王洪偉，陶亮，呂祿廷，孫靜慧，張騰騰，李杰，王建東

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，黑龍江齊齊哈爾 161006

帕金森病（parkinson disease, PD）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的退行性疾病，嚴(yán)重影響老年患者的身體健康[1]。近年來研究表明，遺傳因素是PD 發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一，在5%～10%的患者中可以鑒定出一些遺傳因素，并且與一般人群或?qū)φ战M相比，受影響患者的一級(jí)家庭成員患該病的風(fēng)險(xiǎn)增加2～3倍[2]。另有研究發(fā)現(xiàn)PD 最常見的單基因形式之一是由編碼富亮氨酸重復(fù)激酶2（Leucinerichrepeatproteinkinase2, LRRK2）的基因突變引起的[3]，特發(fā)性PD 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，LRRK2-PD 和特發(fā)性PD 之間的密切相似性提示LRRK2-PD中神經(jīng)退行性變機(jī)制的可能性，這可能為特發(fā)性PD 的病理生理學(xué)和治療提供新見解。

MicroRNAs（miRNAs）是進(jìn)化上保守的小的非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本，與靶信使RNA（mRNA）的3'-未翻譯區(qū)（3'-UTR）的部分互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合，從而調(diào)控其靶基因的翻譯[4]，許多miRNAs 通過調(diào)節(jié)靶向基因的翻譯與神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元發(fā)育、突觸可塑性、記憶形成和神經(jīng)退行性疾病相關(guān)[5-6]。目前，雖然有關(guān)于miR-205 在神經(jīng)退行性病變中的相關(guān)研究，但其在PD 紋狀體中的表達(dá)以及對神經(jīng)元凋亡的影響和機(jī)制尚未明確。因此，深入研究miR-205 與LRRK2 在PD 病理改變中的作用及作用機(jī)制對于治療PD 至關(guān)重要。本研究通過對PD 細(xì)胞模型進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，探究PD 細(xì)胞模型中miR-205 與LRRK2之間的關(guān)系，試圖通過該實(shí)驗(yàn)闡明PD 中miR-205對LRRK2 的調(diào)控機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

5%胎牛血清、1%的青霉素/鏈霉素雙抗、高糖DMEM 培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)12 孔板、維生素A、TPA（phorb-ol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate）、MPP（1-methyl-4-phenyl-pyridiniumion）、10%胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)箱、亞硫酸氫鹽、甲基化檢測試劑盒、miR-205 抑制劑、前體miR-205 及miR-205 陰性質(zhì)粒、miRNA 提取試劑盒、電泳儀、PCR 儀。

1.2 方法

1.2.1 PD 模型細(xì)胞制備 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SHSY5Y）購買后，采用含5%胎牛血清及1%的青霉素/鏈霉素雙抗在高糖DMEM 中培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)，24 h更換1 次液體，細(xì)胞覆蓋皿底后用胰酶將其消化為單細(xì)胞，并制成1×104/mL 的細(xì)胞懸液。然后將細(xì)胞以1×104/孔的密度接種到包被明膠的12 孔板中，此時(shí)向培養(yǎng)液中添加10 μM 的維生素A，在5%CO2的濕培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)，48 h 后換液1 次，然后再繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后，將培養(yǎng)液中的維生素A 替換為80 nM 的TPA，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。SH-SY5Y 細(xì)胞誘導(dǎo)分化6 d 后，此時(shí)的SH-SY5Y 細(xì)胞已經(jīng)具有多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的生物學(xué)特征。將分化后的SH-SY5Y細(xì)胞分為兩組，一組用含5% 胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)作為對照組；一組用含1 mM 的MPP 及5%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液誘導(dǎo)為PD 模型細(xì)胞。培養(yǎng)48 h 后，多巴胺神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)為PD 模型細(xì)胞。

1.2.2 PD 模型細(xì)胞中miR-205 甲基化檢測 提取SH-SY5Y 細(xì)胞的DNA，用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計(jì)針對甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過電泳檢測MSP 擴(kuò)增產(chǎn)物，確定miR-205 啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化，并進(jìn)一步檢測miR-205 的轉(zhuǎn)錄水平，確定LRRK2 的表達(dá)水平。

1.2.3 miR-205 過表達(dá)以及抑制試驗(yàn) 購買miR-205抑制劑、前體miR-205 及miR-205 陰性質(zhì)粒[Ambion（Austin, TX, USA）]，準(zhǔn)備進(jìn)行RNA 干擾及過表達(dá)試驗(yàn)，準(zhǔn)備12 孔板，復(fù)蘇SH-SY5Y 細(xì)胞，然后將細(xì)胞以1×105/孔的密度接種后，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，將其分為4 組：無處理組、陰性對照組、前體miR-205、miR-205 抑制劑。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞，分別提取mRNA 進(jìn)行檢測，確定miR-205 水平與LRRK2 表達(dá)量之間的關(guān)系，明確miR-205 抑制劑在PD 模型細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。

1.2.4 q-PCR 試驗(yàn) 收集細(xì)胞，采用試劑盒提取mRNA。miRNA 試劑盒提取組織中總RNA，Qiagen miScript RT 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。再以cDNA 為模板，在DNA 聚合酶作用下擴(kuò)增合成miR-205 和LRRK2 片段。LRRK2 轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Green Master mix，GAPDH 作為內(nèi)源對照，方法參照試劑盒說明書。miR-205 轉(zhuǎn)錄水平分析，采用All-in-One?miRNA qRT-PCR Detection Kit 監(jiān)測試劑盒，U6 作內(nèi)源對照。PCR 條件：95℃加熱40 s；然后95℃加熱10 s，60℃延長30 s，總計(jì)40 個(gè)循環(huán)；最后72℃條件下處理5 min。表達(dá)量的計(jì)算方法采用2-ΔΔCt，ΔΔCt=[Ct（靶基因）-Ct（內(nèi)參）]組1-[Ct（靶基因）-Ct（內(nèi)參）]組2。

1.3 觀察指標(biāo)

各組細(xì)胞模型中qRT-PCR 檢測miR-205、LRRK2 表達(dá)水平；使用miR-205 抑制劑后各組細(xì)胞模型LRRK2 表達(dá)水平；miR-205 過表達(dá)后各組細(xì)胞模型LRRK2 表達(dá)水平

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用GraphPad Prism 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析方法進(jìn)行分析；方差分析兩兩比較結(jié)果采用Tukey-Kramer 多重比較檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD 模型細(xì)胞中miR-205 水平下調(diào)，LRRK2 水平上調(diào)

本研究提取正常細(xì)胞以及PD 模型細(xì)胞的總RNA，通過q-PCR 方法檢測兩種細(xì)胞中miR-205 以及LRRK2 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)相較于正常細(xì)胞（1.02±0.14），PD 模型細(xì)胞中miR-205 的表達(dá)水平明顯降低（0.59±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017），見圖1A；而相較于正常細(xì)胞（1.00±0.11），PD 模型細(xì)胞中LRRK2 水平上調(diào)（1.50±0.10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033），見圖1B。

圖1 miR-205 及LRRK2 表達(dá)水平

2.2 miR-205 抑制劑促進(jìn)LRRK2 表達(dá)

miR-205 抑制劑被設(shè)計(jì)用于特異性結(jié)合內(nèi)源性miR-205 并抑制其活性。經(jīng)鑒定，相較于正常細(xì)胞（1.02±0.11）以及PD 模型細(xì)胞（1.47±0.12），轉(zhuǎn)染miR-205 抑制劑后可誘導(dǎo)神經(jīng)元培養(yǎng)物中LRRK2蛋白表達(dá)的劑量依賴性上調(diào)（1.87±0.11），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.036），見圖2。

圖2 miR-205 抑制后LRRK2 表達(dá)水平

2.3 miR-205 過表達(dá)可抑制LRRK2 表達(dá)

為了進(jìn)一步研究miR-205 對LRRK2 表達(dá)的影響，將前體miR-205 轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，通過q-PCR 分析LRRK2 轉(zhuǎn)錄水平。前體miR-205 進(jìn)入細(xì)胞后被轉(zhuǎn)化為成熟miR-205。觀察到，相較于正常細(xì)胞（1.02±0.11）以及PD 模型細(xì)胞（1.47±0.12），使用前體miR-205 處理SH-SY5Y 細(xì)胞可持續(xù)抑制LRRK2蛋白表達(dá)約50%（0.87±0.11），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020），見圖3。

圖3 miR-205 過表達(dá)后LRRK2 表達(dá)水平

3 討論

miR-205 參與代謝、神經(jīng)營養(yǎng)素信號(hào)調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，其異常表達(dá)與PD 的發(fā)生有關(guān)，但其在PD 患者紋狀體中的表達(dá)以及對神經(jīng)元凋亡的影響和機(jī)制尚未明確[7]。LRRK2 是常染色體遺傳性PD最常見的病因。LRRK2 突變導(dǎo)致全球多達(dá)5%的家族性病例[8]。LRRK2 的錯(cuò)義突變與家族性和散發(fā)性PD 相關(guān)。LRRK2 基因表達(dá)的簡單改變可能導(dǎo)致常見散發(fā)性PD 的可能性[9]。LRRK2 酶結(jié)構(gòu)域的7個(gè)點(diǎn)突變（G2019S、I2020T、R1441C/G/H、Y1699C、N1437H）導(dǎo)致常染色體顯性PD。重要的是，LRRK2的遺傳變異體也是克羅恩病、麻風(fēng)病和結(jié)核病的危險(xiǎn)因素，這提示LRRK2 蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外發(fā)揮重要作用，有研究表明LRRK2 蛋白在全身低水平表達(dá)，在腎臟、肺和免疫細(xì)胞中水平最高，在大腦中有少量表達(dá)[10]。此前已有研究嘗試檢測家族性和散發(fā)性PD 患者大腦中LRRK2 蛋白的表達(dá)水平[11]。

有研究表明，LRRK2 可能與miRNA 處理途徑相互作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成[12]。Chen Q 等[13]研究表明MALAT1/miR-205-5p 軸通過靶向LRRK2 調(diào)控MPP+誘導(dǎo)的MN9D 細(xì)胞凋亡，Cho HJ 等[14]檢測了散發(fā)性PD 患者額葉大腦皮層中LRRK2 蛋白和LRRK2 靶向miR-205 的水平。他們發(fā)現(xiàn)，LRRK2 蛋白表達(dá)水平在PD 患者大腦中顯著升高，而miR-205表達(dá)水平降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-205 可以直接調(diào)控LRRK2 的表達(dá)。并且體外細(xì)胞模型也已明確，LRRK2 蛋白的表達(dá)水平在PD 組中的表達(dá)顯著增加[15]，與本文出的結(jié)論一致，本研究在PD 模型細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)LRRK2 蛋白表達(dá)水平升高，而miR-205表達(dá)水平降低，當(dāng)過表達(dá)miR-205 后，LRRK2 蛋白表達(dá)下降；與前期研究結(jié)論相似[15]，本研究也進(jìn)一步證明了miR-205 能抑制LRRRK2 的表達(dá)。因此，深入研究miR-205 與LRRK2 在PD 的病理改變中的作用及作用機(jī)制對于治療PD 至關(guān)重要，研究miRNA-205 在PD 病理改變中的調(diào)控作用對于尋找PD 治療新靶點(diǎn)具有重要意義。

為了研究PD 患者中miR-205 的過表達(dá)或抑制是否影響LRRK2 的表達(dá)，本研究使用SH-SY5Y 成功誘導(dǎo)出PD 細(xì)胞模型，并對PD 細(xì)胞模型進(jìn)行miR-205 過表達(dá)及抑制實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在PD 細(xì)胞模型中miR-205 可以抑制LRRK2 的表達(dá)，miR-205 的下調(diào)可能導(dǎo)致了LRRK2 蛋白在散發(fā)性PD 患者腦內(nèi)的潛在致病性升高，而過表達(dá)miR-205 可能為抑制LRRK2 蛋白在PD 中的異常上調(diào)提供一種適用的治療策略，這些結(jié)果表明內(nèi)源性miR-205 是細(xì)胞中LRRK2 蛋白表達(dá)的抑制因子。本研究推測microRNAs 可能負(fù)責(zé)LRRK2 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因?yàn)樗鼈円孕蛄幸蕾嚨姆绞浇Y(jié)合到靶基因3'-UTR 的特定區(qū)域，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步證實(shí)了miR-205 在調(diào)節(jié)LRRK2 表達(dá)中的作用。因此，本研究結(jié)果表明，miR-205 可能是PD 的潛在生物標(biāo)志物，上調(diào)miR-205 水平可能為抑制散發(fā)性PD 中LRRK2 的表達(dá)提供一種可能的治療途徑。但是目前尚不清楚miR-205 在PD 患者大腦中的表達(dá)是如何下調(diào)的。因此進(jìn)一步研究PD 患者腦內(nèi)miR-205 基因位點(diǎn)的DNA 甲基化或其他修飾，可能為闡明散發(fā)性PD 患者miR-205 表達(dá)變化的機(jī)制提供線索。

綜上所述，本研究進(jìn)一步揭示了miR-205 調(diào)控LRRK2 蛋白表達(dá)的新機(jī)制，提示miR-205 可能作為散發(fā)性PD 的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。