(duì)癌癥的治療有著重要影響。單一組學(xué)的研究雖然可以單向揭示腫瘤大量信息（如轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以描述癌癥之間基因表達(dá)差異），但癌癥與宿主之間相互作用、癌癥內(nèi)部分子之間相互作用以及不同組學(xué)之間關(guān)聯(lián)需要多維方法來(lái)描繪。因此，多組學(xué)整合研究（即整合兩個(gè)或多個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、可視化和解釋）被認(rèn)為是深入了解癌癥病發(fā)機(jī)制和癌癥異質(zhì)性最有前景的工具［12-13］。本文總結(jié)了當(dāng)前HCC多組學(xué)分層策略和相關(guān)研究進(jìn)展。

1 HCC的異質(zhì)性

HCC是一種在病理和分子水平上高度異質(zhì)性的疾病，這種異質(zhì)性可能源于不同的風(fēng)險(xiǎn)因素、遺傳事件、基因表達(dá)模式、激活的通路、免疫浸潤(rùn)程度或腫瘤間質(zhì)變化，其大致可分為瘤內(nèi)異質(zhì)性和瘤間異質(zhì)性［14］。多種組學(xué)測(cè)序和單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展能更加深入了解HCC腫瘤的異質(zhì)性［15］。Losic等［16］采集了來(lái)自14名HCC患者的71個(gè)區(qū)域樣本，對(duì)其進(jìn)行了DNA測(cè)序、RNA-seq和TCR-seq來(lái)研究HCC瘤內(nèi)異質(zhì)性。他們發(fā)現(xiàn)，在同一腫瘤內(nèi)部的抗原表達(dá)，免疫浸潤(rùn)水平均有顯著差異，其中區(qū)域性克隆免疫反應(yīng)對(duì)HCC瘤內(nèi)異質(zhì)性的形成起著重要作用。為了以更高的分辨率了解這些數(shù)據(jù)，該團(tuán)隊(duì)對(duì)2名HCC患者中不同區(qū)域內(nèi)的腫瘤進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，其結(jié)果進(jìn)一步表明了即使在同一結(jié)節(jié)內(nèi)距離較遠(yuǎn)的兩個(gè)腫瘤組織，其激活的轉(zhuǎn)錄途徑也存在著顯著差異。

實(shí)際上，腫瘤異質(zhì)性被認(rèn)為是多種藥物在癌癥臨床試驗(yàn)中失敗以及對(duì)現(xiàn)有藥物出現(xiàn)耐藥性的主要原因。Gao等［17］對(duì)10名接受根治性切除術(shù)的HCC患者的55個(gè)區(qū)域進(jìn)行采樣和低傳代培養(yǎng)，并對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序、拷貝數(shù)分析和高通量藥物篩選。發(fā)現(xiàn)其中只有4個(gè)樣本的亞區(qū)檢測(cè)到FGF19、DDR2、PDGFRA和TOP1等基因改變并對(duì)相應(yīng)的靶向治療藥物敏感。而索拉非尼作為目前全球針對(duì)晚期HCC的一線治療藥物［18］，盡管它可以略微延長(zhǎng)晚期HCC患者生存率，但由于不同患者的腫瘤之間相關(guān)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)藥物代謝、信號(hào)通路的激活或失活、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間特性等具有一定差異，使其在大量的患者中觀察到其藥效性受到了不同程度的影響［19］。因此，如何利用關(guān)鍵特征將不同的HCC患者分為相對(duì)同質(zhì)的亞型，具有重要臨床意義。下一節(jié)將具體描述結(jié)合多種組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)HCC分層的策略及方法。

2 多組學(xué)HCC分層策略

精準(zhǔn)腫瘤學(xué)的主要目的之一便是識(shí)別癌癥分子亞型，即將具有共同生物學(xué)特征或臨床表型（如生存時(shí)間和藥物敏感性）的患者群體進(jìn)行分類，使不同患者可以根據(jù)其所屬亞型不同選擇更加適合其自身的治療方案。聚類是多年來(lái)相關(guān)研究人員在癌癥分層中的常用算法。至今已開(kāi)發(fā)出了許多聚類方法，如層次聚類、一致性聚類、基于密度、分布或質(zhì)心的方法、半監(jiān)督或監(jiān)督的方法等［20］。本文根據(jù)輸入聚類算法組學(xué)數(shù)量，將當(dāng)前多組學(xué)HCC分層策略分為從單組學(xué)出發(fā)（from single-to-multi，S To M）和從多組學(xué)出發(fā)（from multi-to-multi，M To M）兩大策略。

2.1 從單組學(xué)出發(fā)（S To M）策略

S To M策略即利用單組學(xué)數(shù)據(jù)的不同特征對(duì)HCC進(jìn)行分層后，結(jié)合多種組學(xué)數(shù)據(jù)尋找不同HCC亞型之間的差異分子，并驗(yàn)證其差異的真實(shí)性和腫瘤生物學(xué)現(xiàn)象的關(guān)聯(lián)（如腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后、免疫、代謝、信號(hào)通路等）（圖1）。特征選擇是S To M策略的核心，多年來(lái)針對(duì)分層特征的選擇可大致分為基于數(shù)據(jù)分布的方法、基于生物特征的方法和基于多組學(xué)的方法3種。表1總結(jié)了近年來(lái)S To M策略下HCC分層研究的方法和結(jié)果。

Table 1 The summary of methods and results for stratification of hepatocellular carcinoma by using the S To M strategy表1 S To M策略肝細(xì)胞癌分層方法與結(jié)果小結(jié)

Fig. 1 Hepatocellular carcinoma stratification using S To M strategy圖1 從單一組學(xué)出發(fā)的肝細(xì)胞癌分層策略

2.1.1 基于數(shù)據(jù)分布的方法

基于數(shù)據(jù)分布的方法主要是根據(jù)數(shù)據(jù)分布特點(diǎn)或其在不同臨床屬性間的差異對(duì)特征進(jìn)行篩選，其常見(jiàn)方法有方差篩選、變異系數(shù)篩選、中位偏差篩選、Cox模［21］等。Ao等［22］通過(guò)單因素Cox回歸模型鑒定出192組HCC預(yù)后相關(guān)基因?qū)螅x擇了其中C指數(shù)最高的20組基因?qū)?，并根?jù)其對(duì)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高低風(fēng)險(xiǎn)組。綜合多組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)亞型在基因突變和拷貝數(shù)變異上具有顯著差異。其中，高風(fēng)險(xiǎn)組轉(zhuǎn)錄特征主要為細(xì)胞增殖和腫瘤微環(huán)境等相關(guān)途徑的激活，而低風(fēng)險(xiǎn)患者的轉(zhuǎn)錄特征在于各種代謝途徑的激活，并且兩個(gè)亞型之間的轉(zhuǎn)錄差異與其DNA甲基化差異顯著相關(guān)。Jiang等［23］則選取變異系數(shù)前25%的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行非負(fù)矩陣分解（nonnegative matrix factorization，NMF）和一致性聚類將110名早期HCC患者分為3個(gè)子類（SI、SII和SIII）。通過(guò)多種組學(xué)（蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組和突變譜）分析發(fā)現(xiàn)，SI和SII具強(qiáng)增殖特征，并且CTNNB1的突變頻率和WNT通路的激活程度要高于SIII，相比之下SIII則具有強(qiáng)侵襲性，其富集了很多腫瘤促進(jìn)通路，并且存在抑制性免疫亞群。

2.1.2 基于生物特征的方法

隨著對(duì)癌癥研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞可以激活不同的免疫檢查點(diǎn)通路，以達(dá)到抑制機(jī)體免疫，促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)展的目的。針對(duì)PD-1/PD-L1、CTLA-4等免疫檢查點(diǎn)的抑制劑可以重新激活抗癌免疫反應(yīng)，并在某些癌癥的臨床治療上展現(xiàn)出良好的治療效果［24］。有研究表明，在慢性肝炎的環(huán)境下，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞的募集以及免疫檢查點(diǎn)CTLA-4和PD-1的上調(diào)，通常會(huì)促進(jìn)HCC生長(zhǎng)與發(fā)展［25］。因此，免疫檢查點(diǎn)抑制劑似乎是有希望的HCC治療策略。此外，肝臟作為重要代謝器官，其可以通過(guò)不同代謝物的生理調(diào)節(jié)來(lái)控制全身能量代謝，其代謝異常也往往會(huì)引起如非酒精性脂肪肝和2型糖尿病等疾病［26］。實(shí)際上，一些代謝物的指標(biāo)如葡萄糖和醋酸鹽利用率、血清中乳酸含量已被認(rèn)為是HCC有效的分層或預(yù)后指標(biāo)［27］。因此，目前在HCC分層策略中，針對(duì)生物學(xué)特征的提取主要為免疫特征和代謝特征。Zhang等［28］對(duì)HCC免疫細(xì)胞質(zhì)譜流式數(shù)據(jù)進(jìn)行層次聚類，將HCC分為3個(gè)亞型。其中亞型1為免疫活性亞型，具有相對(duì)正常的T細(xì)胞浸潤(rùn)水平，但B細(xì)胞浸潤(rùn)水平較低。亞型2為免疫缺陷亞型，其特征在于淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)減少、樹(shù)突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的增加、單核細(xì)胞IL-1β過(guò)表達(dá)。亞型3為免疫抑制亞型，其Treg細(xì)胞、Breg細(xì)胞和M2極化巨噬細(xì)胞等免疫抑制細(xì)胞的浸潤(rùn)水平要明顯高于其他兩個(gè)亞型，并且一些免疫抑制分子如PD-1、PD-L1、Tim-3和CTLA-4在該亞型中過(guò)表達(dá)。Bidkhori等［29］使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個(gè)由1 972個(gè)代謝基因組成的HCC特異性代謝網(wǎng)絡(luò)。之后，作者使用一種網(wǎng)絡(luò)平滑的算法（network-based stratification，NBS）來(lái)傳播每個(gè)基因的表達(dá)對(duì)其在網(wǎng)絡(luò)相鄰基因的影響［30］，并將HCC分為3個(gè)子類。多種組學(xué)整合分析發(fā)現(xiàn)3種不同亞型的代謝和信號(hào)通路在基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平上均具有顯著差異，并且3種亞型傾向依賴不同的同工酶來(lái)催化同一生化反應(yīng)。

2.1.3 基于多組學(xué)的方法

除了上述方法之外，還有一些分層特征本身是由多種組學(xué)確定的也被列入S To M策略中。例如Yang等［31］對(duì)849名肝癌患者使用DriverNet算法［32］（一種基于突變譜和轉(zhuǎn)錄譜的驅(qū)動(dòng)基因發(fā)現(xiàn)算法），鑒定出34個(gè)HCC驅(qū)動(dòng)基因。在后續(xù)的分析中作者將這34個(gè)驅(qū)動(dòng)基因的突變譜輸入NBS算法中［30］，將HCC分為3個(gè)具有顯著生存差異的子類（NBS1、NBS2和NBS3）。其中NBS1和NBS2富集了如TP53、AXIN1、RB1等抑癌基因，NBS3則具高CTNNB1突變頻率和低抑癌基因突變頻率，并且該分類模型與先前報(bào)道的基于轉(zhuǎn)錄組的分類模型顯著相關(guān)。

2.2 從多組學(xué)出發(fā)（M To M）策略

M To M策略則希望通過(guò)對(duì)多種組學(xué)數(shù)據(jù)（如基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組與腫瘤生物學(xué)的關(guān)聯(lián)）進(jìn)行多層面的綜合分析（即從系統(tǒng)生物學(xué)的概念出發(fā)）全景式地展示不同亞型內(nèi)各組學(xué)之間的差異與聯(lián)系。數(shù)據(jù)降維是M To M策略的核心步驟，即將多種組學(xué)數(shù)據(jù)集中放入一個(gè)低維的堆疊矩陣中，然后再對(duì)該數(shù)據(jù)矩陣實(shí)施聚類算法以獲得具有多種組學(xué)特征的分層結(jié)果（圖2）。根據(jù)使用的算法不同，常見(jiàn)的M To M策略分層算法可以分為3類，基于相似性的方法、基于集成的方法和深度學(xué)習(xí)。表2總結(jié)了近年來(lái)M To M策略下HCC分層研究的方法和結(jié)果。

Table 2 The summary of methods and results for stratification of hepatocellular carcinoma by using M To M strategy表2 M To M策略肝細(xì)胞癌分層方法與結(jié)果小結(jié)

Fig. 2 Hepatocellular carcinoma stratification using M To M strategy圖2 從多組學(xué)出發(fā)的肝細(xì)胞癌分策略

2.2.1 基于相似性的方法

基于相似性的方法主要思想是將不同的組學(xué)特征轉(zhuǎn)化為患者之間的相似程度，并輸出一個(gè)綜合的“患者-患者相似矩陣”，最終根據(jù)該矩陣得到患者分層結(jié)果。相似網(wǎng)絡(luò)融合（similarity network fusion，SNF）是這一類方法的代表性算法［47］，該算法首先將每個(gè)輸入的組學(xué)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為“患者-患者相似網(wǎng)絡(luò)”。在此網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)表示每個(gè)患者，連接邊上的權(quán)值則表示患者之間相似度的大小，之后通過(guò)融合迭代公式將多個(gè)相似網(wǎng)絡(luò)逐漸融合。當(dāng)達(dá)到公式收斂條件時(shí)得到最終的“融合相似網(wǎng)絡(luò)”，并在此基礎(chǔ)上完成患者分層工作。經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，SNF算法及其改進(jìn)算法常常被用于HCC多組學(xué)分層研究中。Ruan等［48］提出了一種加強(qiáng)信號(hào)注釋的相似網(wǎng)絡(luò)融合（association-signal-annotation boosted SNF，ab-SNF）模型，與原始SNF算法相比，ab-SNF將不同組學(xué)數(shù)據(jù)特征和感興趣結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)信號(hào)注釋作為權(quán)值，加入到構(gòu)建患者之間相似網(wǎng)絡(luò)中，以減少噪聲的影響并提高聚類性能。在大型患者隊(duì)列中，部分患者某項(xiàng)組學(xué)數(shù)據(jù)的丟失是一個(gè)常見(jiàn)的問(wèn)題。為解決這一問(wèn)題，Xu等［49］提出了多重相似網(wǎng)絡(luò)嵌入（multiple similarity network embedding，MSNE）模型，MSNE算法的原理是在構(gòu)建完單個(gè)患者相似網(wǎng)絡(luò)后，采用隨機(jī)游走的方式從多個(gè)網(wǎng)絡(luò)中獲得一個(gè)綜合相似網(wǎng)絡(luò)，使一些組學(xué)數(shù)據(jù)丟失的樣本，也可以被投影到低維的相似網(wǎng)絡(luò)中。并且相對(duì)于原始SNF算法，MSNE算法得到的結(jié)果具有更豐富的臨床參數(shù)和更顯著的生存差異。

除了SNF算法外，其他基于相似性的方法也用于HCC分層研究中。例如Ramazzotti等［50］開(kāi)發(fā)了一種多核學(xué)習(xí)亞型識(shí)別算法（multikernel learning，CIMLR），該算法可以根據(jù)每種組學(xué)在不同癌癥中的重要程度為其分配權(quán)重，并且利用每個(gè)組學(xué)的多個(gè)高斯核構(gòu)建“患者-患者相似矩陣”。在實(shí)際應(yīng)用中，CIMLR將來(lái)自TCGA的359例HCC樣本分為了8個(gè)亞型，其結(jié)果具有顯著的疾病特異性和生存差異?；卩徲虻亩嘟M學(xué)亞型識(shí)別算法（neighborhood based multi-omics clustering，NEMO）［51］模型認(rèn)為每個(gè)樣本的局部鄰域特征，可以更好地捕捉患者在每個(gè)組學(xué)中的相似模式，其大致可分為3個(gè)步驟：a. 為每個(gè)組學(xué)構(gòu)建患者間相似矩陣；b. 將來(lái)自不同組學(xué)的相似矩陣整合到一個(gè)矩陣中；c. 對(duì)該矩陣進(jìn)行聚類分析。NEMO在應(yīng)用中不需要迭代優(yōu)化，具有比SNF類算法更快的執(zhí)行速度，且無(wú)需對(duì)丟失數(shù)據(jù)的樣本進(jìn)行插補(bǔ)或刪除。

2.2.2 基于集成的方法

基于貝葉斯框架、主成分分析［52］、矩陣分解［53］等對(duì)數(shù)據(jù)或模型集成的方法也常被用于癌癥亞型識(shí)別研究當(dāng)中。例如基于聯(lián)合潛變量模型的iCluster，該模型假設(shè)腫瘤亞型為未觀察到的潛在變量，并且該變量會(huì)形成一組低維的空間坐標(biāo)，可以捕捉不同組學(xué)之間的相關(guān)性并用于腫瘤樣本的聚類中［54］。值得一提的是，最初的iCluster僅能輸入連續(xù)變量（如表達(dá)數(shù)據(jù)、DNA甲基化數(shù)據(jù)），經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)其最新版本iClusterBayes采用全貝葉斯?jié)撟兞磕Ｐ?，不但允許輸入二值變量（如突變數(shù)據(jù)）、分類變量（如基因拷貝數(shù)狀態(tài)）和連續(xù)變量，還極大地減少了算法運(yùn)行時(shí)間［55］。在實(shí)際應(yīng)用中，一些研究表明iCluster算法可以將HCC分為穩(wěn)定且具有顯著臨床差異的3個(gè)亞型［56-57］。

除了輸入特定的組學(xué)數(shù)據(jù)以外，聚類分配（cluster-of-cluster-assignments，COCA）算法可以允許輸入單組學(xué)聚類結(jié)果，并從中分配得出二級(jí)聚類結(jié)果［58］。Yang等［59］探索了來(lái)自不同組學(xué)的HCC驅(qū)動(dòng)因素，并使用COCA算法對(duì)其進(jìn)行綜合聚類，得到了4個(gè)穩(wěn)定的HCC亞型（C1、C2、C3和C4）。其中C1腫瘤主要富集了DNA修復(fù)和病毒致癌通路的異常，C2腫瘤的特征主要在于NF-κB通路和NBEA的突變，C3和C4腫瘤中特異性表達(dá)的基因則主要與免疫應(yīng)答和T細(xì)胞調(diào)節(jié)相關(guān)。

2.2.3 深度學(xué)習(xí)

最近，隨著人工智能領(lǐng)域的不斷發(fā)展，深度學(xué)習(xí)作為這一領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)影像、信號(hào)及組學(xué)數(shù)據(jù)的處理中得到了廣泛應(yīng)用［60］。自動(dòng)編碼器作為常見(jiàn)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)框架，常被用于對(duì)一組數(shù)據(jù)的特征學(xué)習(xí)和降維工作中。并且在醫(yī)學(xué)組學(xué)數(shù)據(jù)中，該算法被證明可以有效提取與臨床和分子有關(guān)的特征［61］。Chaudhary等［62］對(duì)來(lái)自TCGA的360例HCC樣本的RNA-seq、miRNA-Seq和DNA甲基化數(shù)據(jù)應(yīng)用自動(dòng)編碼器降維后，使用單因素Cox模型提取了37個(gè)與生存顯著相關(guān)的臨床特征，并對(duì)這些特征使用K-means聚類得到了兩個(gè)具有顯著生存差異的亞型。其中侵襲性亞型S1的差異基因主要集中在癌癥相關(guān)通路、Wnt信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等，而中度侵襲性亞型S2則主要為代謝相關(guān)通路的激活，如藥物代謝、氨基酸和脂肪酸代謝等。Wang等［63］則將自動(dòng)編碼器與SNF算法相結(jié)合，同樣地得到了兩個(gè)具有顯著生存差異的HCC亞類。

3 多組學(xué)HCC亞型特點(diǎn)

值得注意的是，一些HCC亞型在很多獨(dú)立的亞型分類研究中反復(fù)出現(xiàn)，這暗示著來(lái)源于不同方法的HCC亞型可能具有共同的特征。本小節(jié)綜合了Hoshida等［71］、Ally等［56］、Yang等［42］、Benfeitas等［37］、Bidkhori等［29］以及兩篇相關(guān)綜述［7，9］，將HCC大致分成兩類：ClustA和ClustB（圖3）。其中ClustA更具侵襲性，在臨床上組織分化程度低、血管浸潤(rùn)率和患者血清中甲胎蛋白（AFP）水平偏高。在基因組特征上ClustA表現(xiàn)出了更加頻繁的TP53突變，染色體高度不穩(wěn)定性以及一些常見(jiàn)的致癌通路如PI3K-AKT-mTOR、RASMAPK、WNT等的高度激活。此外，部分ClustA樣本具有免疫耗竭特征，具體以TGF-β、PD-L1、CTLA-4等驅(qū)動(dòng)的T細(xì)胞耗竭狀態(tài)為主［42］。

Fig. 3 Multi-omics characteristics of HCC subtypes圖3 HCC亞型的多組學(xué)特點(diǎn)

相反，ClustB具有相對(duì)ClustA而言較好的組織分化能力、較低的AFP水平、較好的預(yù)后，并且該亞類多與過(guò)度肥胖和過(guò)度酗酒有關(guān)。因此，可以發(fā)現(xiàn)有關(guān)酒精、脂質(zhì)等代謝通路在ClustB中高度激活。Wnt-β-catenin信號(hào)的持續(xù)激活在HCC中是一個(gè)頻繁發(fā)生的驅(qū)動(dòng)事件［72］。值得一提的是，兩種亞型似乎會(huì)以不同的方式激活Wnt通路。其中ClustB主要以CTNNB1的突變激活Wnt通路，這種類型的樣本在一些研究中也被證明與更好的預(yù)后相關(guān)［73］。相反，在侵襲性表型ClustA中則發(fā)現(xiàn)了TGF-β的過(guò)度表達(dá)，其主要通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)游離的β-catenin來(lái)增強(qiáng)Wnt通路［71］。此外，目前普遍認(rèn)為癌癥細(xì)胞在高速代謝生長(zhǎng)的同時(shí)，會(huì)促進(jìn)大量NADPH的生物合成以抵抗活性氧（ROS）對(duì)其自身的傷害［74］。然而有趣的是，這兩種HCC表型被發(fā)現(xiàn)會(huì)以不同的方式清除胞內(nèi)ROS。其中，弱侵襲性ClustB主要顯示由過(guò)氧化氫酶介導(dǎo)的ROS清除，另一種亞型則主要以谷胱甘肽過(guò)氧化物酶依賴的方式清除ROS［37］。這似乎也表明了在針對(duì)HCC的抗氧化劑治療中，需要根據(jù)不同的亞型選擇不同的藥物。

4 總結(jié)與討論

HCC在分子和病理上的高度異質(zhì)性極大地阻礙了其臨床治療效果。因此，將HCC患者分為相對(duì)同質(zhì)的亞型，對(duì)其臨床治療效果和個(gè)性化治療有著重要意義。隨著高通量技術(shù)的不斷發(fā)展，多種組學(xué)數(shù)據(jù)綜合分析可以幫助研究人員更好地了解HCC發(fā)展背后的生物學(xué)機(jī)制，也為HCC分層研究打開(kāi)了新的思路。

根據(jù)分層算法輸入組學(xué)的數(shù)量，本文將目前HCC多組學(xué)分層方法分為S To M和M To M兩大策略。其中S To M策略是利用單組學(xué)數(shù)據(jù)的不同特征對(duì)HCC進(jìn)行分層后，結(jié)合多種組學(xué)數(shù)據(jù)尋找不同HCC亞型之間的差異分子，并驗(yàn)證其差異的真實(shí)性與腫瘤生物學(xué)現(xiàn)象的關(guān)聯(lián)。特征選擇是S To M策略的核心，其中，基于生物學(xué)特征的方法，主要聚焦在將不同的疾病表型與特定基因型的關(guān)聯(lián)，有助于其后續(xù)的轉(zhuǎn)化研究，是目前S To M分層策略的主要手段（例如，在表1的19項(xiàng)研究中有9項(xiàng)研究選擇HCC的生物學(xué)特征對(duì)其進(jìn)行分層）。免疫特征和代謝特征是目前HCC分層研究中常用的生物學(xué)特征。然而，隨著人們對(duì)癌癥的認(rèn)識(shí)不斷更新，一些新的癌癥標(biāo)志（如細(xì)胞衰老、非突變表觀遺傳、多態(tài)微生物組等）也被認(rèn)為對(duì)形成惡性腫瘤起到至關(guān)重要的作用［75］。我們認(rèn)為這些標(biāo)志同樣具有良好的分層潛力，可以用于HCC亞型分類研究中，以求通過(guò)不同的角度全面了解HCC異質(zhì)性及其分子特點(diǎn)。此外，從近幾年相關(guān)研究來(lái)看，連續(xù)型分層特征（如轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組）在其中占據(jù)了絕大多數(shù)，而離散特征（如體細(xì)胞突變）則很少作為HCC的分層特征。這很大程度是因?yàn)闊o(wú)法通過(guò)離散特征計(jì)算出患者之間的歐幾里得距離，因此不能滿足當(dāng)前分層算法（如層次聚類、K-means、一致性聚類等）的輸入要求。然而Yang等［31］和Xu等［44］的研究讓我們看到了通過(guò)對(duì)離散特征進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜ハ∈杌幚砗?，其具有不亞于連續(xù)特征的分層能力?？紤]到癌癥組學(xué)的離散特征在其發(fā)展中的有著重要意義，并且在臨床上其操作相對(duì)簡(jiǎn)單，在以后的研究中可以考慮在分層特征中加入患者的組學(xué)的離散特征，以獲得更具全面分層結(jié)果。

M To M策略則是從系統(tǒng)生物學(xué)的概念出發(fā)，全景式地展示不同亞型內(nèi)各組學(xué)之間的差異與聯(lián)系。然而，與S to M相比，M To M需要用戶掌握多種編程語(yǔ)言（表2）以及更強(qiáng)大的計(jì)算性能。并且，不同組學(xué)數(shù)據(jù)處理方法的成熟度參差不齊，也是當(dāng)前多組學(xué)集成結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床解釋的主要障礙［76］。因此，加強(qiáng)樣本處理和相關(guān)分析方法的標(biāo)準(zhǔn)化流程以及開(kāi)發(fā)穩(wěn)定健壯的多組學(xué)集成工具，對(duì)促進(jìn)相關(guān)理論的發(fā)現(xiàn)和結(jié)果的可翻譯性至關(guān)重要。此外，需要注意的是，一般認(rèn)為合并更多的組學(xué)數(shù)據(jù)往往會(huì)得到更好的分層結(jié)果。而Duan等［77］的研究駁斥了這個(gè)觀點(diǎn)，他們的研究發(fā)現(xiàn)，在某些情況下集成更多的組學(xué)內(nèi)容反而會(huì)對(duì)結(jié)果造成負(fù)面影響。因此，使用哪幾種組學(xué)數(shù)據(jù)的組合可以有效地完成HCC分層任務(wù)，是以后使用M To M策略下相關(guān)算法前需要考慮的。其次，在大型患者隊(duì)列中，數(shù)據(jù)丟失是十分常見(jiàn)的現(xiàn)象，單純對(duì)丟失數(shù)據(jù)的樣本進(jìn)行刪除可能會(huì)對(duì)其結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)造成影響。因此，如何對(duì)丟失數(shù)據(jù)做出適當(dāng)?shù)奶幚硪苍趯?duì)HCC多組學(xué)分層前需要考慮的。組學(xué)分析需要的數(shù)據(jù)量大，往往需要有多個(gè)中心的合作。整合來(lái)自多個(gè)中心或研究的數(shù)據(jù)集可以獲得更可靠的結(jié)果和潛在的新發(fā)現(xiàn)［78］。但在整合研究時(shí)，也需要注意由實(shí)驗(yàn)室、操作人員、操作平臺(tái)等其他非生物因素的差異引起的批次效應(yīng)可能會(huì)掩蓋或降低未發(fā)現(xiàn)差異信號(hào)的強(qiáng)度［79］。

最后，如Ally等［56］、Hoshida等［71］HCC亞型在很多相關(guān)的亞型研究中反復(fù)出現(xiàn)，這表明了使用不同方法得到的HCC亞型可能具有共同特征。然而，針對(duì)當(dāng)前HCC獨(dú)立亞型之間相似性的研究仍十分淺薄［9］。因此，未來(lái)仍需進(jìn)行更多的研究，以在其中總結(jié)出更具有代表性的亞類。