楊艷 甘妮翠 彭寧馨 張嵐萱 張繼虹 李錦媛**

（1）昆明理工大學醫(yī)學院，昆明 650500；2）云南省第一人民醫(yī)院普外一科，昆明 650032）

隨著腫瘤免疫療法研究的逐漸深入，以過繼性嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫療法、免疫檢查點抑制劑為代表的多種免疫治療策略相繼被開發(fā)并進入臨床應用［1］。然而當前的免疫療法主要針對適應性免疫，CAR-T在實體瘤中浸潤不足，療效并不理想［2-3］。與此同時，研究發(fā)現(xiàn)先天免疫細胞也確實具有發(fā)揮抗腫瘤活性的潛力［4］。巨噬細胞是實體腫瘤微環(huán)境中主要的免疫浸潤細胞，可吞噬腫瘤細胞，并將腫瘤抗原呈遞給T細胞進而啟動腫瘤特異性免疫應答［5-6］。因此，改造巨噬細胞成為嵌合抗原受體巨噬細胞（chimeric antigen receptor macrophage，CAR-M）代表了一種新型抗腫瘤固有免疫療法，可與放療或者針對適應性免疫的治療方法協(xié)同作用，發(fā)揮更強勁的抗腫瘤免疫作用。本文主要介紹CAR-M的發(fā)展歷程、結(jié)構(gòu)設(shè)計和臨床試驗相關(guān)研究進展，以期為其未來的臨床應用提供參考。

1 嵌合抗原受體（CAR）修飾的免疫細胞用于腫瘤免疫治療

21世紀初，靶向T細胞活化的相關(guān)免疫療法就已啟動，CAR-T細胞是通過基因工程技術(shù)制備的抗原受體T細胞，可與腫瘤細胞表面的抗原特異性結(jié)合，具有效應性T細胞的T細胞受體（T cell receptor ，TCR）特異性和非主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）限制性抗腫瘤活性的特點。CAR的主要結(jié)構(gòu)涉及識別抗原的單鏈抗體可變區(qū)片段（single chain antibody variable fragments，scFvs）、跨膜區(qū)、TCR β鏈CD3ζ（T細胞活化第一信號）和協(xié)同刺激信號結(jié)構(gòu)域（T細胞活化第二信號）（圖1）［7-8］。 雖然CAR-T細胞治療血液腫瘤的臨床效果良好，但由于實體腫瘤細胞中抗原缺失、缺乏特異抗原以及免疫抑制腫瘤微環(huán)境等原因，其對實體瘤的治療效果并不理想。同時在臨床上還發(fā)現(xiàn)，CAR-T細胞療法會產(chǎn)生細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）、神經(jīng)方面的相關(guān)不良反應［3］。由此在完善CAR-T免疫療法的同時，拓寬CAR策略也非常必要。目前CAR策略已經(jīng)用于修飾自然殺傷細胞（natural killer，NK）、γδT細胞（gammadelta T cells ，γδT）、自然殺傷性T細胞（natural killer T cells，NKT）、調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）等免疫細胞，研究表明通過對以上免疫細胞進行CAR修飾對腫瘤免疫治療具有積極作用［9-13］。

Fig. 1 Structure display of CAR-M圖1 CAR-M結(jié)構(gòu)示意圖

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）由多種細胞、細胞因子、酶類以及胞外基質(zhì)共同組成［14］。大量活化的巨噬細胞浸潤腫瘤間質(zhì)，被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM），在大多數(shù)實體腫瘤的TME中占比達50%［15-16］。除此之外，巨噬細胞還能夠分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），從而破環(huán)腫瘤細胞外基質(zhì)層進入到腫瘤內(nèi)部發(fā)揮作用［17-18］。巨噬細胞的這一特質(zhì)推動了利用巨噬細胞治療腫瘤的研究。然而研究人員發(fā)現(xiàn)，直接進行巨噬細胞移植治療效果甚微［19-21］。其主要問題在于，TME能夠誘導巨噬細胞分化為替代活化型 （M2表型），M2型巨噬細胞能通過分泌多種活性物質(zhì)促進血管生成、腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、免疫抑制、免疫逃逸和耐藥性等［22-23］。研究證明，被極化為M2表型的巨噬細胞可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)為M1表型［24］。M1型巨噬細胞高表達炎癥細胞因子，具有較強的抗微生物和抗腫瘤活性。由此，逆轉(zhuǎn)M2表型在腫瘤治療中具有重要意義。同時，研究發(fā)現(xiàn)TME中的巨噬細胞需要額外的信號來引導其對抗腫瘤［25］。研究人員從CAR-T的成功中獲得啟示，通過轉(zhuǎn)基因手段促使巨噬細胞表達靶向特定腫瘤抗原的CAR轉(zhuǎn)變?yōu)镃AR-M，從而增強或激活其對目標腫瘤細胞的吞噬殺傷作用［26］。由于巨噬細胞在TME中大量存在，且能夠進入腫瘤內(nèi)部發(fā)揮作用，因此CAR-M也成為針對實體腫瘤最有希望的臨床免疫療法之一。

2 CAR-M的設(shè)計與應用

最初，CAR的原始結(jié)構(gòu)是為T細胞設(shè)計的，沒有專門為巨噬細胞設(shè)計的CAR結(jié)構(gòu)。CAR-M結(jié)構(gòu)參照CAR-T進行設(shè)計，主要由識別特定腫瘤抗原的細胞外信號域、跨膜區(qū)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成（圖1）。后續(xù)在CAR-NK相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，CAR結(jié)合表位的位置及其與細胞表面的距離可影響抗原結(jié)合和細胞活化［27］。第一代CAR-M主要對CAR的細胞外結(jié)構(gòu)域進行改造，以靶向特定的抗原來識別和吞噬腫瘤細胞。目前，通過對細胞外信號域的研究，確定了幾種常見的腫瘤靶點，如CD19、CD22、HER2等［28］。

目前，第二代的CAR-M正在開發(fā)中，除了保持第一代CAR-M技術(shù)的特點外，研究人員希望可以通過在CAR結(jié)構(gòu)中添加一個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)腫瘤相關(guān)抗原呈遞和T細胞活化等目標。加利福尼亞大學的Morrissey團隊［26］制備了一種名為嵌合抗原吞噬受體（chimeric antigen receptors for phagocytosis，CAR-P）的新型CARs，并將其引入巨噬細胞中。該團隊從已知的小鼠吞噬受體庫中篩選出Megf10、FcγR作為細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域以促進巨噬細胞的吞噬作用。后續(xù)實驗證實，攜帶Megf10（CAR-PMegf10）或FcRV（CAR-PFcγR）細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CAR-P轉(zhuǎn)染巨噬細胞后其對CD19的吞噬作用顯著增強。這說明CAR-PMegf10或CARPFcγR結(jié)構(gòu)域可促進巨噬細胞對特定配體靶標的吞噬作用。已有研究表明，PI3K信號通路對于大靶點的內(nèi)化非常重要［29］。由此，該團隊在CARPMegf10的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上串聯(lián)PI3K招募域，發(fā)現(xiàn)PI3K招募域的加入進一步增強CAR-M對癌細胞的吞噬。上述研究表明，將各類促吞噬效應因子的活化基序串聯(lián)至CAR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可促進CAR-M的吞噬活性和抗腫瘤效應。這可以作為一種應用于臨床治療癌癥的思路，但這種策略需要對CAR-P受體本身進行更多優(yōu)化，技術(shù)和成本方面依然面臨較大的挑戰(zhàn)。

為了使CAR-M獲得更廣譜的抗癌功效，除了CAR-M的結(jié)構(gòu)，CAR基因的轉(zhuǎn)染方法也需要考慮。在過去的CAR轉(zhuǎn)染策略中，多以慢病毒作為載體對體內(nèi)免疫細胞進行基因編輯，但其是否可以安全地用于臨床治療一直飽受爭議［30］。為了更高效地轉(zhuǎn)染原始人類巨噬細胞，賓夕法尼亞大學的Klichinsky團隊［31］設(shè)計了一種復制缺陷型嵌合腺病毒載體（Ad5f35），并將抗HER2的CAR克隆到Ad5f35載體中，實驗證明HER2-CAR-Ad5f35轉(zhuǎn)染的人巨噬細胞高效表達了HER2-CAR，多呈現(xiàn)經(jīng)典激活途徑的M1型。同時腺病毒轉(zhuǎn)染不影響巨噬細胞表面趨化因子受體的表達和遷移能力。為突破限制CAR-M體外大規(guī)模生產(chǎn)的技術(shù)瓶頸、高額費用和病毒載體修飾體內(nèi)巨噬細胞導致的致癌可能性。Kang等［32］利用非病毒載體，對TME中的巨噬細胞進行體內(nèi)修飾以治療實體腫瘤。該團隊首先將CAR-γ干擾素（IFN-γ）抗ALK基因克隆到非病毒載體piggyBac轉(zhuǎn)座子中，得到CAR-IFN-γ載體（CAR-IFN-γpDNA）。隨后利用一種22 ku大小且?guī)д姾傻霓D(zhuǎn)染試劑PEI的衍生物——jetPEI-macrophage （MPEI）與帶負電荷的CAR-IFN-γpDNA通過靜電作用形成納米復合物 MPEI/pCAR-IFN-γ，該復合物對人巨噬細胞的平均轉(zhuǎn)染效率為14%。對比病毒載體而言，MPEI/pCARIFN-γ轉(zhuǎn)染復合物更加簡單實惠，但仍需進一步提高其轉(zhuǎn)染率（表1）。

Table 1 Characteristics of different transfection vectors for CAR-M表1 CAR-M不同轉(zhuǎn)染載體的特點

3 CAR-M的抗腫瘤效應

目前，CAR-M研究的重點是通過引入各類胞內(nèi)致敏結(jié)構(gòu)域激活和增強巨噬細胞的吞噬作用，以促進CAR-M發(fā)揮抗腫瘤作用（表2）。

Table 2 The anti-tumor effect of CAR-M表2 CAR-M抗腫瘤研究進展

加利福利亞大學的Morrissey團隊［26］制備的CAR-P巨噬細胞與人Burkitt’s淋巴瘤細胞Raji B共培養(yǎng)44 h后，發(fā)現(xiàn)CAR-P巨噬細胞的加入顯著減少了Raji B細胞的數(shù)量。但該研究沒有進一步探究Raji B細胞的減少主要是由巨噬細胞的吞噬效應介導還是巨噬細胞誘導的腫瘤細胞自噬性死亡?？偟膩碚f，CAR-P是一種成功的策略，可以引導巨噬細胞作用于腫瘤靶細胞，并可以啟動細胞吞噬和自噬作用，從而清除腫瘤細胞。

浙江大學張進團隊［33］從健康供者的外周血中分離得到誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），將促進M1型極化的CARs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到iPSCs中，繼而誘導其分化為M1-CAR-iMacs。體外腫瘤細胞殺傷實驗進一步證實M1-CAR-iMacs的抗腫瘤作用及抗原依賴性的M1極化能力。在荷瘤NSG小鼠模型中，CAR-iMac細胞在體內(nèi)可以持續(xù)存活20 d以上，30 d后逐漸消失。特異靶向腫瘤間皮素的CAR（meso）-iMac處理荷瘤小鼠后第4、11和14天腫瘤負擔持續(xù)減輕，這說明CAR（meso）-iMac在體內(nèi)具有抗癌細胞活性，但是需要進一步改進CAR-iMac以維持其活性。

南京大學沈萍萍研究團隊［34］設(shè)計了一種靶向腫瘤細胞外基質(zhì)的嵌合抗原受體巨噬細胞（CAR-147），CAR-147可特異性識別抗原HER2，并有效激活巨噬細胞中MMP的表達。CAR-147巨噬細胞在體外并不抑制腫瘤細胞的生長，而在體內(nèi)抑制腫瘤生長。體內(nèi)實驗中CAR-147巨噬細胞可降解腫瘤周圍致密的膠原基質(zhì)，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，促進腫瘤模型中T細胞的浸潤。同時，CAR-147巨噬細胞顯著增加腫瘤組織中細胞因子IL-12和IFN-γ的表達水平。

賓夕法尼亞大學的Klichinsky團隊［31］將特異性識別HER2的CAR克隆到Ad5f35載體中，轉(zhuǎn)染巨噬細胞得到HER2-CAR-Ms。體外實驗證明，HER2-CAR-Ms對HER2陽性微珠和腫瘤細胞具有特異性吞噬作用，而且其對腫瘤的吞噬和殺傷水平與CAR的表達水平直接相關(guān)。小鼠體內(nèi)實驗顯示，接受HER2-CAR-Ms治療的小鼠生存期延長、腫瘤轉(zhuǎn)移率降低。CAR-M在無瘤NSGS小鼠體內(nèi)存在至少62 d。且CAR-Ms在人TME中維持著一種促炎表型，可調(diào)控周圍免疫細胞。除了直接抗腫瘤，HER2-CAR-Ms還可交叉提呈抗原和激活T細胞。這也證實了CAR-Ms直接減輕腫瘤負擔、塑造TME和產(chǎn)生疫苗效應。該團隊正在開展首次CAR-M的人類臨床試驗。

韓國首爾國立大學的Kang團隊［32］使用納米顆粒載體，將編碼CAR和IFN-γ的基因轉(zhuǎn)染巨噬細胞得到MPEI/pCAR-IFN-γ。腦神經(jīng)瘤（Neuro-2a）荷瘤小鼠瘤內(nèi)注射MPEI/pCAR-IFN-γ后生存期顯著延長，且治療期間小鼠平均體重未出現(xiàn)明顯變化，提示MPEI/pCAR-IFN-γ治療可以抑制腫瘤生長且副作用輕微。

4 總結(jié)

2021年9月，美國食品和藥物管理局（FDA）給Klichinsky團隊設(shè)計的CAR-M（CT-0508）開通快速審批通道，表明了對基于CAR設(shè)計的腫瘤免疫療法的迫切需求［31］。盡管各種CAR-M設(shè)計的腫瘤免疫療法在動物實驗中的表現(xiàn)優(yōu)良，但仍有許多問題需要解決。首先，體外改造后的巨噬細胞注射進入機體后不會增殖，不僅細胞耗費較大，而且療效也因此受限。其次，轉(zhuǎn)染CAR進入巨噬細胞的方法，也存在較多的技術(shù)限制，如載體的選擇和長期安全性［35］。雖然表達CARs的病毒載體可以大量生產(chǎn)，并可在-80°C下保存約9年，但是載體的安全性、無菌性、效價、純度至關(guān)重要［36-38］。另外，病毒載體的DNA通過插入突變整合到宿主細胞也是一個令人擔憂的問題，目前開發(fā)的病毒載體較之前載體大大降低了突變的風險。然而，慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體都有潛在的致癌作用。非病毒載體不存在細胞毒性，但其最小有效劑量需要后續(xù)的臨床研究證實［32］。更關(guān)鍵的是其轉(zhuǎn)染率較低，在未來仍需攻克這一難題。同時，TME組成呈現(xiàn)復雜性和異質(zhì)性，當前的CAR-M產(chǎn)品在動物模型中得到良好的效果，但對于人的臨床效果未知［39］。根據(jù)以往CAR設(shè)計的經(jīng)驗，靶抗原的暴露不夠充分可能導致CAR-M的治療效果不如預期［28］。最后，巨噬細胞在體內(nèi)的遷移特性也可能導致CARM策略治療效果的不佳［40］。外源性的巨噬細胞一般先通過肺，再在肝臟中富集［41］。過去的CAR相關(guān)免疫治療也表明，大多數(shù)靶向腫瘤抗原的免疫細胞傾向于在健康組織中集聚，導致潛在的脫靶毒性，導致功效受限，甚者產(chǎn)生毒性傷害機體［42-45］。在未來的臨床治療中，應最大限度地提高CAR-M的有效性和安全性。