于 瀟,李冠喜

(曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,曲阜 273165)

食用菌通常指子實(shí)體碩大、可供食用的大型真菌,一般通稱為蘑菇[ 1]。 目前大約有14 000 種食用菌被成功鑒定,其中10%為大型真菌[ 2]。 約有700 種食用菌可安全食用,且對人體健康有益[ 3]。

食用菌促生細(xì)菌(Mushroom growth-promoting bacteria,MGPB)[ 4]是指通過分泌或者分解某種物質(zhì)對食用菌生長產(chǎn)生促進(jìn)作用的有益細(xì)菌。 最早發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用的促生細(xì)菌為植物根際促生菌(Plant growthpromoting rhizobacteria,PGPR),是生存于植物根際、根表,對植物生長有促進(jìn)或?qū)Σ≡修卓棺饔玫挠幸婕?xì)菌[ 5]。 Frey-Klett 等[ 6]研究發(fā)現(xiàn),在許多環(huán)境中,細(xì)菌和真菌是共存并相互作用的。 細(xì)菌在食用菌的不同發(fā)育階段均起著重要的作用。 Kong 等[ 7]利用宏基因組測序技術(shù)研究了平菇栽培中玉米芯堆肥微生物群落的動(dòng)態(tài)變化及其代謝功能,發(fā)現(xiàn)不同堆肥階段優(yōu)勢菌門不同。 食用菌促生細(xì)菌(MGPB)可以通過分泌生長激素、分解代謝營養(yǎng)菌絲產(chǎn)生的抑制性揮發(fā)物、增溶磷酸鹽、產(chǎn)鐵載體和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶(Acc deaminase)促進(jìn)食用菌的生長[ 8]。 雖然MGPB 對于食用菌的生產(chǎn)十分有利,但是和PGPR 相比,目前用于食用菌栽培的MGPB 的種類和數(shù)量還十分有限[ 4]。 本文就MGPB 對食用菌的促生作用及機(jī)理進(jìn)行綜述,同時(shí)對其應(yīng)用前景進(jìn)行討論和展望,以期為MGPB 更深入的研究提供理論指導(dǎo)。

1 食用菌促生細(xì)菌獲得方法

1.1 細(xì)菌的分離

目前,促生細(xì)菌主要從食用菌子實(shí)體內(nèi)部或食用菌生存環(huán)境中分離。 從食用菌子實(shí)體內(nèi)部分離促生細(xì)菌需先對子實(shí)體表面進(jìn)行消毒,目前使用的消毒方法較多,如Xiang 等[ 9]利用70%乙醇消毒60 s,然后用1.0%次氯酸鈉消毒5 min,70%乙醇消毒30 s,用無菌蒸餾水徹底清洗;Ding 等[ 10]則是先用自來水洗凈,再用70%乙醇浸泡1 min,然后用1%次氯酸鈉處理10 min,再將子實(shí)體用無菌水多次洗滌;還可用0.1%的氯化汞溶液也可代替次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒[ 11]。 之后,取最后一次的洗滌水涂在營養(yǎng)瓊脂平板,適宜溫度下培養(yǎng)3 d 進(jìn)行無菌檢查,采用研磨法、印跡法或組織分離法分離細(xì)菌[ 12]。

從食用菌具體生存環(huán)境中分離促生細(xì)胞需要制作菌懸液,不同研究選用的制作方法不同。 Xing等[ 13]將1 g 樣品懸浮在9 mL 無菌水中,搖瓶培養(yǎng)15 min。 Young 等[ 4]將采集到的土壤與無菌水以1∶1(w∕w)比例浸泡,并在25 ℃下?lián)u瓶培養(yǎng)30 min。 Kumari 等[ 8]則將1 g 土壤混合到2 mL 無菌水中,并適當(dāng)搖動(dòng)。 樣品和無菌水的比例以及搖瓶培養(yǎng)時(shí)間和溫度可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整,如杏鮑菇的適宜溫度為23—25 ℃[ 14],平菇為15—25 ℃[ 15]。 搖瓶培養(yǎng)后涂板培養(yǎng),平板培養(yǎng)基可以是溶菌肉湯培養(yǎng)基(Lysogeny broth,LB)、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(Tryptose soya agar,TSA)、R2A 瓊脂培養(yǎng)基(R2A agar,R2A)[ 16]或營養(yǎng)瓊脂(Nutrient agar,NA)[ 4]等。 之后選取形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行純化并保存。

1.2 促生細(xì)菌作用的測定

可通過平板試驗(yàn),檢測分離出的細(xì)菌是否為促生細(xì)菌。 王琳等[ 17]將平板分為十字對稱的4 個(gè)區(qū)域,真菌菌絲塊置于十字中心,取一定濃度的菌液點(diǎn)涂在十字四條線的中點(diǎn)位置,觀察菌絲在點(diǎn)菌位置與平板上無細(xì)菌區(qū)域的生長差異。 Lim 等[ 18]將刺芹側(cè)耳(Pleurotus eryngii)菌絲塊放在PDA 平板中央后,用菌液在菌絲塊兩側(cè)劃兩條平行直線,以觀察細(xì)菌與真菌共生情況。 Kim 等[ 19]和Rainey[ 20]將培養(yǎng)一定天數(shù)的菌液加入到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中,均勻涂布,并將真菌菌絲塊置于培養(yǎng)基中央進(jìn)行共培養(yǎng),觀察菌絲是覆蓋細(xì)菌菌落還是避開菌落生長。 Suarez 等[ 16]研究發(fā)現(xiàn),共同培養(yǎng)7 d 內(nèi),盧平小單胞菌(Micromonospora lupini)對糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)無促生作用,但21 d 后,糙皮側(cè)耳菌絲繼續(xù)徑向生長,說明細(xì)菌和真菌之間是需要一定時(shí)間來適應(yīng)的,且通常是通過雙方代謝產(chǎn)物以互利互惠而不是消耗彼此菌體。 Vos 等[ 21]研究發(fā)現(xiàn),雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)可以通過降解纖維素為堆肥中的細(xì)菌提供單糖,而細(xì)菌可以為雙孢蘑菇提供維生素等物質(zhì)。 Rangel-Castro 等[ 22]發(fā)現(xiàn),與雞油菌共生的假單胞菌屬細(xì)菌是受益于真菌產(chǎn)生的糖和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì),而不是通過水解真菌細(xì)胞壁來獲得營養(yǎng)。 另外,熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescent)可以為雙孢蘑菇提供生長激素促進(jìn)其生長[ 9]。

判斷1 株細(xì)菌是否是MGPB,還可通過細(xì)菌-菌絲液體共培養(yǎng)的方式進(jìn)行,主要通過比較菌絲重量變化來判斷細(xì)菌的促生效果[ 23]。 值得注意的是,細(xì)菌對食用菌的促生作用不一定表現(xiàn)在促進(jìn)菌絲的生長上。 Young 等[ 4]研究發(fā)現(xiàn),在平皿共培養(yǎng)中對巴氏蘑菇(Agaricus blazei)菌絲生長無積極作用的細(xì)菌,對其出菇反而有促進(jìn)作用。 而Min 等[ 19]也發(fā)現(xiàn)有一種假單胞菌的上清液除了能讓刺芹側(cè)耳菌絲生長速率提高1.6 倍外,還能誘導(dǎo)原基形成。

通過對食用菌促生細(xì)菌16S rDNA 進(jìn)行測序,并結(jié)合細(xì)菌形態(tài)學(xué)等指標(biāo)來確定細(xì)菌的屬或種。 部分已經(jīng)驗(yàn)證的MGPB 及其所作用的食用菌種類見表1。

表1 部分MGPB 及其所作用的食用菌Table1 Part of MGPB and relevant mushroom

2 食用菌促生細(xì)菌的作用機(jī)制

2.1 細(xì)菌頂空化合物

細(xì)菌產(chǎn)生并釋放的揮發(fā)性次生代謝物稱為細(xì)菌頂空化合物[ 16]或細(xì)菌揮發(fā)性化合物[ 30](BVC)。 BVC多種多樣,如脂肪酸衍生物(碳?xì)浠衔?、酮、?、酸、含硫、含氮化合物和萜烯等有機(jī)物,及一氧化氮、硫化氫、氨、氰化氫等無機(jī)物。 Suarez 等[ 16]首次采用雙平板共培養(yǎng)法分析了BVC 對糙皮側(cè)耳菌絲生長的影響,該方法是利用二分格平皿將細(xì)菌與真菌分隔開,一格培養(yǎng)細(xì)菌(用細(xì)菌培養(yǎng)基),一格放入糙皮側(cè)耳菌絲塊(用真菌培養(yǎng)基)。 糙皮側(cè)耳菌絲和細(xì)菌二者之間不接觸,細(xì)菌產(chǎn)生的BVC 可以通過平皿上方的間隙揮發(fā)到糙皮側(cè)耳菌絲處并對其產(chǎn)生影響。

頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[ 31](HS-SPME-GC-MS)可以對BVC 各成分進(jìn)行測定與分析。 楊柳等[ 32]利用該技術(shù),對鷹嘴豆納豆發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分進(jìn)行了檢測。 Gong 等[ 33]發(fā)現(xiàn)黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)產(chǎn)生的揮發(fā)物能夠通過抑制植物病原真菌的生長來促進(jìn)玉米的生長,利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析其揮發(fā)物成分,發(fā)現(xiàn)其中起作用的是二甲基二硫醚(C2H6S2)。

2.2 可溶性化合物

為驗(yàn)證細(xì)菌產(chǎn)生的可溶性化合物對食用菌生長的影響,Suarez 等[ 16]將菌絲塊放在PDA 平板中央,用菌液在菌絲塊兩側(cè)劃兩條平行的直線,培養(yǎng)7 d 后,發(fā)現(xiàn)部分細(xì)菌對菌絲生長起正面影響。 Chen 等[ 27]用不同體積的蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)發(fā)酵液加入到刺芹側(cè)耳菌絲培養(yǎng)的平皿中,發(fā)現(xiàn)不同體積上清均能促進(jìn)其菌絲生長。 Lim 等[ 18]發(fā)現(xiàn)不同濃度細(xì)菌發(fā)酵液對刺芹側(cè)耳菌絲生長有促進(jìn)作用。 Kim 等[ 19]發(fā)現(xiàn),在菌絲滿瓶前加入1 株假單胞菌屬(Pseudomonassp.)細(xì)菌的上清液可以縮短原基的形成時(shí)間。

2.3 酶類物質(zhì)

細(xì)菌對食用菌的促生作用離不開酶的作用,正是因?yàn)樘囟傅幕顒?dòng),MGPB 才表現(xiàn)出解纖維素(為食用菌生長提供碳源)、分解乙烯(減輕其對菌絲生長的抑制)、合成生長激素(促進(jìn)食用菌生長)亦或者是消耗1-辛烯-3-醇等(解除其對食用菌原基形成的抑制)特征。

2.4 細(xì)菌菌體

研究發(fā)現(xiàn),一些細(xì)菌緊密附著在菌絲上以刺激菌絲的生長發(fā)育。 Rainey[ 20]發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌可通過與雙孢蘑菇菌絲接觸的方式來減少其分枝頻率以提高徑向增長速率。 Chen 等[ 34]也發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌是附著在雙孢蘑菇菌絲上的。 Kumari 等[ 8]通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)被1 株谷氨酸桿菌(Glutamicibacter arilaitensis)附著的佛州側(cè)耳(Pleurotus florida)菌絲更厚、更健康。 此外,細(xì)菌菌體還可通過分泌生長素和降解有害物質(zhì)等方式促進(jìn)食用菌的生長發(fā)育。

3 促生長細(xì)菌的關(guān)鍵特征

3.1 解纖維素

食用菌生產(chǎn)用基質(zhì)根據(jù)其成分可分為三類[ 35]。 第一類是原木;第二類是在培養(yǎng)料中添加木屑,制成人造原木;第三類則是除添加木屑外,還添加秸稈[ 36](包括玉米稈、麥稈、稻草等)、麩皮[ 37]、玉米芯[ 38]、棉籽殼[ 37]等富含纖維素的成分。 Michael 等[ 35]認(rèn)為香菇等木腐菌菌絲生長速度取決于其本身對木質(zhì)纖維素的降解能力。 高纖維素酶含量是雙孢蘑菇整個(gè)生殖階段的特征[ 39]。 而纖維素降解菌可以提高秸稈降解效果并縮短降解時(shí)間[ 40]。 Xiang 等[ 9]發(fā)現(xiàn)了1 株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的解淀粉類芽孢桿菌(Paenibacillus amylolyticus),推測其可能通過降解纖維素為雙孢蘑菇提供碳源。 Kasana 等[ 41]提供了一種快速篩選產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的方法,即以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌后,加入革蘭氏碘(Gram’s iodine)溶液代替剛果紅或者十六烷基三甲基溴化銨。 這種方法操作簡單,且安全性和效率更高。

3.2 分解乙烯

在食用菌的栽培過程中會產(chǎn)生乙烯,而乙烯對食用菌子實(shí)體的發(fā)育有抑制作用。 1975 年,Turner等[ 39]用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析發(fā)現(xiàn),乙烯是由菌絲體-堆肥復(fù)合體產(chǎn)生的,而不是由子實(shí)體本身產(chǎn)生的[ 39]。 Wood 等[ 42]和Ohga[ 43]也分別在雙孢蘑菇和香菇的研究中發(fā)現(xiàn),乙烯是在菌絲生長和子實(shí)體發(fā)育階段從基質(zhì)中產(chǎn)生的。 Turner 等[ 39]研究認(rèn)為,在整個(gè)食用菌的生長發(fā)育過程中,從菌絲的生長到子實(shí)體的成熟,乙烯不斷增多。 周巍巍等[ 44]發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇可以在生長發(fā)育過程中產(chǎn)生乙烯,且其乙烯合成途徑可能與高等植物相同。 Chen 等[ 34]研究也證明雙孢蘑菇有與高等植物相似的乙烯合成途徑。 董曉雅等[ 29]研究發(fā)現(xiàn),熒光假單胞菌懸液、乙烯受體抑制劑AgNO3、乙烯合成抑制劑CoCl2可顯著提高食用菌菌絲的生長速度。 Chen 等[ 34]發(fā)現(xiàn)了1 株產(chǎn)ACC 脫氨酶的惡臭假單胞菌,它可以分解ACC 以降低乙烯的濃度,從而促進(jìn)雙孢蘑菇菌絲的生長,誘導(dǎo)原基的形成。

3.3 其他特征

生長激素(IAA)促進(jìn)食用菌的生長,許多細(xì)菌能通過編碼tnaA生成的色氨酸酶將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚[ 30,45]。 有些促生細(xì)菌可以通過解磷作用促進(jìn)食用菌生長[ 46]。 還有些細(xì)菌通過消耗1-辛烯-3-醇(1-octen-3-ol)來促進(jìn)食用菌生長。 而有些細(xì)菌能夠利用并代謝影響食用菌子實(shí)體發(fā)育的物質(zhì)[ 47]。Zarenejad 等[ 48]發(fā)現(xiàn)從覆土中分離的細(xì)菌中有97%的菌株能夠在高濃度的1-辛烯-3-醇揮發(fā)性化合物存在下生長,接種具有這一特性的菌種可使雙孢蘑菇的產(chǎn)量提高14%,這在工業(yè)化生產(chǎn)中具有重要意義。

MGPB 也可以通過產(chǎn)生鐵載體[ 48]、固氮[ 49]或者是抑制霉菌的生長[ 50]來促進(jìn)食用菌的發(fā)育和生長。以上提到的促生特征中有很多也是PGPR 的特征[ 51],其可以為MGPB 的開發(fā)提供思路和切入點(diǎn)。

4 總結(jié)和展望

雖然食用菌工廠化發(fā)展迅猛,但暴露的問題越來越多,如病蟲害日趨加重、農(nóng)殘超標(biāo)、產(chǎn)業(yè)效益下滑等。 蘑菇生長促進(jìn)劑(Mushroom growth promoting,MGP)有兩種形式,即活體制劑和代謝產(chǎn)物制劑[ 5],可用于提高作物產(chǎn)量[ 52]。 活菌制劑因含有活菌體,利于改良作物生活環(huán)境及其本身的微生態(tài)環(huán)境,具有良好的生態(tài)學(xué)意義。 目前,以生物制劑代替化學(xué)制劑促進(jìn)食用菌生長是食用菌種植業(yè)面臨的一個(gè)新的、迫切需要解決的問題[ 8]。

MGPB 具備產(chǎn)纖維素酶、溶解磷酸鹽、產(chǎn)IAA 及ACC 脫氨酶等特征。 MGPB 還可以消耗雙孢蘑菇菌絲產(chǎn)生的但抑制子實(shí)體發(fā)育的1-辛烯-3-醇。 不同MGPB 具有不同的促生特征,未來或許可以將已有的MGPB 菌株改造為無毒無害的高效工程菌株或?qū)ふ业酱偕Ч鼉?yōu)秀的菌株,用于制備更優(yōu)質(zhì)的生物制劑,以改善食用菌品質(zhì),促進(jìn)食用菌行業(yè)健康發(fā)展。